CN110904122A

CN110904122A - 一种苹果抗旱基因MdbHLH130及其应用

Info

Publication number: CN110904122A
Application number: CN201911335389.4A
Authority: CN
Inventors: 赵强; 王永章; 范子豪
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN110904122B

Abstract

本发明公开了一种苹果抗旱基因MdbHLH130及其应用。所述MdbHLH130基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，利用强启动子驱动原理的转基因技术，将MdbHLH130基因的超量表达载体转入植株中，用于抗旱。本发明首次通过植物基因工程技术改善植物抗旱性，获得了一种从苹果中分离克隆出的抗旱相关基因完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用MdbHLH130基因在烟草中超量表达之后的转基因植株抗干旱能力明显提高。

Description

一种苹果抗旱基因MdbHLH130及其应用

技术领域

本发明属于抗旱基因及其应用研究技术领域，具体涉及一种苹果抗旱相关基因MdbHLH130及其应用。

背景技术

干旱可产生和积累活性氧(ROS)，导致膜脂质过氧化、酶功能障碍和蛋白质氧化和聚集。ROS可通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径被清除，参与ROS清除的酶有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)。在严重干旱条件下，光合组分容易受到环境胁迫的干扰，表现在叶绿体稳态失衡、色素复合物分解、光合速率降低或电子传递被抑制。随着干旱加剧，最大的影响是由于光合系统受损导致过量的光吸收、光合磷酸化受抑制、Rubisco活性降低，从而限制核酮糖二磷酸的积累。因此，提高植物的抗旱性是全世界科研工作者亟待解决的问题。

近年来，不少科研工作者从遗传育种或栽培管理等方面做了大量的研究工作。然而，传统的育种方法需要投入大量的时间和精力以获得抗性较强的品种。另外，近年来许多科研工作者研究还发现，施用一些外源调节物质，如多胺、褪黑素、甜菜碱等也能提高植物的抗旱性，但这种情况往往对土壤环境造成或多或少的破坏，一定程度上危害人类的健康。而通过分子生物学和基因工程的手段对植物进行抗旱，具有很好的开发和应用前景。

果树一般种植在北方丘陵山区等土壤环境条件下，栽培方面面临干旱、缺水等胁迫影响。目前，由于果树遗传背景的复杂性，对果树抗逆基因的筛选工作相对滞后；此外，植物抗性性状一般受多基因控制，这又提高了果树抗性研究的难度。因此，亟待研究出能够提高干旱胁迫条件下的抗性，并对于果树的抗性和产量起到关键作用的果树抗逆基因，还可以将这些获得的抗逆基因转化到其他植物中，实现新的应用。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种苹果抗逆基因。该基因是首次从苹果中分离克隆出的抗旱相关基因完整编码区段的DNA片段，并命名为MdbHLH130，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述苹果抗旱基因MdbHLH130的核苷酸序列还可以包括能够表达SEQ IDNO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的第一种应用。即：用于降低干旱状态下植物的电解质渗漏和丙二醛含量。

本发明的第三个目的是提供所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的第二种应用。即：用于降低干旱状态下植物叶片表面的气孔开度。

本发明的第四个目的是提供所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的第三种应用。即：用于维持干旱状态下植物的叶绿素含量水平和光合速率。

本发明的第五个目的是提供所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的第四种应用。即：用于提高干旱状态下植物ROS清除基因的表达和/或应激相关的基因的表达。

本发明涉及的ROS清除相关基因包括：NtSOD、NtPOD和NtCAT。

本发明涉及的应激相关基因包括：NtDREB3、NtERD10C、NtERD10D、NtNCED1、ntela5和NtLTP1。

本发明的第六个目的是提供所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的第五种应用。即：用于提高干旱状态下植物抗氧化酶活性和/或用于降低对氧化应激的敏感性。

本发明涉及的抗氧化酶包括：超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)。

进一步的，本发明所述的植物包括：苹果或者烟草，优选将基因MdbHLH130转入植物中形成转基因植株发挥作用，进一步优选在干旱环境中发挥作用。

本发明的第七个目的是提供所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的第六种应用。即：所述的苹果抗旱基因MdbHLH130在烟草抗干旱中的应用。

本发明的苹果MdbHLH130基因的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取嘎啦苹果组培苗中的总RNA，反转录合成cDNA；

(2)以cDNA为模板，设计特异引物，通过PCR扩增基因MdbHLH130编码区序列，PCR扩增采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，其中，PCR扩增所用引物序列如下：

MdbHLH130正向引物(F)：5'-ATGGAATCAGATCTTCACCAG-3'；

MdbHLH130反向引物(R)：5'-CTGCTGCTTGTTTGAGCAAG-3'；

PCR扩增的反应条件为：98℃变性10s，根据引物的退火温度退火15s，72℃延伸30s/Kb，循环35次，72℃后延伸10min；

(3)PCR产物进行回收、载体连接、转化，测序得到MdbHLH130基因，MdbHLH130基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1236bp，编码411个氨基酸。

本发明首次从苹果中分离到一个bHLH转录因子MdbHLH130，它包含一个高度保守的bHLH结构域。qRT-PCR和pMdbHLH130::GUS分析表明，MdbHLH130明显地受干旱胁迫的诱导。与野生型相比，MdbHLH130过量表转基因苹果愈伤组织对PEG 6000处理表现出更强的抗性，因此，MdbHLH130转基因苹果愈伤组织表现出更强的抗旱性。相比之下，MdbHLH130-Anti(RNAi沉默)转基因愈伤组织对干旱胁迫更为敏感。并且MdbHLH130在烟草中的异位表达提高了烟草对干旱胁迫的耐受性，表现出较高的种子萌发率和存活率，较长的根长，干旱胁迫下气孔开闭程度和叶片失水率低于WT对照。此外，我们发现MdbHLH130转基因植株在干旱胁迫下表现出较低的电解质渗漏、丙二醛含量和活性氧(ROS)积累，提高了抗氧化酶活性，从而上调了一些ROS清除基因和胁迫响应基因的表达。此外，与野生植物相比，转基因植株对氧化胁迫耐受性增强。综上所述，这些结果表明，MdbHLH130通过气孔开闭程度和ROS清除作用等调控机制，对植物的干旱胁迫反应起着积极的调节作用。

本发明利用强启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)驱动原理的转基因技术，将MdbHLH130基因的超量表达载体转入烟草中，从而获得转基因植株。实验证明，超量表达MdbHLH130基因的转基因烟草在干旱胁迫下，死亡率相比于野生型明显降低，说明MdbHLH130基因在植株抗逆中发挥重要作用。

综上所述，本发明通过植物基因工程技术改善植物抗旱性和其他有益生产性状，从嘎啦苹果组培苗中分离克隆出的抗旱相关基因完整编码区段的DNA片段，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后转基因植株抗干旱能力明显提高。

附图说明

图1为本发明MdbHLH130的系统发育树和序列比对。其中，(A)利用MEGA软件对166个拟南芥AtbHLH蛋白和本发明MdbHLH130蛋白之间的bHLH蛋白进行系统进化树分析；(B)苹果中MdbHLH130蛋白结构保守域示意图及已知拟南芥同源bHLH蛋白的同源性比较。

图2为MdbHLH130响应干旱胁迫的表达模式结果示意图。其中，(A)正常和干旱条件下，定量RT-PCR技术检测MdbHLH130表达分析；(B-C)GUS染色和活性测定结果表明MdbHLH130受干旱胁迫诱导。

图3为验证MdbHLH130是核蛋白及其具有转录激活活性的结果。其中(A)为MdbHLH130定位于细胞核结果；(B)为MdbHLH130在酵母细胞中表现出转录活性的结果。

图4为转基因苹果愈伤组织中MdbHLH130的耐逆性测定结果。其中(A)为MdbHLH130在WT、MdbHLH130-ox、MdbHLH130-Anti愈伤组织的转录水平结果图；(B)(C)和(D)为在对照和6％PEG600处理条件下，MdbHLH130-ox、MdbHLH130-Anti苹果愈伤组织表型、鲜重和MDA含量得结果图。

图5为过表达MdbHLH130转基因烟草植株的鉴定。其中，(A)遗传转化载体35S::MdbHLH130的结构示意图；(B)PCR检测MdbHLH130转基因烟草植株；(C)为不同株系中MdbHLH130基因的western杂交验证。

图6为MdbHLH130在三个转基因烟草植株的表达分析。其中，(A)RT-PCR检测MdbHLH130在三个转基因烟草植株的表达分析结果图；(B)为MdbHLH130蛋白积累在三个转基因烟草植株的western结果图基因的western杂交验证。

图7为正常和10％PEG6000条件下，野生型和三个转基因烟草植株的种子萌发实验结果图。

图8为MdbHLH130基因在烟草中过量表达对烟草抗旱性的影响。其中，(A)为烟草在MS培养基上生长7天，选择长势一致的幼苗，转移到含有10％PEG6000的MS培养基上继续培养10天，观察幼苗生长状况；(B)转基因烟草与野生型烟草相比，统计主根长度增；(C)为选择长势一致的野生型和转基因烟草进行干旱处理，干旱处理15天后，观察烟草生长情况；对烟草复水7天后，观察烟草生长情况；(D)、(E)和(F)正常条件和干旱处理烟草，统计植株存活率、电导率和MDA含量的结果图。

图9为正常和干旱胁迫条件下，干旱胁迫对野生型和转基因烟草叶片中叶绿素含量(A)，PN(B)和Fv/Fm(C)影响的结果图。

图10为野生型(WT)和MdbHLH130-OE转基因烟草植株的失水率和气孔孔径的变化。其中，(A)为MdbHLH130-OE烟草超表达系失水率分析；(B)和(C)干旱和ABA处理下MdbHLH130-OE烟草超表达系气孔开放程度的观察和统计。

图11为野生型(WT)和MdbHLH130-OE转基因烟草植株活性氧(ROS)含量和抗氧化酶活性分析。其中，(A)为野生型(WT)和MdbHLH130-OE转基因烟草干旱处理后叶片H2DCFDA染色；(B)H₂O₂含量的测定；(C)、(D)和(E)为野生型(WT)和MdbHLH130-OE转基因烟草干旱处理后植物体内SOD、POD、CAT活性测定。

图12为正常或干旱处理条件下，3个活性氧清除相关基因和6个逆境相关基因在野生型(WT)和MdbHLH130-OE转基因烟草中的表达模式。

图13为野生型(WT)和MdbHLH130-OE超表达系抗氧化胁迫分析。其中，(A)100μM MV(百草枯，Methyl viologen hydrate)处理后，野生型(WT)和MdbHLH130-OE转基因系的表型对比；(B)100μM MV处理后，野生型(WT)和MdbHLH130-OE转基因系的叶绿素含量的测定。

本发明各项指标测试方法如下：

(1)MDA含量测定：方法参照丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法)(购买于南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A003-1)；

(2)电导率的测定：收集处理前后野生型和转基因烟草叶片，浸入25ml去离子水的离心管中，将室温摇动2h，最初的电导率(C1)用电导仪(DSS-307，上海)进行测定。样品在100℃沸水煮lO min，当其冷却至室温测其电导率为C2,相对电导率(C％)的计算公式为100×C1/C2。

(3)叶绿素含量测定：方法参照叶绿素测试盒(比色法)(购买于南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A147-1)；

(4)光合速率相关指标:净光合速率(Pn)采用Li-6400光合仪(Li-CORBiosciences，Lincoln，USA)进行测定。暗适应下最大光化学效率(Fv/Fm)采用FMS-2便携式调制荧光仪(Hansatech)进行测定。

(5)气孔开闭：为了观察干旱胁迫条件下的气孔开闭，将野生型和转基因株系叶片在滤纸上放置4小时。为了研究ABA敏感性，用10μM ABA溶液处理叶片4小时。随后，使用显微镜(Olympus ix71,Tokyo,Japan)对气孔进行拍照。用ImageJ软件统计气孔孔径。

(6)H₂O₂含量：方法参照过氧化氢测定试剂盒(比色法)(购买于南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A064-1)；

(7)抗氧化酶活性的测定：SOD酶活性测定方法参照总超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(羟胺法)(购买于南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A001)；POD酶活性测定方法参照过氧化物酶(POD)测定试剂盒(测植物)(比色法)(购买于南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A084)；CAT酶活性测定方法参照过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(可见光法)(购买于南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A007)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步加以说明，而不会形成对本发明的限制。

实施例1

本发明所述苹果基因MdbHLH130编码序列的克隆是按照以下方法获得的：一、嘎啦苹果组培苗RNA提取(试剂盒法)

1、利用试剂盒法(柱式总RNA提取试剂盒)提取嘎啦组培苗的总RNA，具体方法如下：

(1)称取约1.5g经干旱处理12小时的嘎啦苹果组培苗，在液氮中充分研磨，转入预冷的1.5ml离心管中；

(2)加入1mL Buffer RLT,充分震荡混匀，室温静置5-10分钟；

(3)为充分去除细胞壁残渣、蛋白、脂肪、多糖等，4℃，12000rpm离心10分钟，将上清转移到新的1.5ml离心管中；

(4)分相：

①加0.2mL氯仿，剧烈震荡15-30秒，室温静置2-3分钟；

②离心，4℃，12000rpm，10分钟；

(5)沉淀，并去除多糖：

①取上层水相(大约原体积的50％，约500μL)至一新的1.5ml管中，切勿吸到中间层；

②加0.25mL 70％乙醇，颠倒混匀；

(6)将上步所得溶液加入到已装入吸附柱的收集管中，4℃，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(7)向吸附柱中加入600μL Buffer RW，4℃，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(8)重复步骤7；

(9)4℃，12000rpm，空离2min，倒掉废液；然后将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；

(10)将吸附柱置于一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间位置加入30μLRNase-Free water，室温放置2分钟，4℃，12000rpm离心2分钟，收集RNA溶液，置于-70℃保存。

2、反转录合成cDNA第一链

(1)在0.2ml的PCR离心管中配制表1混合液(其中表3中RNA为步骤1提取获得的)：

表1-混合液

RNA	2μg
		Oligo(dT)Primer(50μM)	1μl
dNTP Mixture(10mM each)	1μl
		RNase free ddH<sub>2</sub>O	Up to 10μl

(2)用枪头轻轻混匀，将PCR离心管放在65℃水浴中放置5min；

(3)在上述PCR离心管中继续配制表2反转录反应液。

表2-反转录反应液

上述变性、退火后反应液	10μl
		5×PrimeScript<sup>TM</sup>Buffer	4μl
RNase Inhibitor(40U/μl)	0.5μl
		PrimeScript<sup>TM</sup> RTase(200U/μl)	1μl
RNase free ddH<sub>2</sub>O	4.5μl
		Total	20μl

(4)PCR反应程序：30℃，10分钟；42℃，60分钟；70℃，15分钟，冰上冷却即可。

3、cDNA全长序列的获得

(1)取0.2mL PCR专用管，依次加入以下成分，如表3所示：

表3-PCR扩增体系

10×PCR buffer(含Mg<sup>2+</sup>)	2.5μl
		dNTP(2.5mM/l)	2.0μl
引物1(10μM/l)	1.0μl
		引物2(10μM/l)	1.0μl
cDNA或基因组DNA模板	1.0μl
		Taq酶	0.2μl
ddH<sub>2</sub>O	Up to 25.0μl

MdbHLH130-F：5-ATGGAATCAGATCTTCACCAG-3′；SEQ ID NO.3所示

MdbHLH130-R：5′-CTGCTGCTTGTTTGAGCAAG-3′；SEQ ID NO.4所示。

(2)PCR反应程序94℃变性10秒、57℃退火15秒、72℃延伸60秒，进行35个循环；72℃充分延伸7分钟。

(3)PCR反应完毕后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳以检测，并将含有目的条带大小的胶回收(根据Takara公司“Agarose Gel DNA Purification Kit”操作)、载体连接(按北京全式金pEASY载体说明书进行)、转化(转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在LB平板培养基上，37℃倒置过夜培养)、序列测定(挑取单菌落，在北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定后，得到MdbHLH130基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其氨基酸序列如SEQID NO.2所示)。

实施例2

用定量实时(qRT)PCR技术检测MdbHLH130在干旱胁迫下的表达模式

(1)以嘎啦苹果为植株材料，经多次继代，选取生长一致的组培苗进行试验处理。干旱处理(将组培苗置于干净的滤纸上,自然脱水)，每种处理3次重复，每次重复10株,分别于干旱处理0、1、3、6及12h时采集叶片,液氮速冻后研磨，提取总RNA，然后反转录成cDNA,置于-80℃冰箱保存备用。

(2)克隆起始密码子ATG上游启动子区(2.0kb)并将其与β-葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因融合，构建pMdbHLH130::GUS融合载体(空载体购于北京全式金生物技术有限公司)，转入农杆菌EHA105，然后遗传转化‘王林’苹果愈伤，将愈伤组织置于干净的滤纸上,自然脱水处理6h，然后GUS染色和活性分析。

结果表明，MdbHLH130的表达水平受到了极大的诱导，在3h时逐渐达到高峰(12.6倍)，然后下降(图2A)。与qRT-PCR分析一致，GUS染色和活性结果表明，pMdbHLH130::GUS转基因苹果愈伤组织的GUS活性高于干旱胁迫下的对照(图2B和C)。这些结果表明MdbHLH130的表达是干旱胁迫诱导的。

实施例3

试验证明MdbHLH130是一种核蛋白，具有转录激活活性

生物信息预测分析表明MdbHLH130蛋白含有核定位的信号肽(predict NLS软件)。为了确定MdbHLH130的亚细胞定位，构建35S::MdbHLH130-GFP(绿色荧光蛋白)重组质粒(空载体购于大连宝生物工程有限公司)，转入农杆菌EHA105。将上述含有目标基因的农杆菌用5ml加相应抗生素的YEP在28℃，200rpm振荡过夜。然后，取500μl的菌液加到50ml的YEP培养基中过夜培养，离心收集菌体。用浸染液悬浮菌体，终浓度为A₆₀₀＝0.5-0.6左右。用1ml去掉针头的注射器，每片本生烟叶片注射150μl左右，2-3天后，在激光扫描共聚焦显微镜(laserscanning confocal microscope，Zeiss 510Meta)下观察目的蛋白的亚细胞定位特征，采集照片。结果表明GFP信号仅在本生烟叶片表皮细胞的细胞核中检测到(图3A)，表明MdbHLH130定位于细胞核。DAPI用于标记细胞核位置。

为了确定MdbHLH130是否具有转录活性，将MdbHLH130编码序列(CDS)连接到酵母表达载体pGBKT7(购买于Clontech公司)中，获到pGBKT7-MdbHLH130重组质粒。然后，将pGBKT7-MdbHLH130+pGADT7(pGADT7购买于Clontech公司)、pGBKT7+pGADT7、阳性对照(pGBKT7-53+pGADT7-T，购买于Clontech公司)和阴性对照(pGBKT7-Lam+pGADT7-T，购买于Clontech公司)分别转化酵母菌株感受Y2H-Gold。不同组合的转化子在SD/-Trp(购买于Clontech公司)培养基上均生长良好。然而，用pGBKT7+pGADT7(空载体)共转化的酵母细胞不能在选择性SD/-Trp/-His/-Ade(购买于Clontech公司)培养基上存活。相反，含有pGBKT7-MdbHLH130+pGADT7组合的酵母细胞在同一培养基上正常生长(图3B)，表明MdbHLH130具有转录激活活性。

实施例4

MdbHLH130转基因苹果愈伤的耐逆性测定

(1)根据MdbHLH130基因的cDNA序列设计特异引物，以皇家嘎啦苹果幼苗总RNA反转录的cDNA做为模板，PCR扩增MdbHLH130全长编码序列和RNAi特异片段PCR产物连接到克隆载体上，测序。

RNAi序列：

TTGCTCAAGGATTTTACCAGCCGTCGTCGAAACCGCCTTTGCCTAATCAGAACTTGAATGAAGGAGCTTATTCAATGGGGGGAAGTCACTTGCCTTCTATGAAAACCAGTGGTGATCTCGCAAATTCCAATCTTATTCGGCATAGTAGCTCGCCTGCTGGATTGTTCTCCAATATGAACATTGATGGCTATGGTACATTGAGAGGAATGGGAAACTTCGGAGCAAGTAATAGCACTAATGAAGAAGCATCTTTTTCTTCTGCGAGCAGGTTGAAAAATTT，见SEQ ID NO.5。

(2)利用Gateway方法将测序正确的目的基因连接到植物过量表达载体PRI(购买于大连宝生物工程有限公司)上，获得35S::MdbHLH130和35S::MdbHLH130-Anti重组质粒。将构建好的表达载体转化农杆菌感受态EHA105。

(3)无菌水重悬农杆菌菌体，使终浓度OD600＝0.5-0.6；将‘王林’苹果愈伤移入上述悬浮液中震荡10分钟左右后，用无菌滤纸吸去表面菌液；将上述愈伤平铺到筛选培养基上(MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L 2,4-D+250mg/L头孢霉素+30mg/L卡那霉素)，获得转基因愈伤。

(4)提取筛选出来的抗性愈伤组织总RNA，反转录成cDNA,qRT-PCR分析表明，MdbHLH130的转录水平在过量表达系(MdbHLH130-ox)中明显地高于野生型(WT)，而在沉默表达系(MdbHLH130-Anti)中显著地降低(图4A)，表明获得了MdbHLH130过量表达和基因沉默转基因苹果愈伤组织。

(5)经多次继代，将生长状态一致的野生型(WT)、MdbHLH130-ox以及MdbHLH130-Anti的转基因‘王林’苹果愈伤组织平铺到愈伤继代培养基或者含有6％PEG6000的愈伤继代培养基上处理20天，观察拍照。结果表明正常条件下，野生型(WT)、MdbHLH130-ox和MdbHLH130-Anti转基因愈伤组织生长速率没有明显差异；6％PEG6000处理条件下，MdbHLH130-ox愈伤组织的生长速率明显地快于野生型(WT)，而MdbHLH130-Anti转基因愈伤组织的表型相反(图4B和C)；与表型一致，MdbHLH130-ox转基因愈伤组织中的丙二醛含量低于野生型(WT)，而MdbHLH130-Anti转基因愈伤组织中的丙二醛含量增加(图4D)。综上所述，MdbHLH130增强了转基因苹果愈伤组织对干旱的耐受性(6％PEG6000模拟干旱胁迫)。

实施例5

MdbHLH130在烟草中的过表达增强了烟草的抗旱性

1.转基因烟草的获得

(1)将烟草种子，用2.6％次氯酸钠消毒5-10分钟(多次上下摇动)，灭菌水冲洗4-5次，吸干水。播种于1/2MS培养基上，光培养(23-25℃，16h长日照/8h短日照，10-14d),至叶片完全展开。

(2)预培养：剪下叶片，剪成小块(0.5×0.5cm)，用灭菌的手术刀将叶片切成圆盘,叶片向光面向上摆放于预培养培养基上，倒置黑暗培养2d。

(3)挑取农杆菌单菌落接种于5mL YEP液体培养基(含25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)中，28℃、200rpm，振荡培养至OD600＝06-0.8；取其中lmL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600＝06-0.8。离心收集菌体，用1/2MS液体培养基悬浮稀释15倍，备用；

(4)将经预培养的烟草叶片浸入菌液5-10分钟，期间多次摇动；然后用无菌滤纸吸干多余菌液，转移至共培养基上，28℃暗培养2-3天。

(5)共培养后的烟草叶用含羧苄青霉素(250mg/L)的无菌水洗涤3-5次，用灭菌滤纸吸干后，移至分化培养基上培养(23-25℃，16h长日照/8h短日照)。每隔15天更换一次培养基。

(6)待芽长至1cm左右时，切下，部分继续继代培养，部分移入生根培养基上进行生根。然后移入盛有基质的营养钵中炼苗，温室常规管理。

烟草预培养、共培养培养基：MS+6-BA(3.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)；

烟草分化培养基：MS+6-BA(3.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+Kana(100mg/L)+Cb(250mg/L)；

烟草生根培养基：1/2MS+IAA(0.1mg/L)。

注：材料消毒处理、侵染、接种等都在超净工作台上进行。

(7)PCR和Western Blotting结果分析表明共获得8个独立的转基因株系(图5A-C)。选取三个具有代表性的T3代纯合系(L1、L2和L3)作为后续研究的材料，半定量RT-PCR和Western Blotting结果表明，三个转基因株系具有较高的MdbHLH130表达水平和蛋白积累(图6A和B)。

2.MdbHLH130过量表达烟草株系的抗旱性鉴定

(1)渗透胁迫分析：将同一时间段收获的具有相同萌发活力的野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)烟草种子，用上述方法进行种子消毒，然后用无菌牙签点播在MS或者MS+10％PEG6000的固体培养基上，在20℃、16h/光照，8h/黑暗条件下培养，每天统计种子萌发率。结果表明：在MS培养基上，MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因株和野生型(WT)具有相似的发芽率(图7)。然而，添加10％PEG6000显著抑制所有烟草种子的发芽率，但对MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因植株的发芽率明显地高于野生型(WT)(图7)。为了进一步评价MdbHLH130-OE转基因烟草植株的渗透胁迫能力，将根长一致的野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)烟草幼苗放置到MS或者MS+10％PEG6000的固体培养基上，8天后拍照和统计根长。如图8A和B所示，10％PEG6000处理条件下MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株(3.7to 4.6cm)的根长显著长于WT(3.1cm)转基因植株。

(2)干旱胁迫分析：将35d大的野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株正常饶水5天，然后开始控水进行干旱胁迫(即不浇水)。结果表明：干旱处理15天后，MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株少部分叶片出现萎蔫，而野生型(WT)几乎全部的叶片萎蔫严重(图8C)；恢复浇水7天后，而MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株的存活率为45-63％明显高于野生型(WT)11％的存活率(图8D)。

与表型相似，MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)过表达烟草植株中相对电导率和丙二醛明显地低于野生型(WT)(图8E和F)，表明在烟草中过量表达MdbHLH130减少了干旱胁迫的损伤并保持了细胞膜的完整性。

此外，干旱处理后野生型(WT)(0.22mg/g FW)的叶绿素含量低于MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株(0.37-0.53mg/g FW)(图9A)。与叶绿素含量一致，干旱胁迫下野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株的光合速率(PN和Fv/Fm)均降低，但MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株的PN和Fv/Fm值高于野生型(WT)(图9B和C)。

再者，干旱胁迫处理后野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株的失水率和气孔开闭也有明显的不同。如图10A所示，干旱处理条件下MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株叶片的失水速率比野生型(WT)植株的失水速率慢得多。与这些结果一致，MdbHLH130-OE转基因烟草植株对干旱和ABA处理(叶片放入10μM ABA溶液中处理4h)敏感，气孔闭合程度大于野生型(WT)(图10B和C)。这些结果表明，MdbHLH130的抗旱性提高至少部分归因于其关闭气孔和减少蒸腾作用的能力。

总之，这些结果表明MdbHLH130在植物对干旱胁迫的反应中起着正调控作用。

实施例6

干旱胁迫条件下，活性氧(ROS)的积累和抗氧化酶活性的分析

将35d大的野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株正常饶水5天，然后开始控水进行干旱胁迫15天。MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株中，电导率较低和MDA含量较少，表明它们可能比野生型(WT)有更强的活性氧(ROS)清除能力。对干旱处理后野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株活性氧(ROS)积累进行2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)荧光染色(根据荧光的强弱)以及对过氧化氢(H₂O₂)积累进行分析。

结果表明，干旱处理后野生型(WT)植株的叶片荧光强度比MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株更弱；与荧光染色结果一致，过氧化氢(H₂O₂)含量在MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株中明显低于野生型(WT)(图11A和B)。

抗氧化酶活性对植物细胞里ROS的清除和积累起着非常重要的作用。因此，对正常和干旱处理条件下，野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株的三种重要抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD，过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD)的活性进行分析。

测定结果显示，在正常条件下，野生型(WT)与MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株间酶活性差异是不显著的(图11C-E)。干旱胁迫后，MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株中三种酶活性均比野生型(WT)高，与图11A和B中活性氧积累相一致。所有结果表明,MdbHLH130-OE转基因烟草植株抗旱性增强与其清除活性氧能力强有关。

实施例7

干旱胁迫下MdbHLH130对ROS清除相关基因和胁迫应答基因的表达分析

为了进一步了解MdbHLH130提高转基因烟草植株抗旱的分子机制，本发明对正常和干旱处理后野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株3个活性氧清除和6个逆境相关基因的表达模式进行了分析。

干旱胁迫处理过程：将35d大的野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株正常饶水5天，然后开始控水进行干旱胁迫15天。

参照RNA plant plus Reagent试剂盒(天根)的说明书提取正常和干旱处理后野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株的总RNA，依据反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time，TaKaRa)的步骤进行反转录成cDNA，用于后续的荧光定量RT-PCR的模板。以UltraSYBR Mixture(TaKaRa)为荧光染料，反应体系(20μl)：2×UltraSYBR Mixture 10.0μl，F引物(10mmol/l)1.0μl，R引物(10μmol/l)1.0μL，cDNA1.0μl，ddH2O 7.0μl。每个模板3次生物学重复。置于荧光PCR仪ABI7500，PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃延伸34s，40次循环。以Ntactin为内参基因，采用2^–ΔΔCT法进行定量数据分析。

采用RT-PCR检测在正常和干旱处理后ROS清除相关基因(NtSOD、NtPOD和NtCAT)和逆境相关基因(NtDREB3、NtERD10C、NtERD10D、NtNCED1、NtLEA5和NtLTP1)在野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株的表达情况。如图12所示，在正常条件下，WT和MdbHLH130-ox转基因植株的ROS清除相关基因和逆境相关基因的mRNA丰度没有明显地差异；在干旱条件下，与野生型(WT)相比，MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株的这些基因的转录水平明显提高了(图12)。这些数据表明，MdbHLH130可能通过上调ROS清除相关基因和逆境相关基因的转录水平，提高了烟草的抗旱性。

实施例8

MdHLH130调节转基因烟草的抗氧化胁迫的能力

从前面活性氧染色和抗氧化酶活测定数据可推测，在烟草中过量表达MdbHLH130可能比野生型(WT)具有较高的抗氧化胁迫的能力。为了验证此结论设计了下面的实验。MV(甲基紫精，Methyl viologen)是一种氧化胁迫物质，可以用于氧化胁迫处理。

取野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株的同一叶位叶片，打取叶圆片后，置于含0和100μmol/l MV的溶液中，抽真空30s，光下放置24h，观察叶圆片颜色变化并拍照。随后，将叶圆片浸入10ml 80％丙酮的试管中，室温条件下避光放置10h，至叶片颜色完全褪去，用紫外分光光度计测定663nm和645nm的光吸收值,计算叶绿素含量。结果如图13A和B所示，0μmol/l MV处理野生型(WT)和MdbHLH130-OE(L1、L2和L3)转基因烟草植株24h后，所有叶圆片维持绿色，并且叶绿素含量差别不显著。100μmol/l MV处理24h后，所有叶圆片表现出不同程度的失绿，但转MdbHLH130烟草叶圆片失绿程度较轻，叶绿素含量明显高于理野生型(WT)。以上结果表明MdbHLH130过表达提高了烟草抵抗MV诱导的氧化胁迫能力。

综上，MdbHLH130基因在烟草中抗逆性功能验证结果充分说明了MdbHLH130基因是一个抗旱相关的基因，该基因的过量表达可以提高植株的抗旱能力。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种苹果抗旱基因MdbHLH130及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1236

<212> DNA

<213> 苹果(Malus domestica)

<400> 1

atggaatcag atcttcacca gcatcatgac aaaccccagc agcatatgaa ctctagcttg 60

acgcgctacc ggtcagctcc cagctcatat ttcacaaaca ttttggactc agagctttgt 120

gagcccttgt tcaatcggcc ttctagccct gaaaccgaga ggattttctc ccggtttctg 180

gctagtgaag gtggtggtaa tggaggagga ggtggtggtg gaggaacaga agaaattgta 240

tcacaacaca aagttgaaac acagattaat aatcagcaac cacaatttat ggtgcctaag 300

gttgatgatg aagtgggggt gattcagcag cagcagagca atttgaacaa ctattcatct 360

gttgctcaag gattttacca gccgtcgtcg aaaccgcctt tgcctaatca gaacttgaat 420

gaaggagctt attcaatggg gggaagtcac ttgccttcta tgaaaaccag tggtgatctc 480

gcaaattcca atcttattcg gcatagtagc tcgcctgctg gattgttctc caatatgaac 540

attgatggct atggtacatt gagaggaatg ggaaacttcg gagcaagtaa tagcactaat 600

gaagaagcat ctttttcttc tgcgagcagg ttgaaaaatt tctcttcagg gccaccatct 660

acatcggggc taatgagtcc gatttctgaa attgggaaca aaagaatgcg atcgaatagt 720

caagatgctc gaggttttgg ggatggccgt ggtaacaatt atgtgactgg tttcccaatg 780

gattcatggg atgactctgc gattttgggt gatgatacag gctttaggga tgatgatgtg 840

aaagcataca ctggtttaag tccatctgaa actcaggatg tggagaccgg aaatcatcct 900

cctacacttc tagctcatca cttgagcttg ccaaaaacat ccgcggagat ggctgccatt 960

gaaaagtttt tacagttcca agattctgtt ccttgtaaga ttcgagcaaa gcggggctgc 1020

gccacacacc caagaagcat tgctgagagg gtgagaagaa cccgaattag tgaacgaatg 1080

aggaaactgc aagagcttgt accaaacatg gacaagcaag cacacacttc cgacatgttg 1140

gatttggctg ttgagtacat taaagacctt caaactcaag tccagacgct ctccgaaaat 1200

cgtgccaagt gtacttgctc aaacaagcag cagtag 1236

<210> 2

<211> 411

<212> PRT

<213> 苹果(Malus domestica)

<400> 2

Met Glu Ser Asp Leu His Gln His His Asp Lys Pro Gln Gln His Met

1 5 10 15

Asn Ser Ser Leu Thr Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Ser Ser Tyr Phe Thr

20 25 30

Asn Ile Leu Asp Ser Glu Leu Cys Glu Pro Leu Phe Asn Arg Pro Ser

35 40 45

Ser Pro Glu Thr Glu Arg Ile Phe Ser Arg Phe Leu Ala Ser Glu Gly

50 55 60

Gly Gly Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Glu Glu Ile Val

65 70 75 80

Ser Gln His Lys Val Glu Thr Gln Ile Asn Asn Gln Gln Pro Gln Phe

85 90 95

Met Val Pro Lys Val Asp Asp Glu Val Gly Val Ile Gln Gln Gln Gln

100 105 110

Ser Asn Leu Asn Asn Tyr Ser Ser Val Ala Gln Gly Phe Tyr Gln Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Pro Pro Leu Pro Asn Gln Asn Leu Asn Glu Gly Ala Tyr

130 135 140

Ser Met Gly Gly Ser His Leu Pro Ser Met Lys Thr Ser Gly Asp Leu

145 150 155 160

Ala Asn Ser Asn Leu Ile Arg His Ser Ser Ser Pro Ala Gly Leu Phe

165 170 175

Ser Asn Met Asn Ile Asp Gly Tyr Gly Thr Leu Arg Gly Met Gly Asn

180 185 190

Phe Gly Ala Ser Asn Ser Thr Asn Glu Glu Ala Ser Phe Ser Ser Ala

195 200 205

Ser Arg Leu Lys Asn Phe Ser Ser Gly Pro Pro Ser Thr Ser Gly Leu

210 215 220

Met Ser Pro Ile Ser Glu Ile Gly Asn Lys Arg Met Arg Ser Asn Ser

225 230 235 240

Gln Asp Ala Arg Gly Phe Gly Asp Gly Arg Gly Asn Asn Tyr Val Thr

245 250 255

Gly Phe Pro Met Asp Ser Trp Asp Asp Ser Ala Ile Leu Gly Asp Asp

260 265 270

Thr Gly Phe Arg Asp Asp Asp Val Lys Ala Tyr Thr Gly Leu Ser Pro

275 280 285

Ser Glu Thr Gln Asp Val Glu Thr Gly Asn His Pro Pro Thr Leu Leu

290 295 300

Ala His His Leu Ser Leu Pro Lys Thr Ser Ala Glu Met Ala Ala Ile

305 310 315 320

Glu Lys Phe Leu Gln Phe Gln Asp Ser Val Pro Cys Lys Ile Arg Ala

325 330 335

Lys Arg Gly Cys Ala Thr His Pro Arg Ser Ile Ala Glu Arg Val Arg

340 345 350

Arg Thr Arg Ile Ser Glu Arg Met Arg Lys Leu Gln Glu Leu Val Pro

355 360 365

Asn Met Asp Lys Gln Ala His Thr Ser Asp Met Leu Asp Leu Ala Val

370 375 380

Glu Tyr Ile Lys Asp Leu Gln Thr Gln Val Gln Thr Leu Ser Glu Asn

385 390 395 400

Arg Ala Lys Cys Thr Cys Ser Asn Lys Gln Gln

405 410

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaatcag atcttcacca g 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgctgcttg tttgagcaag 20

<210> 5

<211> 280

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgctcaagg attttaccag ccgtcgtcga aaccgccttt gcctaatcag aacttgaatg 60

aaggagctta ttcaatgggg ggaagtcact tgccttctat gaaaaccagt ggtgatctcg 120

caaattccaa tcttattcgg catagtagct cgcctgctgg attgttctcc aatatgaaca 180

ttgatggcta tggtacattg agaggaatgg gaaacttcgg agcaagtaat agcactaatg 240

aagaagcatc tttttcttct gcgagcaggt tgaaaaattt 280

Claims

1.一种苹果抗旱基因MdbHLH130，其特征在于，所述苹果抗旱基因MdbHLH130的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的苹果抗旱基因MdbHLH130，其特征在于，所述MdbHLH130的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的苹果抗旱基因MdbHLH130，其特征在于，所述苹果抗旱基因MdbHLH130的核苷酸序列包括能够表达SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

4.权利要求1-3任一项所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的应用，其特征在于，用于降低干旱状态下植物的电解质渗漏和丙二醛含量。

5.权利要求1-3任一项所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的应用，其特征在于，用于降低干旱状态下植物叶片表面的气孔开度。

6.权利要求1-3任一项所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的应用，其特征在于，用于维持干旱状态下植物的叶绿素含量水平和光合速率。

7.权利要求1-3任一项所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的应用，其特征在于，用于提高干旱状态下植物ROS清除基因的表达和/或应激相关的基因的表达。

8.权利要求1-3任一项所述的苹果抗旱基因MdbHLH130的应用，其特征在于，用于提高干旱状态下植物抗氧化酶活性和/或用于降低对氧化应激的敏感性。

9.权利要求4-8任一项所述的应用，其特征在于，所述的植物包括：苹果或者烟草，优选将基因MdbHLH130转入植物中形成转基因植株发挥作用。

10.权利要求1-3任一项所述的苹果抗旱基因MdbHLH130在烟草抗干旱中的应用。