CN110734482B - 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实LrWRKY4基因具有提高植物抗真菌的功能，将本发明抗真菌LrWRKY4基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草具有很强的抗真菌活性，实验结果显示超表达LrWRKY4的转基因烟草对稻黑孢霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌的侵染具有很高水平的抗性。

Description

一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4及应用。

背景技术

植物在生长发育中会受到多种非生物或生物胁迫，非生物胁迫包括干旱、水涝、盐渍、营养元素的缺乏、低温、辐射等，生物胁迫包括真菌、细菌、病毒、线虫或寄生性种子植物等。在生物胁迫中，真菌引起的植物病害数量最多，占70%以上，严重危害植物的生长及其经济价值。真菌生命力顽强，许多病原真菌可形成特殊的组织或孢子越冬，终年存在危害性。真菌易传播，田间主要通过气流、水流传播；此外，风、雨、昆虫也可传播真菌病害。真菌可直接侵入寄主表皮，有时导致某些寄生性弱的细菌再侵入，或与其他病原物进行复合侵染，使植物病症加重。由于化学防治具有谱广性、快速高效、使用方法简便，不受地域限制和季节限制，便于大面积机械化防治等优点，成为农作物病害防治的主要手段。但长期使用容易引起人、畜中毒，环境污染，可使某些真菌产生不同程度的抗药性。培育抗病品种是经济有效的防治方法，传统的育种方法也存在时间长，耗资大等问题。随着重组DNA技术的创立和发展，利用基因工程技术来最终培育出抗真菌植物新品种，为从根本上解决真菌病害问题开辟了新途径。

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子。WRKY转录因子是植物最大的转录因子家族之一，WRKY 转录因子是一类DNA 结合蛋白，主要存在于植物中，参与植物的多种生理过程，涉及生长发育和自我应激信号传导或与不同的基因和转录因子交叉调节（张凡，尹俊龙等. WRKY转录因子的研究进展. 生物技术通报，2018，34(1):40-48）。它之所以被命名为‘WRKY’，是因为该家族成员的蛋白质序列都至少含有一个长约60个氨基酸的保守结构域，且几乎每个结构域的N末端都含有一段高度保守的‘WRKYGQK’七肽序列，因此简称为WRKY （Eulgem T, Rushton PJ, Robatzek S, et al.The WRKY superfamily of plant transcription factors. Trends Plant Sci, 2000,5(5):199-206）。WRKY蛋白可与其靶基因的启动子中的W-box（TGACC（A / T））结合，并激活或抑制靶基因的表达。此外，WRKY蛋白可与其他转录因子相互作用调节植物的防御反应（Jiang J, Ma S, Ye N, et al. WRKY transcription factors in plant responses tostresses. J Integr Plant Biol, 2017, 59(2):86-101）。因此，WRKY 转录因子不管是在植物响应生物胁迫中，还是非生物胁迫中都具有重要的作用。

睡茄（Withania somnifera）WsWRKY1定位于细胞核，利用病毒诱导的WsWRKY1基因沉默导致睡茄中的植物甾醇（phytosterols）和睡茄素（withanolides）含量减少，并降低了睡茄对丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的耐受性，而在烟草中WsWRKY1的过表达提高了对生物胁迫的抗性（Singh AK, Kumar SR, Dwivedi V, et al. A WRKYtranscription factor from Withania somnifera regulates triterpenoidwithanolide accumulation and biotic stress tolerance through modulation ofphytosterol and defense pathways. New Phytolog, 2017, 215:1115-1131）。鹰嘴豆（Cicer arietinum）的促分裂原活化蛋白激酶9（MPK9）的磷酸化作用可保护CaWRKY40免遭降解，CaWRKY40在鹰嘴豆中过表达，通过正调控防御相关基因的表达提高了对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染的抗性（Chakraborty J, Ghosh P, Sen S, et al. CaMPK9increases the stability of CaWRKY40 transcription factor which triggersdefense response in chickpea upon Fusarium oxysporum f. sp. ciceri Race1infection. Plant Mol Biol, 2019, 100:411-431）。亚麻（Linum usitatissimum）的WRKY36转录因子通过结合在LuPLR1启动子中的W盒，在脱落酸和尖孢镰刀菌激发的木脂素生物合成的调节中发挥重要作用（Markulin L, Corbin C, Renouard S, et al.Characterization of LuWRKY36, a flax transcription factor promotingsecoisolariciresinol biosynthesis in response to Fusarium oxysporum elicitorsin Linum usitatissimum L. hairy roots. Planta, 2019, 250:347-366）。从野生葡萄（Vitis davidii）中克隆WRKY53转录因子基因在拟南芥中过表达，与非转基因拟南芥相比，转基因植株显示出对白腐病菌Coniella diplodiella、丁香假单胞菌和白粉病菌Golovinomyces cichoracearum的抗性增强（Zhang Y, Yao JL, Feng H, et al.Identification of the defense-related gene VdWRKY53 from the wild grapevineVitis davidii using RNA sequencing and ectopic expression analysis inArabidopsis. Hereditas, 2019, 156:14-28）。

还有一些植物的WRKY转录因子具有负调节作用。辣椒(Capsicum annuum) 的WRKY40b转录因子在烟草叶片中瞬时过表达时，带有绿色荧光蛋白标签的CaWRKY40b定位于细胞核。病毒诱导的CaWRKY40b基因沉默大大降低了辣椒对青枯病菌Ralstonia solanacearum的敏感性，在辣椒叶片中CaWRKY40b的瞬时过表达下调了包括CaWRKY40在内的防御基因，表明CaWRKY40b在辣椒抗青枯菌中发挥负调控作用（Muhammad IK, YangwenZ, Zhiqin L, et al. CaWRKY40b in pepper acts as a negative regulator inresponse to Ralstonia solanacearum by directly modulating defense genesincluding CaWRKY40. Int J Mol Sci, 2018, 19:1403-1420）。利用基因编辑技术分别获得了BnWRKY11和BnWRKY70突变的欧洲油菜（Brassica napus）植株，与非转基因植物相比，BnWRKY70突变体对核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抗性增强，而BnWRKY11突变体对核盘菌的抗性没有显着差异。另外，与非转基因植物相比，过表达BnWRKY70的植物显示出对核盘菌敏感性的增加，BnWRKY70可能是负调控菌核病抗性的调节因子（Sun Q, Lin L, LiuD, et al. CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing of the BnWRKY11 and BnWRKY70 genes in Brassica napus L. Int J Mol Sci, 2018, 19:2716-2735）。油菜BnWRKY15和BnWRKY33结合同一W-box，BnWRKY15在油菜中的过表达同时增加油菜对核盘菌的敏感性，并下调了BnWRKY33在核盘菌侵染过程中的表达水平，可见BnWRKY15抑制BnWRKY33的转录（Liu F, Li X, Wang M. Interactions of WRKY15 and WRKY33transcription factors and their roles in the resistance of oilseed rape toSclerotinia infection. Plant Biotech J, 2018, 16: 911-925）。

岷江百合（Lilium regale Wilson）产于我国四川岷江流域，生长在海拔800-2500米的山坡岩石边上或河旁。岷江百合的鳞茎可药用、蒸食或提取淀粉食用，具有较高的营养价值。除了自身的观赏价值外，还被公认为是百合属中抗病性很高的野生种。在种球繁殖及鲜切花生产过程中，百合易受到真菌、病毒、细菌等多种病原菌的危害。目前发现的百合病害达几十种之多，由镰刀属(Fusarium spp.)真菌，尤其是尖孢镰刀菌（F. oxysporum）引起的枯萎病(又称为基腐病、茎腐病)是百合生产中危害最严重的病害。镰刀菌侵染百合种球后引起基盘坏死、鳞片腐烂脱落，造成种球质量下降；植株感染镰刀菌后叶片变黄、萎蔫下垂，植株提早枯萎死亡，严重影响百合切花的产量和品质。WRKYs参与应答多种生物和非生物胁迫，是植物防御系统的重要组成部分。从高抗尖孢镰刀菌的岷江百合中分离抗病相关的WRKY转录因子基因，并通过基因工程技术将其应用于改良植物的抗性，不仅有助于深入认识岷江百合的抗病分子机制，还能促进对岷江百合珍稀基因资源的利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4及应用，即在提高烟草对稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）、禾谷镰刀菌（F. graminearum）、轮枝镰刀菌（F. verticillioides）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、茄腐镰刀菌（F. solani）抗性中的应用。

本发明从岷江百合中克隆获得的具有抗真菌活性的岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4的全长基因，LrWRKY4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因全长为1138 bp，包含一个993 bp的开放阅读框、68 bp的5′非翻译区(untranslated region, UTR)及77 bp的3′UTR，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明分离克隆岷江百合的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础；发明人将这个基因命名为LrWRKY4。

本发明所述WRKY转录因子基因LrWRKY4的编码区是序列表SEQ ID NO:1中第69-1061位所示的核苷酸序列。

本发明将岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4应用在提高烟草对稻黑孢霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌的抗性中，具体操作如下：

(1)采用扩增LrWRKY4的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR)扩增出LrWRKY4的全长编码区，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

(2)用限制性内切酶XbaI和EcoRI酶切pGEM-T-LrWRKY4载体和植物表达载体pCAMBIA2300S，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段；再将所获得LrWRKY4基因片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体；之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

(3)重组载体T-DNA上具有卡那霉素抗性基因，用添加卡那霉素的分化培养基筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株对于植物病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自岷江百合的LrWRKY4转录因子能增强植物对几种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产农作物、园艺植物、药用植物、经济林木等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中部分LrWRKY4转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；阳性对照：质粒pGEM-T-LrWRKY4为模板的PCR反应；WT：非转基因烟草(野生型)总DNA为模板进行的PCR；

图2是本发明中部分阳性LrWRKY4转基因烟草中LrWRKY4转录水平的表达结果图，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；WT：非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；阳性对照：质粒pGEM-T-LrWRKY4为模板的PCR产物；

图3是本发明中LrWRKY4转基因烟草离体叶片抗真菌活性的抑菌效果图；其中a、b、c、d、e图示中接种的病原真菌分别是稻黑孢霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌；WT为野生型烟草，即非转基因烟草，1、5、6、18为LrWRKY4转基因烟草。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：LrWRKY4全长基因克隆以及序列分析

用尖孢镰刀菌接种百合的根，用接种后24 h的根提取总RNA，用液氮将处理过的百合的根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA；采用M-MLV逆转录酶(promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5μg Total RNA，依次加入50 ng oligo (dT)、2 μL dNTP Mix (2.5mM each)，用DEPC水将反应体积补齐至14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNasin (200U)、1 μL M-MLV (200U)，混匀并简短离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应；cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因LrWRKY4，所用上下游引物序列分别为5’CCCTCTCATCTCTCCATCTTCCT3’及5’ATCCACTGCTCCATTTATAGCCTAC3’。采用Advantage^TM 2PCR Enzyme (Clontech)扩增出目的基因。PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，32个循环；72℃ 7min。反应体系(20 μL)为1 μL cDNA、2 μL 10×Advantage 2PCR Buffer、1.8 μL dNTP Mix (10mM each)、0.2 μL 正向引物(10 μM)、0.2 μL 反向引物(10 μM)、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μL PCR-Grade water。PCR结束后，取10μL进行琼脂糖凝胶电泳，用以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pGEM-T vector kit（Promega），反应体系和操作过程为：取1.5μL PCR产物，依次加入1μLpGEM-T vector（50 ng/μL）和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16 ℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中。使用含有氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LrWRKY4的特异引物鉴定出多克隆位点插入LrWRKY4的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的LrWRKY4全长cDNA为1138 bp，通过NCBI ORF finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个993 bp的开放读码框（见序列表），LrWRKY4编码一个含330个氨基酸的蛋白质LrWRKY4，其分子量约为36.8 KDa，等电点约为6.32。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入LrWRKY4的大肠杆菌质粒pGEM-T-LrWRKY4以及植物表达载体pCAMBIA2300S的质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶XbaI和EcoRI分别对质粒pGEM-T-LrWRKY4和pCAMBIA2300S进行双酶切(100 μL体系)，反应体系和操作过程为：分别取20μLpGEM-T-LrWRKY4和pCAMBIA2300S质粒、依次加入10μL 10×M buffer、5μL XbaI、5 μLEcoRI、60 μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用试剂盒对LrWRKY4片段和pCAMBIA2300S载体大片段分别进行胶回收，取1μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的LrWRKY4DNA片段和pCAMBIA2300S载体片段连接起来，反应体系(20 μL)和操作过程为：取10μL LrWRKY4DNA片段依次加入2μLpCAMBIA2300S载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μLddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增LrWRKY4的特异引物进行PCR，挑选出LrWRKY4与pCAMBIA2300S成功连接的克隆，在得到的阳性菌株中加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌DH5α中的pCAMBIA2300S-LrWRKY4质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-LrWRKY4转入所制备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取0.2μg pCAMBIA2300S-LrWRKY4，质粒加入含有200μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，再冰浴2 min，之后加入500μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增LrWRKY4的特异性引物进行PCR反应，检测pCAMBIA2300S-LrWRKY4是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(Nicotiana tabacum)，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1 %的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2MS培养基上，28℃暗培养5-8d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16h/d光照），以后每月用1/2MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-LrWRKY4质粒的农杆菌LBA4404菌种，取20μL接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h；随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养5-8 h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗叶片切成1 cm²左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染时间为15 min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/Lsucrose+6 g/L琼脂，22℃无光条件下共培养2天。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L sucrose+6 g/L琼脂+50 mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素（cefotaxime sodium salt，Cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1 μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增LrWRKY4的特异引物进行PCR，PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，LrWRKY4转基因烟草共筛选到43株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中LrWRKY4的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

取阳性转基因植株叶片以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增LrWRKY4的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因单株中LrWRKY4转录水平的表达，总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同，PCR结束之后，取8μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到38个转基因单株中LrWRKY4在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～38。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基（200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20g/L葡萄糖）上活化，28℃暗培养。以温室栽培的LrWRKY4转基因烟草和野生型烟草为材料，用砂纸在叶片上轻轻摩擦出同等规格的伤口，接上大小相等的新鲜真菌菌丝块，然后用保鲜膜包裹叶片保持湿度。气候培养箱内培养一段时间后，收集接种叶片，观察LrWRKY4转基因烟草叶片和野生型烟草叶片受几种病原真菌侵染的发病情况，结果如图3所示，野生型烟草在分别接种稻黑孢霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌后，叶片的发病症状明显，出现了大面积的病斑。然而，LrWRKY4转基因烟草叶片在接种后发病的程度很轻微，只出现了小面积的黄化，表明LrWRKY4转基因烟草对稻黑孢霉、禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌具有高水平的抗性。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1138

<212> DNA

<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)

<400> 1

aaaacaagaa gaccaaaccc ttccccctct ccataaccct ctcatctctc catcttcctc 60

catcatccat gtcaggtgag aagaaggagc tcttcaactt caacctccat gaaagcctat 120

tcagcgaccg tggattcgcc ttcaatgacg atctatcctc catcttctct caaagaccca 180

ccttccagca agatctgaac catctcgatc ctctgccgtt gccgaagatg aacttcaccg 240

actacttaca tggatctgca gactacagtt ctcttgcaca gggattcgat ctctcatgct 300

cgcagccgat ggatgtgttc ggaaccaaag cggaggagaa gtctctaact gacatggtgg 360

tagagagtat tgttagtgga aacaatatgg gtggttctgg tagtggaggt ggaggtgctg 420

ggactccgat cactgccaac tcttcggtct cctcgtcgtc ctgcgaggcc gctggcgaag 480

aggattcgaa gccggaggag gaggtgcaga agcagaagca gcctgaaggg ggtgatgacg 540

ggggagacaa ttctaagaaa gtgaacaaac cgaggaagaa aggagagaag aggcaaaggg 600

agccgcgctt tgccttcttg acaaaaagcg aggtggatca tctcgaagat gggtatagat 660

ggaggaagta tgggcaaaag gctgtcaaga acagtcctca tccaaggagc tactatcggt 720

gcacaacgca gaaatgctca gtgaagaagc gtgtggagag atcattcgaa gatccgacga 780

tagtgatcac aacgtatgaa ggccagcaca accatcacag tccctccacc actcgcgggg 840

gctcgcatat gctcgcacct ccacctccag ctcagtcgtt cttccgccaa gacctactga 900

tgcaccatct ccacccacta aacaacaatg gccaacaaag ggagatgaac cccaacatgt 960

accttcaagc cctatcatcc cccctccagc agctccaact ccgagactac gggctcctac 1020

aagacatcat tccttccttt attaataaca atcagtcatg attgtacatg agatgagttg 1080

tatgactatg tttctatgaa cttaacttgt aggctataaa tggagcagtg gattttat 1138

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)

<400> 2

Met Ser Gly Glu Lys Lys Glu Leu Phe Asn Phe Asn Leu His Glu Ser

1 5 10 15

Leu Phe Ser Asp Arg Gly Phe Ala Phe Asn Asp Asp Leu Ser Ser Ile

20 25 30

Phe Ser Gln Arg Pro Thr Phe Gln Gln Asp Leu Asn His Leu Asp Pro

35 40 45

Leu Pro Leu Pro Lys Met Asn Phe Thr Asp Tyr Leu His Gly Ser Ala

50 55 60

Asp Tyr Ser Ser Leu Ala Gln Gly Phe Asp Leu Ser Cys Ser Gln Pro

65 70 75 80

Met Asp Val Phe Gly Thr Lys Ala Glu Glu Lys Ser Leu Thr Asp Met

85 90 95

Val Val Glu Ser Ile Val Ser Gly Asn Asn Met Gly Gly Ser Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ala Gly Thr Pro Ile Thr Ala Asn Ser Ser Val Ser

115 120 125

Ser Ser Ser Cys Glu Ala Ala Gly Glu Glu Asp Ser Lys Pro Glu Glu

130 135 140

Glu Val Gln Lys Gln Lys Gln Pro Glu Gly Gly Asp Asp Gly Gly Asp

145 150 155 160

Asn Ser Lys Lys Val Asn Lys Pro Arg Lys Lys Gly Glu Lys Arg Gln

165 170 175

Arg Glu Pro Arg Phe Ala Phe Leu Thr Lys Ser Glu Val Asp His Leu

180 185 190

Glu Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Ala Val Lys Asn

195 200 205

Ser Pro His Pro Arg Ser Tyr Tyr Arg Cys Thr Thr Gln Lys Cys Ser

210 215 220

Val Lys Lys Arg Val Glu Arg Ser Phe Glu Asp Pro Thr Ile Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Tyr Glu Gly Gln His Asn His His Ser Pro Ser Thr Thr Arg

245 250 255

Gly Gly Ser His Met Leu Ala Pro Pro Pro Pro Ala Gln Ser Phe Phe

260 265 270

Arg Gln Asp Leu Leu Met His His Leu His Pro Leu Asn Asn Asn Gly

275 280 285

Gln Gln Arg Glu Met Asn Pro Asn Met Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Ser

290 295 300

Pro Leu Gln Gln Leu Gln Leu Arg Asp Tyr Gly Leu Leu Gln Asp Ile

305 310 315 320

Ile Pro Ser Phe Ile Asn Asn Asn Gln Ser

325 330

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ccctctcatc tctccatctt cct 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

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Claims (1)

1. 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4在提高烟草对稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）、茄腐镰刀菌（Fusarium solani）抗性中的应用，岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY4的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

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