CN111808870A

CN111808870A - 一种水稻MeRING29基因、编码蛋白和重组载体及应用

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Publication number: CN111808870A
Application number: CN202010783749.3A
Authority: CN
Inventors: 付坚; 王波; 程在全; 陈越; 陈玲; 钟巧芳; 王玲仙; 柯学; 张敦宇; 肖素勤; 蒋聪; 殷富有
Original assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN111808870B

Abstract

本发明提供了一种水稻MeRING29基因、编码蛋白和重组载体及应用，涉及基因工程技术领域。本发明首次克隆了云南疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)MeRING29基因的全长cDNA序列，丰富了植物抗病基因库，对于进一步研究水稻抗病分子机制及其应用具有重要价值。本发明还提供所述MeRING29基因的编码氨基酸序列以及包含该基因的重组载体和应用，尤其涉及在提高水稻抗病性方面的应用。转入MeRING29基因的水稻植株，对于白叶枯病和稻瘟病有了显著的提高。

Description

一种水稻MeRING29基因、编码蛋白和重组载体及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻MeRING29基因、编码蛋白和重组载体及应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半以上人口以稻米为主粮。随着世界人口的不断增长，对粮食的需求量也越来越大，预计到2030年我国稻米消费比现在将会增长20％以上。近年来随着超级稻品种的大量培育与推广，水稻产量再创新高。但是问题也随之而来，在水稻新品种选育过程中，因定向选择过滤掉了大量潜在优良基因，造成了现代栽培种遗传基础狭窄，缺乏对病虫害及各种非生物胁迫的抗性或耐性。白叶枯病菌和稻瘟病是我国水稻生产中危害面积和危害程度最严重的病害，已成为了水稻稳产高产的严重障碍。

稻瘟病是我国水稻栽培中危害最为严重的真菌病害，病原称灰梨孢、稻梨孢(Pyricularia grisea(Cooke)Sacc)，属半知菌亚门真菌。稻瘟病几乎贯穿水稻的整个生育期，从苗瘟、叶瘟到大田的节瘟、穗颈瘟、谷粒瘟和叶枕瘟，严重危害水稻的正常生长，严重时可造成40％～50％的减产，甚至颗粒无收。

白叶枯病菌是由革兰氏阴性菌黄单孢水稻变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)引起的细菌性病害是严重的全球性水稻病害之一。该病害也严重影响了我国水稻的高产、稳产，在发病较重的年份和地区该病可使水稻减产50％甚至绝收。

大量使用化学药物防治水稻病害可能导致环境破坏，实践证明，采用基因工程与常规育种相结合的方法，利用植物自身所携带抗性基因培育和推广抗病品种是防治和控制病害最经济、有效、环保的方法。但是禾本科作物种类多，病害类型也多，抗病机理复杂，至今有许多问题还未研究清楚，再者由于病源菌生理小种变异频繁，新的抗性品种在使用几年后抗性下降或消失，因此，需要不断挖掘和利用抗病基因资源。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种泛素连接酶的RING亚型编码基因MeRING29基因、编码蛋白和重组载体及其应用，克服了水稻抗多种病害备选基因的不足，将其应用到水稻中，可显著提高水稻抗病性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种泛素连接酶的RING亚型编码基因MeRING29基因，所述MeRING29基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述MeRING29基因来源于云南疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)。

本发明还提供了一种由上述MeRING29基因编码得到的MeRING29蛋白，所述MeRING29蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种包含上述MeRING29基因的重组载体，所述重组载体以pCAMBIA2301为基础载体，所述MeRING29基因插入所述基础载体的Nco I和Bgl II多克隆位点之间。

本发明还提供了上述MeRING29基因或上述重组载体在调控水稻对细菌和真菌病害的抗性中的应用。

本发明还提供了上述MeRING29基因或上述重组载体在提高水稻对细菌和真菌病害的抗性中的应用。

本发明还提供了上述MeRING29基因或上述重组载体在培育抗病水稻植株中的应用。

优选的，所述抗病包括抗白叶枯病和稻瘟病。

本发明还提供了一种培育抗病水稻植株的方法，包括以下步骤：(1)将上述MeRING29基因连接到pCAMBIA2301载体的Nco I和Bgl II多克隆位点之间，得重组载体；

(2)将所述重组载体转入水稻愈伤组织；

(3)筛选转化水稻愈伤组织中表达所述MeRING29基因的阳性愈伤组织，对所述阳性愈伤组织进行组织培养，得转基因抗病水稻植株。

优选的，步骤(3)所述筛选包括将所述转化愈伤组织置于筛选培养基中进行培养，长出新愈伤组织的为所述阳性愈伤组织；所述的筛选培养基以MS为基本培养基，还包括：蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2,4-D2.0mg/L、头孢拉定250mg/L和潮霉素50mg/L，pH＝5.8。

本发明首次克隆了云南疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)MeRING29基因的全长cDNA序列，丰富了植物抗病基因库，对于进一步研究水稻抗病分子机制及其应用具有重要价值。

本发明提供了MeRING29基因的应用，尤其是在提高水稻抗病性方面的应用。在本发明实施例中，对转入了MeRING29基因并过表达的水稻植株进行抗病性检测，对抵御白叶枯病菌和稻瘟病菌的伤害有了显著的提高。本发明培育出抗病植物的方法也简便、有效，为提高水稻抗病尤其是抗水稻细菌和真菌病害提供了新的有效选择，具有好的应用前景。

附图说明

图1为MeRING29基因结构图，具有RING保守结构域；

图2为MeRING29基因受白叶枯病菌胁迫后的表达图；

图3为水杨酸处理后MeRING29基因的表达图；

图4为茉莉酸处理后MeRING29基因的表达图；

图5为云南疣粒野生稻成株期不同组织中MeRING29基因的表达图；

图6为转MeRING29基因水稻植株的PCR检测。

具体实施方式

本发明所述MeRING29基因来源于云南疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)，其cDNA全长2133bp(SEQ ID No.12)，包括1320bp的CDS部分(SEQ ID No.1)。本发明所述MeRING29基因优选通过转录组测序筛选到一个注释为拟南芥泛素连接酶编码基因片段并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)上进行Blast比对分析，得到与水稻基因同源性达到91.5％的基因序列(SEQ ID No.3所示)，再根据这段筛选到的序列，通过RACE的方法获得本发明SEQ ID No.1所示的基因；更优选的，根据SEQ ID No.3所示的核苷酸序列设计特异引物对RING-GSP1和RING-GSP2，然后经PCR从云南疣粒野生稻中扩增出SEQ ID No.1所示核苷酸序列，其中RING-GSP1:5’-GCGAGGGAGTGGCCGGTGGAGTGC-3’(SEQ ID NO.4)，RING-GSP2:5’-CGAGGAGGACGAGGAGGAGCGGAGGAAG-3’(SEQ ID NO.5)。

本发明还提供了一种由上述MeRING29基因编码得到的MeRING29蛋白，所述MeRING29蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述MeRING29蛋白内共包含439个氨基酸残基，分子量为4.74KDa，理化等电点为8.47；且MeRING29蛋白由20种氨基酸构成，其中丙氨酸所占比例最高，达到13.21％，其次为精氨酸占10.25％；MeRING29蛋白具有一个跨膜结构域和RING结构域，符合RING基因家族的一般结构特征。

本发明对所述重组载体的构建方法并没有特殊限定，优选根据MeRING29的cDNA全长序列设计包含完整开放阅读框(ORF)的引物，所述引物包括上游引物MeRING29-OF(SEQID No.8)和下游引物MeRING29-OR(SEQ ID No.9)，以MeRING29-OF和MeRING29-OR为引物对MeRING29的cDNA全长序列进行PCR扩增、胶回收，用Nco I和Bgl II内切酶同时对PCR扩增产物和载体pCAMBIA2301进行消化，连接，获得过表达MeRING29基因的表达载体pCAMBIA2301-MeRING29。

本发明还提供了上述MeRING29基因或上述重组载体在调控水稻对细菌和真菌病害的抗性中的应用。本发明所述细菌和真菌病害优选包括白叶枯病和稻瘟病。本发明所述调控优选为上调，在表达MeRING29基因的转基因抗病水稻植株中，其对于白叶枯病和稻瘟病的抗性显著提高。

本发明还提供了上述MeRING29基因或上述重组载体在培育抗病水稻植株中的应用。本发明所述抗病优选包括抗白叶枯病和稻瘟病。

本发明还提供了一种培育抗病水稻植株的方法，包括以下步骤：(1)将上述述MeRING29基因连接到pCAMBIA2301载体的Nco I和Bgl II多克隆位点之间，得重组载体；

(2)将所述重组载体转入水稻愈伤组织；

本发明对所述重组载体的构建方法优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明优选将所述重组载体转化EHA101根癌农杆菌感受态，所述转化优选为电转化。本发明将转化后的根癌农杆菌转入水稻愈伤组织中，所述水稻愈伤组织优选为去壳幼胚培养得到的愈伤组织。本发明所述转入优选为将所述愈伤组织浸泡在转化后的根癌农杆菌的菌液中。

本发明步骤(3)所述筛选优选包括将所述转化愈伤组织置于筛选培养基中进行培养，长出新愈伤组织的为所述阳性愈伤组织；所述的筛选培养基以MS为基本培养基，还包括：蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2,4-D2.0mg/L、头孢拉定250mg/L和潮霉素50mg/L，pH＝5.8。

下面结合实施例对本发明提供的泛素连接酶RING亚型编码基因MeRING29基因、编码蛋白和重组载体及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

各实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，所用农杆菌(Agrobacterium tumefactions)采用EHA105菌株，大肠杆菌(E.coli)采用DH5α菌株，菌株均购自北京全式金生物技术有限公司。表达载体pCAMBIA2301购自于Clontech公司。其余化学试剂均为市售分析纯。

实施例1

MeRING29基因的克隆

云南疣粒野生稻由北京百迈客生物技术有限公司进行转录组测序，筛选到一个注释为拟南芥泛素连接酶编码基因片段并在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)上进行Blast比对分析，得到与水稻基因同源性达到91.5％的基因序列(SEQ ID No.3所示)，再根据这段筛选到的序列，通过RACE的方法(见北京聚合美生物科技有限公司所公开的试剂盒操作手册)获得本发明所述提高水稻抗病性的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。根据SEQ ID No.3所示核苷酸序列设计特异引物，RING-GSP1:5’-GCGAGGGAGTGGCCGGTGGAGTGC-3’(SEQ ID No.4)，RING-GSP2:5’-CGAGGAGGACGAGGAGGAGCGGAGGAAG-3’(SEQ ID No.5)，然后经PCR从云南疣粒野生稻中扩增出SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

MeRING29基因cDNA扩增所用其他引物的序列为：

通用5AP(SEQ ID No.10)：5’-GGTCTCAAGGGCTCTAAACATTT-3’，通用3AP(SEQ IDNo.11)：5’-GTTTTCCCAGTCACGACAC-3’。

(1)MeRING29基因第一链cDNA的合成

用HIPER^TM Reverse Transcriptase酶，对已提取的云南疣粒野生稻的总RNA进行MeRING29基因第一链cDNA的合成。

①5'-RACE用的第一链cDNA的合成：在200μL的PCR离心管中依次加入1μg的总RNA5μL，10mM dNTP Mix 3μL，HIPER^TM 3RRT1 1μL，无RNA酶和DNA酶去的离子水7μL，总体积为16μL，吸打混匀并瞬时离心，70℃孵育5min，立即冰浴5min，瞬时离心使溶液收集于PCR反应管管底，再向PCR管中继续添加下列组分：5×HIPER^TM First-Strand Buffer 5μL，HIPER^TMReverse Transcriptase 1μL，RNase Inhibitor 1μL，HIPER^TM SolutionⅠ 0.5μL，HIPER^TMSolutionⅡ0.5μL，此时总体积为24μL，在42℃的PCR仪上孵育30min后，加入HIPER^TM 5RRT 1μL，并吸打混匀，42℃继续孵育1h，既得5'-RACE用的第一链cDNA。

②3'-RACE用的第一链cDNA的合成：在200μL的PCR管中依次加入1μg的总RNA 5μL，10mM dNTP Mix 3μL，HIPER^TM 3RRT2 1μL，无RNA酶和DNA酶去的离子水7μL，总体积为17μL，吸打混匀并瞬时离心，70℃孵育5min，立即冰浴5min，瞬时离心使溶液收集于PCR反应管管底，再向PCR管中继续添加下列组分：5×HIPER^TM First-Strand Buffer 5μL，HIPER^TMReverse Transcriptase 1μL，RNase Inhibitor 1μL，HIPER^TM SolutionⅠ0.5μL，HIPER^TMSolutionⅡ0.5μL，此时总体积为24μL，在42℃的PCR仪上孵育90min后，70℃孵育10min，将PCR管置于冰上终止cDNA合成，既得3'-RACE用的第一链cDNA。

(2)MeRING29基因cDNA末端快速扩增合成：分别将0.5μL已经合成的5'-RACE用的第一链cDNA和3'-RACE用的第一链cDNA加入到200μL的PCR管中，再依次加入10×HIPER^TMHot Start Buffer 2.5μL，2.5mM dNTP Mix 2.5μL，基因特异引物RING-GSP1和RING-GSP2(均10μM)各0.1μL，试剂盒中的锚定引物5AP和3AP(均10μM)各0.1μL，HIPER^TM Hot StartDNA polymerase 0.5μL，PCR-Grade Water 19.1μL，总反应体积25μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，40个循环；72℃终延伸10min。

(3)将(2)中PCR产物进行琼脂糖凝胶(1.2％)电泳，用胶回收试剂盒(宝日生物科技有限公司，北京)对目的条带进行切胶回收。回收纯化后的PCR产物，克隆到pMD18-T载体上(TaKaRa)，挑取阳性克隆，送测序，得到有效的目的片段，即为MeRING29基因cDNA完整序列。MeRING29基因cDNA全长2133bp(SEQ ID No.12)，包括1320bp的CDS部分(SEQ ID No.1)，编码439个氨基酸残基(SEQ ID No.2)，分子量为4.74KDa，理化等电点为8.47。经Bioedit软件分析MeRING29基因的氨基酸组成比例，结果显示MeRING29蛋白由20种氨基酸构成，其中丙氨酸所占比例最高，达到13.21％，其次为精氨酸占10.25％。采用SMART在线预测分析软件(http://smart.embl-heidelberg.de/smart)对MeRING29蛋白结构域预测，预测显示该蛋白具有一个跨膜结构域和RING结构域，如图1，符合RING基因家族的一般结构特征。

实施例2

MeRING29基因的功能分析

(1)白叶枯病菌和外源激素处理云南疣粒野生稻

用NA培养基活化白叶枯病病原菌Y8，Y8为云南强致病生理小种，由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供，28℃暗培养3d，先用5mL无菌水洗下菌苔，再继续加无菌水直至OD₆₀₀＝0.6，配置好的菌液用于接种孕穗期的云南疣粒野生稻叶片。在温室温度升至28℃时用剪刀蘸取配置好的菌液剪去生长正常无明显伤口的云南疣粒野生稻叶片顶端1.0cm作为侵染处理，对照组用无菌水代替菌液进行接种，接菌组和对照组后分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h量取样，取样后立即把样品放入液氮中速冻，并放-80℃冰箱中保存备用。用水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)处理叶片，分布采用10nmol/LSA和100μmol/LJA对云南疣粒野生稻叶片喷洒，直至叶片完全湿润，以无菌蒸馏水做对照，分别于处理后的0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h收集样品，液氮速冻后放入-80℃冰箱保存备用。

(2)样品采集

用灭菌的剪刀将云南疣粒野生稻成株期根、茎、叶、花药、柱头和种子组织剪下，用锡箔纸快速包好，液氮速冻，保存于-80℃冰箱备用。

(3)总RNA的提取、定量及检测

分别取(1)和(2)中处理和采集的样品100mg采用E.Z.N.A.Plant RNA Kit(美国OMEGA公司)试剂盒提取总RNA，操作方法按公司提供的试剂盒说明书进行。抽提完后，取0.5μL总RNA用Nanodrop2000分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)测定总RNA浓度，并用OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值确认RNA纯度。取3μL总RNA在1％琼脂糖凝胶上分离总RNA，检测总RNA的完整性。

(3)MeRING29基因表达谱

取不同处理样品的1μg总RNA做反转录合成cDNA第一链，具体方法按照PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司)说明书操作。根据MeRING29的cDNA序列设计qRT-PCR扩增引物，以水稻β-Actin基因作为内参基因，按照

Premix Ex Taq^TM II试剂盒(宝生物工程大连有限公司)进行Realtime PCR(qRT-PCR)扩增，分析MeRING29基因在云南疣粒野生稻受多种处理后不同时期的表达情况。

MeRING29的cDNA序列上游引物MeRING29-QF的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.6所示：5’-CCACCATGAAGTACGCCGAG-3’，MeRING29的cDNA序列下游引物MeRING29-QR的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.7所示：5’-GGTGGTGTCCTTGTTAGGGT-3’。

①白叶枯病菌胁迫下MeRING29基因的表达变化。分别以白叶枯病菌Y8接种云南疣粒野生稻0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h后，对MeRING29基因的表达量进行测定，所得到的MeRING29基因在各个时间点的表达量如图2所示，MeRING29基因在白叶枯病菌胁迫8h表达量快速升高为0h的6.5倍，随着胁迫时间的增长表达量也随着增加，24h达到表达量的最高峰为0h的13.5倍，之后有所降低，72h时为0h的7.1倍，说明MeRING29与云南疣粒野生稻抗白叶枯病有重要的关联。

②水杨酸处理后MeRING29基因的表达变化，以10nmol/L水杨酸处理云南疣粒野生稻0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h后，对MeRING29基因的表达量进行测定，所得到的MeRING29基因在各个时间点的表达量如图3所示，MeRING29基因在处理2h时表达量达到第一个峰值，为对照的12.5倍，在8h表达量达到第二个峰值，为对照的18.9倍，之后表达量降低，在72h时表达量又提高到了5.07倍，说明MeRING29基因受水杨酸诱导表达。

③茉莉酸处理后MeRING29基因的表达变化，以100μmol/L茉莉酸处理云南疣粒野生稻0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h后，对MeRING29基因的表达量进行测定，所得到的MeRING29基因在各个时间点的表达量如图4所示，MeRING29基因在处理2h开始表达，8h时表达量升高到对照的5.9倍，处理12h时表达量达到最高峰，与对照组相比提高了7.8倍，之后表达量逐渐降低，72h回落到对照的1.4倍，表明MeRING29基因受茉莉酸诱导表达。

④云南疣粒野生稻成株期不同组织中MeRING29基因的表达变化如图5所示，在根、茎、叶、柱头、花药、种子几个组织中MeRING29基因在叶中的表达量最高，其次是茎中，在种子、柱头和花药中表达较低，其中花药中最低，说明MeRING29基因的表达具有组织特异性，只在茎叶中特异表达，在生殖器官中几乎不表达。

实施例3

MeRING29基因在增强水稻对白叶枯病抗性中的应用

(1)过表达MeRING29基因的表达载体构建

根据MeRING29的cDNA全长序列设计包含完整开放阅读框(ORF)的引物，设计时在MeRING29的ORF序列上游引物MeRING29-OF中加入限制性内切酶NcoI的酶切位点，序列如表中SEQ ID NO.8所示：5’-CCCATGGATGCCGACGCCTCGCCGCCAC-3’，MeRING29的ORF序列下游引物MeRING29-OR中加入限制性内切酶BglⅡ的酶切位点序列如表中SEQ ID NO.9所示：5’-GAAGATCTTTCAAACTTGCCGAGCGATTG-3’，以MeRING29-OF和MeRING29-OR为引物对MeRING29的cDNA全长序列进行常规PCR扩增、胶回收，用NcoI和BglⅡ的内切酶同时对PCR扩增产物和载体pCAMBIA2301进行消化，连接，获得过表达MeRING29基因的表达载体pCAMBIA2301-MeRING29。

(2)转化农杆菌

取-80℃保存的EHA101根癌农杆菌感受态，置冰上融解。取1μL pCAMBIA2301-MeRING29的质粒加入到100μL感受态中，混匀，加入到内径为1cm的电击杯中，220V电压，电击转化，电击完成加入900μL的液体YEP培养基到电击杯中，混匀后转移至1.5mL离心管中，28℃，200rpm摇床培养4h，菌液涂布在含50μg/mL卡那霉素(Kan)和100μg/mL利福平(Rif)平板上，28℃培养至形成单菌落。

(3)阳性克隆的鉴定与保存

挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/mL Kan和100μg/mL Rif的液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养16h，取1μL菌液进行PCR检测，检测引物为MeRING29-OF和MeRING29-OR。取检测结果为阳性的菌液，混合30％甘油，置于离心管中，于-80℃超低温冰箱中保存，备用。

(4)农杆菌介导的水稻遗传转化

①水稻愈伤的诱导和继代

取栽培稻日本晴幼胚去壳后用75％乙醇消毒30sec，无菌蒸馏水洗涤2～3次后，用15％的NaClO水溶液并加入一滴吐温20灭菌20min，消毒完之后用无菌蒸馏水漂洗5～6次，从无菌蒸馏水中取出幼胚置于无菌滤纸上吸干水分，然后接种于愈伤诱导培养基上，每皿20～30粒。28℃恒温培养箱暗培养两周后，将长出来的愈伤组织切下接到继代培养基上，继代一周以后用于农杆菌的转化。所述的诱导培养基的配方是：MS+蔗糖30g/L+2,4-D3.0mg/L+KT0.4mg/L，pH＝5.8；所述的继代培养基的配方是：MS+蔗糖30g/L+2,4-D2.0mg/L+KT0.4mg/L，pH＝5.8。

②含目的MeRING29基因的表达载体pCAMBIA2301-MeRING29的农杆菌悬浮菌液的制备

取出保存于-80℃的含有目的MeRING29基因的表达载体pCAMBIA2301-MeRING29的根癌农杆菌重组菌株EHA101，划线接种于添加了50μg/ml Kan和25μg/ml Rif的LB平板上，在28℃下倒置暗培养2～3d。从平板上挑取单菌落，接种于30ml添加了50μg/ml Kan和25μg/ml Rif的YEP液体培养基中，28℃，180rpm震荡培养16～20h进行活化。活化后得到含目的MeRING29基因的表达载体pCAMBIA2301-MeRING29的农杆菌悬浮菌液(以下简称：悬浮菌液)，用于浸泡栽培稻日本晴的愈伤组织。

③水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

将继代的质量较好的栽培稻日本晴愈伤组织切割成直径2～5mm的小块并转入共培养培养基，然后将悬浮菌液注入共培养培养基直至使每个愈伤组织都能被菌液充分浸泡，1min后将多余菌液吸出，28℃恒温培养箱暗培养2～3d。所述的共培养基的配方是：MS+蔗糖30g/L+2，4-D2.0mg/L+乙酰丁香酮(As)20mg/L，pH＝5.2。

④抗性水稻愈伤组织的筛选

首先将共培养的愈伤组织用加有250mg/L头孢拉定的无菌蒸馏水清洗5～6次，每次2～3min，再用MS液体培养基+500mg/L头孢拉定震荡清洗并过夜，重复2～3次，直至洗液清澈。将愈伤组织置于无菌滤纸上，在超净台将其吹干。吹干的愈伤组织转入筛选培养基，28℃暗培养两周，一些褐化的愈伤组织边缘长出乳白色的新的抗性愈伤组织，将这些新长出的愈伤组织转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选15～20d，之后继续生长的乳黄色质地紧密的愈伤组织即为抗性愈伤。所述的筛选培养基的配方是：MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+2,4-D 2.0mg/L+头孢拉定250mg/L+潮霉素50mg/L，pH＝5.8。

⑤抗性水稻愈伤组织的分化、生根及炼苗

从筛选培养基上挑选抗性愈伤组织转至分化培养基上，置于28℃，16h/d的光照培养箱中培养，经过10～15d有绿点出现，20～40d进一步分化出小苗。

待幼苗在分化培养基长至2～3cm后，将其转入生根培养基，置于28℃，16h/d的光照培养箱中培养，待幼苗根系比较发达苗高约10cm时进行炼苗。

将已长出根的幼苗根部的培养基清洗干净后放入大试管(30mm×180mm)中，加入自来水，放在光照培养架上，每2～3d换一次水。在室内炼苗7～8d后移栽至温室土壤环境条件下，每2d浇一次水，水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活(以吐水为准)即得到转基因再生植株。

所述的分化培养基的配方是：MS+蔗糖30g/L+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT1.5mg/L+头孢拉定150mg/L，pH＝5.8。所述的生根培养基的配方是：1/2MS+蔗糖15g/L+NAA0.5mg/L，pH＝5.8。

(5)转基因再生植株的分子生物学检测

待步骤(4)所获得的转基因再生植株生长旺盛时，取其嫩叶，提取叶片中的DNA。DNA的提取采用AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒(美国AXYGEN公司)按照说明书进行提取。

以提取的水稻总DNA为模板，非转基因植株为阴性对照(NC)，MeRING29基因的表达载体pCAMBIA2301-MeRING29为阳性对照(C)，以MeRING29-OF和MeRING29-OR为引物，进行PCR检测。检测结果如图6所示，其中标记为S1、S2、S3、S4、S7、S8、S9、S10的泳道处存在与阳性对照相同大小的基因片段，表明这几株再生植株为阳性转基因植株。

(6)转MeRING29基因再生植株抗白叶枯病的抗性测试

白叶枯病菌株Y8在NA培养基上28℃培养2～3d，配制成OD₆₀₀处值为0.6的菌液。在孕穗期使用剪叶法对PCR鉴定的阳性转基因植株接种白叶枯病菌Y8生理小种，以同期栽培的非转基因日本晴为对照(共接种10株)，每株剪5片完全伸展的叶子的叶尖1cm。接种15d后，当病斑长度明显且稳定时调查病情，分别测量每片叶片的病斑长度，并统计每株植株病斑长度的平均值，根据方中达提出的抗性分级标准进行如下分级：0级(I)，病斑长度0～0.2cm；1级(HR)，病斑长度0.2～1.5cm；3级(MR)，病斑长度1.5～3.0cm；5级(MS)，病斑长度3.0～5.0cm；7级(S)，病斑长度5.0～10.0cm；9级(HS)，病斑长度大于10.0cm。

实验结果表明，转MeRING29基因水稻植株对白叶枯病菌的抗性较非转基因植株有显著提升，表明本发明基因MeRING29为抗白叶枯病的新基因，数据统计如表1。

表1转MeRING29基因水稻植株抗白叶枯病的抗病性鉴定

实施例4

MeRING29基因在增强对水稻稻瘟病抗性中的应用

本实施例中过表达MeRING29基因的转基因水稻的获得与实施例3相同，不同之处在于以下步骤。

(1)稻瘟病菌孢子悬浮液的制备

取出保存的单孢菌株在PDA固体斜面培养基上28℃活化培养3d，挑取3小块菌丝接种于新配制的番茄燕麦培养基上，28℃培养4～8d，待菌丝生长的面积扩展到培养皿的大部分并且菌丝体的颜色呈现淡绿色时，在无菌条件下，挑取小拇指指甲大小的绿色菌丝体，放入装有100mLPDA液体培养基的250mL三角瓶中，三角瓶中事先加入了10颗灭菌处理的3mm的玻璃珠，28℃振荡4～5d进行扩大培养，吸取300μL扩大培养的菌液涂布于番茄燕麦培养基上，28℃培养4～8d，待培养基内菌体颜色大部分呈现淡绿色，每个培养皿内加入5L无菌水，用玻片轻轻刮下灰绿色孢子，用三层纱布过滤，得到孢子悬浮液，在显微镜下观察孢子的数量，调节孢子悬浮液达到1×10⁵个/mL，然后加入0.025％吐温，放在冰盒上备用。

(2)接种

水稻不同生育期对稻瘟病的抗性表现也不同，秧苗四叶期、分蘖期和抽穗期易感病，圆秆期发病轻，此实验选取四叶期的水稻秧苗进行抗病实验，分别选取健康的非转基因水稻植株和转MeRING29基因植株10株，设置3组重复，用配置好的孢子悬浮液进行喷雾接种，接种后立即在26～28℃下黑暗保湿(湿度95％)24小时，令孢子萌发侵染，然后移至25～30℃，湿度＞95％的高湿环境下培育，8～10d后观察染病情况，统计感病株数、感病率。

(3)发病级别统计结果见表2，实验结果表明，与非转基因水稻相比较，转MeRING29基因水稻植株基本都表现出对稻瘟病的抗性。

表2转MeRING29基因水稻植株抗稻瘟病的抗病性鉴定

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 一种水稻MeRING29基因、编码蛋白和重组载体及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1320

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill.

<400> 1

atgccgacgc ctcgccgcca ccatgcgctg ccgctcgcgc tcacctcgct gctgctgctg 60

gtcgcggcgg acgcgcagcc gaacgagtcg agggacaaga gcaacggtgg cggggggttc 120

atgggcggcg gggggttgaa cactcagtct ccaagcttca gcgcgcccat ggtggtgctc 180

ctcgtggccc tcatcgcggc cttcttcttc atcgggttct tctccattta tattcgtcgg 240

tgcggcggcg agagctccac gggcccgacc atcccagcag ctgcgctggc ggcgctggcg 300

cggcaggagc agcggaaccg gcaccgtggg cttgaccccg ccgtgatcga gtcgttcccc 360

accatgaagt acgccgaggc gagggagctc cgggacgccg gcaaggacgc cgtcctcgag 420

tgcgcggtct gcctcagcga gttcgacgac gaggaggagc tccgcctgct gcccaagtgc 480

agccacgcct tccacccgga ctgcatcggc cagtggctcg ccagccacgt gacttgcccc 540

gtctgccgcc gcaatcttga ccctaacaag gacaccaccg aggaggtgat cgtccttgcc 600

gccgccgccg ctcgagagac gaacagcaac tccagagaaa tagtcgtggt acggcaagaa 660

gacggcgcgc ttccagcagc cgtggtgatc gacgtggccg ccgaggagga cgaggaggag 720

cggaggaagg aggaactgga gctgcaggag atagggaccc agctccgcgc gatgcgatca 780

aggtcgggac ggcagccaaa gacggcggcg aagcttctcc ggtcgcactc caccggccac 840

tccctcgccg tccggctcga ccgcgaccta gagcggttca cgctgcggct gccggagcac 900

gtgcgcaggg agatagtcgc cgccgccggc gaggagagcc tgcgacgcac cgccgttcgg 960

gaaggccgcg tcggcggcgg cgccaggagc gcgcggatcg ggcggtccga ccggtggccg 1020

tcgttcatcg cgaggacgtt ctcctcgagg gtgccgttct ggtctgcatc gaagagggca 1080

ctcgacgcgg aggtgggagc tgacgcctct accaccacca ccacgacgcc gacgtcaacg 1140

gcgaggacca agcgtgacaa gacggccacc gcggcggatg gctcagtgag ttcagctaag 1200

ggtagcgtcc gcttcgactg cctcggcggc ggcggcggcc cgagcacaaa agtcgtcgcc 1260

ttcgccaacg acgatgcgga ggacgacgac gacgagaagc caatcgctcg gcaagtttga 1320

<210> 2

<211> 439

<212> PRT

<213> Oryza meyeriana Baill.

<400> 2

Met Pro Thr Pro Arg Arg His His Ala Leu Pro Leu Ala Leu Thr Ser

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Asp Ala Gln Pro Asn Glu Ser Arg Asp

20 25 30

Lys Ser Asn Gly Gly Gly Gly Phe Met Gly Gly Gly Gly Leu Asn Thr

35 40 45

Gln Ser Pro Ser Phe Ser Ala Pro Met Val Val Leu Leu Val Ala Leu

50 55 60

Ile Ala Ala Phe Phe Phe Ile Gly Phe Phe Ser Ile Tyr Ile Arg Arg

65 70 75 80

Cys Gly Gly Glu Ser Ser Thr Gly Pro Thr Ile Pro Ala Ala Ala Leu

85 90 95

Ala Ala Leu Ala Arg Gln Glu Gln Arg Asn Arg His Arg Gly Leu Asp

100 105 110

Pro Ala Val Ile Glu Ser Phe Pro Thr Met Lys Tyr Ala Glu Ala Arg

115 120 125

Glu Leu Arg Asp Ala Gly Lys Asp Ala Val Leu Glu Cys Ala Val Cys

130 135 140

Leu Ser Glu Phe Asp Asp Glu Glu Glu Leu Arg Leu Leu Pro Lys Cys

145 150 155 160

Ser His Ala Phe His Pro Asp Cys Ile Gly Gln Trp Leu Ala Ser His

165 170 175

Val Thr Cys Pro Val Cys Arg Arg Asn Leu Asp Pro Asn Lys Asp Thr

180 185 190

Thr Glu Glu Val Ile Val Leu Ala Ala Ala Ala Ala Arg Glu Thr Asn

195 200 205

Ser Asn Ser Arg Glu Ile Val Val Val Arg Gln Glu Asp Gly Ala Leu

210 215 220

Pro Ala Ala Val Val Ile Asp Val Ala Ala Glu Glu Asp Glu Glu Glu

225 230 235 240

Arg Arg Lys Glu Glu Leu Glu Leu Gln Glu Ile Gly Thr Gln Leu Arg

245 250 255

Ala Met Arg Ser Arg Ser Gly Arg Gln Pro Lys Thr Ala Ala Lys Leu

260 265 270

Leu Arg Ser His Ser Thr Gly His Ser Leu Ala Val Arg Leu Asp Arg

275 280 285

Asp Leu Glu Arg Phe Thr Leu Arg Leu Pro Glu His Val Arg Arg Glu

290 295 300

Ile Val Ala Ala Ala Gly Glu Glu Ser Leu Arg Arg Thr Ala Val Arg

305 310 315 320

Glu Gly Arg Val Gly Gly Gly Ala Arg Ser Ala Arg Ile Gly Arg Ser

325 330 335

Asp Arg Trp Pro Ser Phe Ile Ala Arg Thr Phe Ser Ser Arg Val Pro

340 345 350

Phe Trp Ser Ala Ser Lys Arg Ala Leu Asp Ala Glu Val Gly Ala Asp

355 360 365

Ala Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Thr Ala Arg Thr Lys

370 375 380

Arg Asp Lys Thr Ala Thr Ala Ala Asp Gly Ser Val Ser Ser Ala Lys

385 390 395 400

Gly Ser Val Arg Phe Asp Cys Leu Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser Thr

405 410 415

Lys Val Val Ala Phe Ala Asn Asp Asp Ala Glu Asp Asp Asp Asp Glu

420 425 430

Lys Pro Ile Ala Arg Gln Val

435

<210> 3

<211> 1277

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 3

cgacttttgt gctcgggccg ccgccgccgc cgaggcagtc gaagcggacg ctacccttag 60

ctgaactcac tgagccatcc gccgcggtgg ccgtcttgtc acgcttggtc ctcgccgttg 120

acgtcggcgt cgtggtggtg gtggtagagg cgtcagctcc cacctccgcg tcgagtgccc 180

tcttcgatgc agaccagaac ggcaccctcg aggagaacgt cctcgcgatg aacgacggcc 240

accggtcgga ccgcccgatc cgcgcgctcc tggcgccgcc gccgacgcgg ccttcccgaa 300

cggcggtgcg tcgcaggctc tcctcgccgg cggcggcgac tatctccctg cgcacgtgct 360

ccggcagccg cagcgtgaac cgctctaggt cgcggtcgag ccggacggcg agggagtggc 420

cggtggagtg cgaccggaga agcttcgccg ccgtctttgg ctgccgtccc gaccttgatc 480

gcatcgcgcg gagctgggtc cctatctcct gcagctccag ttcctccttc ctccgctcct 540

cctcgtcctc ctcggcggcc acgtcgatca ccacggctgc tggaagcgcg ccgtcttctt 600

gccgtaccac gactatttct ctggagttgc tgttcgtctc tcgagcggcg gcggcggcaa 660

ggacgatcac ctcctcggtg gtgtccttgt tagggtcaag attgcggcgg cagacggggc 720

aagtcacgtg gctggcgagc cactggccga tgcagtccgg gtggaaggcg tggctgcact 780

tgggcagcag gcggagctcc tcctcgtcgt cgaactcgct gaggcagacc gcgcactcga 840

ggacggcgtc cttgccggcg tcccggagct ccctcgcctc ggcgtacttc atggtgggga 900

acgactcgat cacggcgggg tcaagcccac ggtgccggtt ccgctgctcc tgccgcgcca 960

gcgccgccag cgcagctgct gggatggtcg ggcccgtgga gctctcgccg ccgcaccgac 1020

gaatataaat ggagaagaac ccgatgaaga agaaggccgc gatgagggcc acgaggagca 1080

ccaccatggg cgcgctgaag cttggagact gagtgttcaa ccccccgccg cccatgaacc 1140

ccccgccacc gttgctcttg tccctcgact cgttcggctg cgcgtccgcc gcgaccagca 1200

gcagcagcga ggtgagcgcg agcggcagcg catggtggcg gcgaggcgtc ggcatatggc 1260

tcgtgttgcg tttgttt 1277

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgagggagt ggccggtgga gtgc 24

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgaggaggac gaggaggagc ggaggaag 28

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaccatgaa gtacgccgag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggtggtgtcc ttgttagggt 20

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccatggatg ccgacgcctc gccgccac 28

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaagatcttt caaacttgcc gagcgattg 29

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtctcaagg gctctaaaca ttt 23

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gttttcccag tcacgacac 19

<210> 12

<211> 2133

<212> DNA

<213> Oryza meyeriana Baill.

<400> 12

gtagtatcag tgtatctatc acgtatgcat catgcctgag ttgagtgtaa agtctgtagc 60

aacctaagct cgtgtgaaag atacaaataa tcacaggaat ctttgaatac agtgccggta 120

taaccccgct ccagtttttc aacgaagaag aagaaaaaat tcgatcttga acgtttctac 180

gctacttctc tatccaaaga agcaatgcag agaaaaaggg taataatcta ctagtttagg 240

agtattattt tcaactgaaa tggatcaact ttctatgccg acgcctcgcc gccaccatgc 300

gctgccgctc gcgctcacct cgctgctgct gctggtcgcg gcggacgcgc agccgaacga 360

gtcgagggac aagagcaacg gtggcggggg gttcatgggc ggcggggggt tgaacactca 420

gtctccaagc ttcagcgcgc ccatggtggt gctcctcgtg gccctcatcg cggccttctt 480

cttcatcggg ttcttctcca tttatattcg tcggtgcggc ggcgagagct ccacgggccc 540

gaccatccca gcagctgcgc tggcggcgct ggcgcggcag gagcagcgga accggcaccg 600

tgggcttgac cccgccgtga tcgagtcgtt ccccaccatg aagtacgccg aggcgaggga 660

gctccgggac gccggcaagg acgccgtcct cgagtgcgcg gtctgcctca gcgagttcga 720

cgacgaggag gagctccgcc tgctgcccaa gtgcagccac gccttccacc cggactgcat 780

cggccagtgg ctcgccagcc acgtgacttg ccccgtctgc cgccgcaatc ttgaccctaa 840

caaggacacc accgaggagg tgatcgtcct tgccgccgcc gccgctcgag agacgaacag 900

caactccaga gaaatagtcg tggtacggca agaagacggc gcgcttccag cagccgtggt 960

gatcgacgtg gccgccgagg aggacgagga ggagcggagg aaggaggaac tggagctgca 1020

ggagataggg acccagctcc gcgcgatgcg atcaaggtcg ggacggcagc caaagacggc 1080

ggcgaagctt ctccggtcgc actccaccgg ccactccctc gccgtccggc tcgaccgcga 1140

cctagagcgg ttcacgctgc ggctgccgga gcacgtgcgc agggagatag tcgccgccgc 1200

cggcgaggag agcctgcgac gcaccgccgt tcgggaaggc cgcgtcggcg gcggcgccag 1260

gagcgcgcgg atcgggcggt ccgaccggtg gccgtcgttc atcgcgagga cgttctcctc 1320

gagggtgccg ttctggtctg catcgaagag ggcactcgac gcggaggtgg gagctgacgc 1380

ctctaccacc accaccacga cgccgacgtc aacggcgagg accaagcgtg acaagacggc 1440

caccgcggcg gatggctcag tgagttcagc taagggtagc gtccgcttcg actgcctcgg 1500

cggcggcggc ggcccgagca caaaagtcgt cgccttcgcc aacgacgatg cggaggacga 1560

cgacgacgag aagccaatcg ctcggcaagt ttgaagcagg cggagctcct cctcgtcgtc 1620

gaactcgctg aggcagaccg cgcactcgag gacggcgtcc ttgccggcgt cccggagctc 1680

cctcgcctcg gcgtacttca tggtggggaa cgactcgatc acggcggggt caagcccacg 1740

gtgccggttc cgctgctcct gccgcgccag cgccgccagc gcagctgctg ggatggtcgg 1800

gcccgtggag ctctcgccgc cgcaccgacg aatataaatg gagaagaacc cgatgaagaa 1860

gaaggccgcg atgagggcca cgaggagcac caccatgggc gcgctgaagc ttggagactg 1920

agtgttcaac cccccgccgc ccatgaaccc cccgccaccg ttgctcttgt ccctcgactc 1980

gttcggctgc gcgtccgccg cgaccagcag cagcagcgag gtgagcgcga gcggcagcgc 2040

atggtggcgg cgaggcgtcg gcatatggct cgtgttgcgt ttgtttcttg gacgcggtcg 2100

cggcgggcgc ggatgtatat gactctcggg ctc 2133

Claims

1.一种泛素连接酶的RING亚型编码基因MeRING29基因，其特征在于，所述于MeRING29基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述MeRING29基因，其特征在于，所述MeRING29基因来源于云南疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)。

3.一种由权利要求1或2所述MeRING29基因编码得到的MeRING29蛋白，其特征在于，所述MeRING29蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种包含权利要求1或2所述MeRING29基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体以pCAMBIA2301为基础载体，所述MeRING29基因插入所述基础载体的Nco I和Bgl II多克隆位点之间。

5.权利要求1或2所述MeRING29基因或权利要求4所述重组载体在调控水稻对细菌和真菌病害的抗性中的应用。

6.权利要求1或2所述MeRING29基因或权利要求4所述重组载体在提高水稻对细菌和真菌病害的抗性中的应用。

7.权利要求1或2所述MeRING29基因或权利要求4所述重组载体在培育抗病水稻植株中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述抗病包括抗白叶枯病和稻瘟病。

9.一种培育抗病水稻植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求1或2所述MeRING29基因连接到pCAMBIA2301载体的Nco I和Bgl II多克隆位点之间，得重组载体；

(2)将所述重组载体转入水稻愈伤组织；

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，步骤(3)所述筛选包括将所述转化愈伤组织置于筛选培养基中进行培养，长出新愈伤组织的为所述阳性愈伤组织；所述的筛选培养基以MS为基本培养基，还包括：蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2,4-D 2.0mg/L、头孢拉定250mg/L和潮霉素50mg/L，pH＝5.8。