CN112501184B

CN112501184B - 大豆的GmMT1基因和含有GmMT1基因的载体及其制备方法与应用

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Publication number: CN112501184B
Application number: CN202011530095.XA
Authority: CN
Inventors: 邹佳男; 韩英鹏; 赵雪; 井妍; 张雨婷; 廉明; 李文滨
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112501184A

Abstract

本发明公开了一种大豆的GmMT1基因和含有GmMT1基因的载体及其制备方法与应用，属于大豆遗传育种技术领域。本发明为了获得大豆的GmMT1基因。本发明从品种中豆27的DNA中克隆出GmMT1基因，将pCAMBIA3301质粒的酶切片段与GmMT1基因序列片段进行连接反应，得到重组载体，将载体转入到拟南芥和大豆中，得到转GmMT1基因的拟南芥和转GmMT1基因的大豆，检测大豆毛状根和籽粒中异黄酮的含量和经过盐和干旱的胁迫处理以及大豆根部的抗疫霉根腐病检测，验证GmMT1基因的功能。GmMT1基因能够参与大豆籽粒异黄酮的积累过程，并在干旱胁迫、盐胁迫以及疫霉根腐病的条件下提高了植物的抗性。

Description

大豆的GmMT1基因和含有GmMT1基因的载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于大豆遗传育种技术领域，具体涉及大豆的GmMT1基因和含有GmMT1基因的载体及其制备方法与应用。

背景技术

异黄酮(Isoflavone)是大豆重要的次生代谢产物之一，在大豆中目前发现了12种大豆异黄酮，包括大豆苷类、染料木苷类、大豆黄苷类三大类，有结合型糖苷、游离型苷元等主要的存在形式。其中，结合型糖苷在大豆异黄酮较为普遍，而游离型大豆异黄酮包括大豆苷元(daidzein)、染料木素(genistein)、黄豆黄素(glycitein)三种异黄酮组分。

异黄酮作为植保素，在植物抵御植物病毒、细菌性病害以及真菌性病害中具有重要作用。同时，异黄酮也可以参与到植物的非生物胁迫反应中。大豆异黄酮是一种由多基因控制的数量性状，控制其合成的关键基因已基本清晰，然而大豆异黄酮调控相关的基因及其功能却仍鲜见报道。

发明内容

本发明的目的是为了获得大豆异黄酮调控相关的GmMT1基因，本发明提供了一种大豆的GmMT1基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种含上述GmMT1基因的载体，所述的载体为pCAMBIA3301-GmMT1载体。

本发明还提供了一种上述pCAMBIA3301-GmMT1载体的制备方法，所述的制备方法为利用BstEII和BglII酶切pCAMBIA3301质粒得到pCAMBIA3301质粒的酶切产物，然后利用BstEII和BglII酶切pGEM-T-GmMT1载体得到用GmMT1基因序列片段，然后利用T4 DNA连接酶将pCAMBIA3301质粒的酶切片段与GmMT1基因序列片段进行连接反应，得到pCAMBIA3301-GmMT1载体。

进一步地限定，所述的连接反应的体系为：T4 DNA连接酶1μL、10×T4 DNABuffer2μL、pCAMBIA3301载体片段0.4μL、GmMT1目的片段4μL和ddH₂O 12.6μL。

本发明还提供了上述GmMT1基因在提高植物的根或叶片中异黄酮含量中的应用。

本发明还提供了上述GmMT1基因在提高植物的根对干旱胁迫耐受性中的应用。

本发明还提供了上述GmMT1基因在提高植物的根对盐胁迫耐受性中的应用。

进一步地限定，所述植物为大豆和拟南芥。

本发明还提供了上述GmMT1基因在提高大豆的根对疫霉根腐病的抗性中的应用。

本发明还提供了上述GmMT1基因在提高大豆籽中异黄酮含量中的应用。

有益效果：GmMT1基因能够参与大豆籽粒异黄酮的积累过程，同时在干旱胁迫、盐胁迫以及疫霉根腐病等逆境条件下提高了植物的抗性，得到的转基因材料通过继代繁殖鉴定，可以成为稳定的提高作物品质的育种材料。本发明为加速大豆品质及抗性相关的大豆育种进程以及提高育种效率具有重要的理论意义和实践价值。

附图说明

图1为GmMT1基因的克隆结果图，其中M是DL2000，1是目的基因片段；

图2为GmMT1蛋白的氨基酸组成百分比结果图；

图3为GmMT1蛋白疏水性预测结果图，其中横坐标是氨基酸位置，纵坐标是亲/疏水性得分；

图4为GmMT1蛋白质三级结构预测结果图，其中C是蛋白质C端，N是蛋白质N端；

图5为同系物基因Glyma.19G017500和Glyma.13G066900在大豆染色体上物理分布，其中chr19是染色体19，chr13是染色体13；

图6为GmMT1基因的系统进化树结果图；

图7为GmMT1基因在高、低异黄酮品系不同发育时期表达的情况分析结果图，其中横坐标是取样次数，纵坐标是相对表达量；

图8为NaCl处理后GmMT1基因的表达结果图，其中横坐标是时间，纵坐标相对表达量；

图9为PEG6000处理后GmMT1基因的表达结果图，其中横坐标是时间，纵坐标相对表达量；

图10为pCAMBIA3301-GmMT1载体菌液PCR鉴定结果图；

图11为亚细胞定位重组质粒菌液PCR鉴定结果图；

图12为GmMT1蛋白的亚细胞定位结果图；

图13为T3代拟南芥的PCR鉴定结果图，其中M是DL2000，1-12为GmMT1基因过表达的拟南芥植株，13是水，14是野生型植株，15-22是GmMT1恢复拟南芥植株；

图14为转基因与非转基因拟南芥叶片总异黄酮含量结果图，其中横坐标是样品，纵坐标是异黄酮的含量；

图15为盐胁迫和干旱胁迫处理下对拟南芥的萌发率的影响，其中MS是对照组，MS+300mM Mannitol为300mM甘露醇处理，MS+100mM Nacl为100mM盐处理；

图16为盐胁迫和干旱胁迫处理下对拟南芥的根长的影响，其中MS是对照组，MS+300mM Mannitol为300mM甘露醇处理，MS+100mM Nacl为100mM盐处理；

图17为转基因大豆毛状根的Bar引物PCR鉴定结果图，其中M是DL2000，1-16为检测的转基因大豆毛状根；

图18为转基因与非转基因大豆根部组织异黄酮含量结果图，其中横坐标是样品，纵坐标是异黄酮含量；

图19为转基因大豆毛状根的抗大豆疫霉根腐病鉴定结果图；

图20为转基因大豆毛状根在盐和PEG处理一周后的根长和根重相对增长结果图，其中横坐标是样本(野生型和转基因毛状根)，纵坐标是根长的相对增长率，A是大豆毛状根根长结果图，B是大豆毛状根根重结果图；

图21为T2代转基因大豆籽粒Bar基因PCR鉴定结果图，其中，其中M是DL2000，1-12为检测的T2代转基因大豆籽粒；

图22为T2代转GmMT1基因大豆植株的qRT-PCR检测结果图，其中横坐标是样品，纵坐标是相对表达量；

图23为免疫印迹检测结果图，其中，1，2，3分别是三个转基因株系；

图24为转基因大豆籽粒的异黄酮含量的测定结果图，其中横坐标是样品，纵坐标是相对表达量；

图25为载体pCAMBIA3301的载体图。

具体实施例

重组自交系any2(高异黄酮品系)、重组自交系any22(低异黄酮品系)由中豆27和九农20杂交衍生的纯合品系，由东北农业大学大豆研究所创制，记载在曾国良，王继安，韩英鹏等，大豆异黄酮含量与主要农艺性状相关性及通径分析，大豆科学2007,26(01):25-29。

实施例1.

一、GmMT1基因的克隆

1.以品种为中豆27的大豆叶片为材料提取总RNA并反转录合成cDNA第一链。

反转录步骤如下：将2μLRNA、1μL oligo(dT)(50μM)和1μL Super Pure dNTP(10mM)混合后，加DPEC水至10μL。将管在65℃下孵育5min，然后在冰上冷却。将4μL5xPrimeScript II缓冲液、0.5μL RNase-Free Dnase和1μLPrimeScript II RTase混合后，加DPEC水至20μL。将混合物在42℃下孵育1h，95℃下再温育5min，然后在冰上冷却待用。

2.在Phytozome v11.0数据库查找登录号为Glyma.19G017500基因的全长序列，序列如SEQ ID NO.1所示。根据Glyma.19G017500基因的序列设计克隆引物：GmMT1-S序列如SEQ ID NO.2所示，即5’-CAGGACCCACCAGAGGACCCT-3’：GmMT1-A序列如SEQ ID NO.3所示，即5’-GGCGTAACACGTCTGATACAAC-3’，以上述所得cDNA第一链为模板进行PCR扩增(东洋纺生物科技有限公司)，反应体系为：

PCR反应程序：94℃2min；35个循环：94℃30s，63℃30s，72℃30s；72℃7min，4℃保存，取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并且进行纯化。

3.使用Promega公司的pGEM-T克隆试剂盒，将纯化后的PCR产物连接pGEM-T载体，体系如下：胶回收产物5μL；pGEM-T Easy(50ng/μL)1μL；10×T₄ DNALigation Buffer1μL；T₄DNALigase(3U/μL)1μL；ddH₂O 2μL，16℃过夜连接。

连接产物转化DH5α感受态细胞，转化过程如下：在冰上解冻DH5α感受态细胞后，将目的DNA打入离心管底部与100μL感受态细胞混合均匀，冰浴30min。在42℃孵育45s，然后立即转移到冰上，加入700μL LB液体培养基。在37℃下220rpm振荡孵育1h。5,000rpm离心1min，弃上清液。将沉淀重悬于100μL LB液体培养基中，然后用无菌涂布棒涂布在含有卡那霉素(Kana(50mg/ml))抗性的LB固体培养基，37℃孵育过夜。挑取单克隆进行PCR及测序验证。结果如图1所示，最终得到目的片段大小为957bp的GmMT1基因，序列如SEQ ID NO.4所示。

二、GmMT1基因的生物信息学分析

对GmMT1基因以及其编码的蛋白(GmMT1蛋白质序列如SEQ ID NO.15所示)进行生物信息学初步分析，包括结构分析、物理定位、系统发育分析，启动子分析和亚细胞定位预测。利用ProtParam在线软件对蛋白质理化性质分析由该基因编码的蛋白质是318个氨基酸构成，结果如图2和图3所示，含量较多的是亮氨酸，最少的是色氨酸，该蛋白属于不稳定蛋白，也是亲水性蛋白。结果GmMT1基因编码的蛋白二级结构主要是α螺旋、层状结构、β转角和不规则卷曲四种结构，分别占比33.33％、19.81％、6.60％和40.25％。通过CDD在线软件分析，结果表明其属于S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶(SAM或AdoMet-MTase)的I类。AdoMet-MTases是使用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或AdoMet)作为甲基转移的底物的酶，产生产物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)。利用phyre软件预测GmMT1基因编码蛋白质产物的三级结构，并用Rasmol软件图形分析三级结构，结果如图4所示，GmMT1蛋白产物含有129个氢键、7个α螺旋结构、11个β折叠结构和18个转角结构。

在大豆基因组数据库中进行同源比对绘制大豆染色体的物理图谱，结果如图5所示，结果发现在大豆参考基因组Williams82中GmMT1基因有Glyma.19G017500和Glyma.13G069900两个拷贝，。在NCBI数据库中，根据GmMT1基因的氨基酸序列搜索各种物种的同源序列，使用MEGA6搜索同源序列构建了系统发育树，结果如图6所示，结果显示，在14个不同物种的氨基酸序列中，GmMT1基因与其大豆同源基因Glyma.13G66900同源性最高。在与其它物种的比较中发现，这两个基因都与菜豆(Phaseolus vulgaris)具有较近的亲缘关系。

三、大豆GmMT1基因的表达模式分析

温室种植中豆27、重组自交系any2(高异黄酮品系)、重组自交系any22(低异黄酮品系)的大豆材料，对重组自交系材料进行发育动态过程表达模式分析，对R5-R8时期的大豆籽粒取材，于-80℃保存，用于提取RNA；按照不同的胁迫条件处理(150mM NaCl和8％(w/v)PEG6000)生长约3周龄的材料进行根部浸泡处理，采集处理0、1、2、4、6、8、12、24小时的叶片提取RNA并进行定量分析。

使用Trizol Reagent(Invitrogen，USA)从大豆组织中提取总RNA，并用RNase-Free DNase(Promega，USA)处理以除去DNA的污染，用1.5％琼脂糖凝胶分析RNA的完整性。使用cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN公司)合成cDNA。荧光定量体系根据Takara公司的

Premix Ex Taq^TM试剂盒的说明书。使用StepOne荧光定量PCR系统(ABI，USA)的SYBRGreen Fast qPCR Master Mix(BBI，Canada)进行qPCR反应(反应体系：cDNA 2.0μL；PCRForward Primer 0.5μL；PCRReverse Primer 0.5μL；2×SuperReal PreMix Plus 10.0μL；50×ROX Reference DyeΔ0.4μL；ddH₂O 6.6μL。程序包括：95℃15min，95℃10s，60℃20s，72℃20s，40个循环)，设置3次生物学重复。基因特异性引物由Primer Premier 5.0软件设计，并由华大公司合成引物qGmMT1-F序列如SEQ ID NO.5所示，即5’-CCCCTCTTCGTCTCTTACACC-3’；qGmMT1-R序列如SEQ ID NO.6所示，即5’-CGTCAACATCGCAGCCATAC-3’；GmActin4-F序列如SEQ ID NO.7所示，即5’-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT-3'，GmActin4-R序列如SEQ ID NO.8所示，即5’-'GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3'。

使用2^-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量，根据表达差异，说明GmMT1基因可能参与到的生物学过程。具体结果如下图所示，图7所示：GmMT1基因在高异黄酮品系any2大豆籽粒中的表达水平逐步增加，在R₇时期达到峰值，然后下降到较低水平，而GmMT1基因在低异黄酮品系any22中的表达水平逐步增加，在R₆时期达到峰值，然后下降到较低水平。结果说明GmMT1基因可能参与到了大豆籽粒异黄酮的积累过程中。图8所示：GmMT1基因在150mmol/L的NaCl处理条件下呈正调控表达，大豆GmMT1的表达水平逐步增加，在处理后12h达到峰值，然后下降至较低水平，表明大豆GmMT1可响应盐胁迫。图9所示：在8％PEG6000处理条件下GmMT1呈正表达，大豆GmMT1的表达水平逐步增加，在处理12h后达到极值，随后迅速降低，表明GmMT1可响应干旱(PEG)胁迫。

四、GmMT1基因亚细胞定位的方法

1.GmMT1基因过表达载体的构建方法

利用OMEGA生物公司的质粒提取试剂盒，提取pGEM-T-GmMT1和pCAMBIA3301(载体图如图25所示)载体的质粒。获得的pCAMBIA3301(植物双元表达载体)载体质粒与pGEM-T-GmMT1克隆质粒，用BstEII和BglII双酶切，条件为37℃2小时；用T4 DNA连接酶将pCAMBIA3301载体片段与GmMT1基因目的片段连接，连接体系如下：T4 DNA连接酶1μL；10×T4 DNA连接酶缓冲液2μL；pCAMBIA3301载体片段0.4μL；GmMT1基因目的片段4μL；ddH₂O12.6μL；16℃过夜连接。得到pCAMBIA3301-GmMT1载体，结果如图10所示。

2.GmMT1基因的亚细胞定位

以pCAMBIA3301-GmMT1载体为模板，设计GmMT1基因亚细胞定位引物：scGmMT-F序列如SEQ ID NO.9所示，即5’-CGGGGGACTCTTGACATGGCGGTTTTGTCGCCTCC-3’；scGmMT-R序列如SEQ ID NO.10所示，即5’-GTCAGATCTACCATGCTCTTATTCTGGGACCATGT-3’，进行目的基因的PCR扩增，反应体系为：

反应程序：94℃5min；35个循环(94℃30s，55℃30s，72℃30s)；72℃10min，4℃保存，取PCR产物进行纯化后，将pCambia1302质粒用NcoⅠ进行单酶切，酶切体系如下:pCambia1302质粒40μL；Nco I Ligase 5μL；10×buffer10μL；ddH₂O to 100μL,37℃酶切2h。In-Fusion连接PCR产物以及酶切后的质粒，连接体系如下：单酶切产物1μL；目的片段2μL；In-fusion Ligase 1μL；ddH₂O 1μL；50℃连接15min,4℃保存备用。连接转化后再浓缩质粒，结果如图11所示，提取并纯化拟南芥叶片的原生质体，将混合后的原生质体溶液与浓缩质粒混合液在培养皿中培养超过18小时，在激光共聚焦显微镜下观察并观察其位置结果，结果如图12所示，结果发现GFP空载体的荧光信号分布于整个植物细胞，而GmMT1-GFP重组载体定位到叶绿体，这表明GmMT1蛋白主要在叶绿体表达。

实施例2.制备pCAMBIA3301-GmMT1载体的方法

利用BstEII和BglII分别双酶切pCAMBIA3301质粒与pGEM-T-GmMT1载体，得到用GmMT1基因序列片段和pCAMBIA3301质粒的酶切产物，然后利用T4 DNA连接酶将pCAMBIA3301质粒的酶切片段与GmMT1基因序列片段进行连接反应，得到pCAMBIA3301-GmMT1载体。

利用实验数据说明效果：

实验原材料:拟南芥种子(Arabidopsis thaliana)和大豆种子品种东农50来自东北农业大学大豆研究所。

实验试剂：试剂均是商业购买。

一、GmMT1基因转化拟南芥的方法

1.配置MS培养基，将培养基倒入标准的100mm培养皿中。将灭菌后的拟南芥种子均匀地铺展到固体MS培养基中。将接种的固体MS培养基板在4℃下孵育2-3天，将拟南芥幼苗转移到转移到灭菌土壤中，在22℃、350μmol.m-2.s-1白光的光照培养箱中长日照培养。

将pCAMBIA3301-GmMT1表达载体的质粒通过电转化法转化到根癌农杆菌感受态细胞中(EHA105)，转化步骤如下:向装有50μL农杆菌感受态的1.5ml EP管中加2μL稀释的质粒；将混合液转入-20℃预冷20min的电转化杯中；将电转化仪电压设置为2V(其他参数为默认设置)；将电转化杯调整至正确方向，按住加压按钮直到哔哔警报响起(大概几秒钟)；向电转化杯中加入1ml无抗YEP液体培养基，并用移液器混匀，吸取1ml转入离心管中；在涂板前将混合液于28℃孵育2-3h，取70μL涂板(50mg/mL Str，50mg/mL Kan，25mg/mL Rif)，倒置平板，28℃培养箱过夜培养1-2天；挑取单菌落进行摇菌和PCR验证，保存阳性菌液并置于-80℃备用。

制备好的农杆菌液重悬液倒入培养皿中，并将整个花序浸入重悬液中30s。侵染后，将拟南芥进行黑暗处理1天，然后使它们正常生长。以同样的方式进行再次侵染。直至结荚成熟，收集成熟的T0种子。将T0代拟南芥种子种在含有6mg.L-1PPT的1/2MS培养基平板上，经过春化处理后放置在光照培养箱中培养，把能够正常生长的拟南芥移植到MS培养基上恢复生长1周后，将植株移植于土中生长。经过逐代筛选，共获得T3代过表达拟南芥和恢复系拟南芥植株各7株。

用SDS法提取转基因拟南芥的DNA。用Primer 5.0软件设计基因特异性引物：3301-Bar-433-F序列如SEQ ID NO.11所示，即5’-TGCACCATCGTCAACCACTACATC-3’；3301-Bar-433-R序列如SEQ ID NO.12所示，即5’-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3’；GmMT1.1-35s-F序列如SEQ ID NO.13所示，即5’-ACAAGTCTAACCAGTGACCAGG-3’；GmMT1.1-35s-R序列如SEQ IDNO.14所示，即5’-TGGCGAACAGTTCATACAGA-3’，PCR产物经纯化后验证，结果如图13所示。

2.转GmMT1基因拟南芥的表型分析及抗性鉴定

(1)异黄酮的提取：研磨纯合T3代转基因拟南芥(MT1基因过表达)、恢复系拟南芥(GmMT1基因转入MT1拟南芥突变体)、突变体拟南芥(MT1基因缺失拟南芥)、野生型拟南芥叶片，称取0.1g叶片粉末，采用HPLC法测定异黄酮。结果如图14所示，显示突变体拟南芥异黄酮含量为124.82ug/g，恢复系拟南芥和野生型拟南芥异黄酮含量分别为154.41ug/g和147.34ug/g，而过表达拟南芥的异黄酮含量达211.88ug/g，表明过表达拟南芥植株叶片中的总异黄酮含量比野生型拟南芥植株叶片中的总异黄酮含量提高了43.8％，恢复系拟南芥植株叶片中的总异黄酮含量比突变体拟南芥植株叶片中的总异黄酮含量提高了23.7％，说明GmMT1基因对拟南芥中的异黄酮含量具有促进作用。

(2)盐胁迫分析：盐处理下的萌发率比较和根生长状况：将不同类型拟南芥的种子均匀点播在含有100mmol.L-1NaCl的MS培养基上。4℃下孵育2-3天后，长日照培养后，计算发芽率。相同条件下培养基平板由锡纸包裹，拟南芥生长至1周时期，统计根的长度。结果如图15和16所示，在100mmol.L-1NaCl条件下，第3天野生型种子发芽率为43.1％、突变体种子发芽率为28.7％、过表达种子发芽率为97.2％、恢复系型种子发芽率为81.7％，其中突变体受到明显抑制，在根长实验中，突变体植株的根在盐胁迫下受明显抑制，恢复系和野生型次之，而过表达拟南芥的根生长受到较小的影响，过表达拟南芥根生长受到相对较轻抑制，说明GmMT1基因可以提高拟南芥的耐盐性。

(3)干旱胁迫表型分析：干旱处理下的萌发率比较和根生长情况：将不同类型拟南芥的种子点播在含有300mmol.L-1甘露醇的MS培养基上。4℃下孵育2-3天后，长日照培养后，计算发芽率。同条件下培养基平板由锡纸包裹，拟南芥生长1周，统计根的长度。结果如图15和16所示，在甘露醇为300mM的条件下，第4天野生型种子的发芽率为30.5％、突变体种子发芽率为17.9％、过表达种子的发芽率为80.5％、恢复系种子发芽率为27.8％，在根长实验中，与盐胁迫下相类似，四种拟南芥株系中，突变体的根长受明显抑制而过表达拟南芥的根受到较小的抑制，由此可知GmMT1基因可以提高拟南芥的抗盐性。

二、GmMT1基因转化大豆的方法

1.发根农杆菌介导法转化大豆毛状根

将GmMT1基因转入大豆品种东农50中，具体方法如下：

(1)冻融法转化发根农杆菌感受态细胞:提取pCAMBIA3301-GmMT1表达载体的质粒，并将质粒转化到发根农杆菌感受态细胞中。在冰上解冻储存的感受态细胞，将0.5-1.0μg质粒DNA加入感受态细胞并混匀。在冰上将混合好的感受态细胞孵育5min，在液氮中孵育5min，37℃再孵育5min。在1ml YEP培养基稀释后，将细胞在室温或28℃下振荡2-4h。5,000rpm离心1min，弃去上清液。将沉淀重悬于100μL YEP液体培养基中，再涂布在含抗生素(50μL(50mg·L^-1)Kana、50μL(50mg·L^-1)Str)的YEP固体培养基平板上并在28℃下孵育2d。挑取单斑，摇菌并进行PCR验证，甘油保存于-80℃备用。

(2)菌液制备：取制备好的菌液分别在YEP固体平板(50mg/mL Str，50mg/mLKana)上划线28℃培养，挑取携带GmMT1基因的发根农杆菌单菌落接种于YEP液体培养基(50mg/mLStr，50mg/mLKan)中，28℃200rpm震荡培养1-2天，取1-2ml菌液接种于50ml新鲜的LCCM液体培养基中震荡培养至OD600为0.8-1.0。

(3)种子灭菌：选取饱满、无菌斑种子于培养皿中，采用氯气灭菌法，将种子放入通风厨的干燥器内，在干燥器的三角瓶中倒入96ml次氯酸钠，再快速加入6ml浓盐酸后迅速盖紧封盖。灭菌16小时后置于超净工作台内吹走残留的氯气，大约30min左右，密封待用。

(4)种子萌发：将灭菌后的种子种脐向下于GM培养基中，每瓶种10粒，在23℃、16小时光照/8小时黑暗条件下萌发4-5天。

(5)外植体的制备：取出发芽的籽粒并去除种皮以便容易地将籽粒一分为二，用解剖刀轻轻刮掉子叶和生长点之间的腋芽，并在子叶节处轻轻划3-5道伤口，剩余的部分作为外植体用于侵染，侵染30min。

(6)共培养与根诱导：将外植体放置共培养培养基中在暗处培养3天后，再转移至发根诱导培养基中，观察发根情况。

2.转GmMT1基因大豆毛状根的抗性鉴定

利用上述步骤1的方法共侵染了大豆植株160株，其中有118个成功发根，发根成功率为73.75％。用SDS法提取118组转GmMT1基因毛状根的DNA，用Bar基因引物及以GmMT1基因设计的特异性引物：3301-Bar-433-F序列如SEQ ID NO.11所示，即5’-TGCACCATCGTCAACCACTACATC-3’；3301-Bar-433-R序列如SEQ ID NO.12所示，即5’-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3’；GmMT1.1-35s-F序列如SEQ ID NO.13所示，即5’-ACAAGTCTAACCAGTGACCAGG-3’；GmMT1.1-35s-R序列如SEQ ID NO.14所示，即5’-TGGCGAACAGTTCATACAGA-3’，PCR产物经纯化后验证，结果如图17所示，分别进行PCR扩增鉴定转基因毛状根,得到目的片段大小分别为433bp和957bp。检测结果最终获得66个转GmMT1基因阳性根，阳性率为56％。

(2)转基因毛状根的异黄酮含量测定：利用高效液相色谱技术测定转基因植株及普通大豆植株根部组织的异黄酮含量，研磨获得的转GmMT1基因大豆阳性根，取0.1g采用HPLC法测定大豆异黄酮(进样量：10μL；柱温：35℃；流动相A为含0.1％(V/V)乙酸的超纯水，流动相B为含0.1％(V/V)乙酸的乙腈；梯度洗脱：13-35％；运行时间：65min；流速：1.0mL·min-1；检测波长：260nm)。结果如图18所示，显示非转基因大豆根部组织异黄酮含量为1230.46ug/g，转基因大豆组织中的异黄酮含量介于2250ug/g～4454.58ug/g之间，结果表明转GmMT1基因的阳性根部组织中的总异黄酮含量比普通大豆植株根部组织的总异黄酮含量显著提高，说明GmMT1基因能促进异黄酮合成。

(3)转基因毛状根的抗病性鉴定：将转基因毛状根做大豆疫霉根腐病抗病性鉴定，毛根培养15d，转到长有大豆疫霉菌的胡萝卜培养基上，5-7d观察发病情况，结果如图19所示，结果表明转GmMT1基因毛状根没有典型的大豆疫霉根腐病特征，野生型毛状根与转基因毛状根相比，根系变成黑褐色，侧根腐烂。因此，GmMT1基因能提高大豆对疫霉根腐病的抗性作用。

(4)转基因毛状根的抗旱性及盐胁迫耐性鉴定：对转基因毛状根进行干旱及盐胁迫处理：挑选长势一致的毛状根转移到含150mmol/LNaCl或8％PEG6000的1/2霍氏营养液浸泡处理1周，非处理的毛状根作为对照。在处理之前和处理之后分别统计毛状根的长度及重量，并计算毛状根的相对生长率，以在处理条件下毛状根的净增长量平均值与在非处理条件下毛状根的净增长量平均值的比值作为衡量相对增长率的指标。结果如图20中的A和图20中的B所示，结果转GmMT1基因的毛状根比非转基因毛状根对干旱胁迫与盐胁迫的耐受性更强。此外，我们还测定了处理前后根部的相对增长量，发现在150mmol/LNaCl条件下，转基因阳性根的根长比对照增加了12.13％，根重相较于对照增加了11.78％；在8％的PEG6000条件下，转GmMT1基因阳性根的根长比对照增加了7.91％，根重比对照增加了9.15％，结果表明转GmMT1基因的毛状根比非转基因毛状根对干旱胁迫与盐胁迫的耐受性更强。

3.根癌农杆菌介导法转化大豆子叶节

将GmMT1基因转化到大豆东农50子叶节中，具体方法如下：

(1)菌液制备：取制备好的菌液在YEP固体平板(50mg/mL Str，50mg/mL Kan，25mg/mLRif)上划线28℃培养，挑取携带GmMT1基因的根癌农杆菌单菌落接种于YEP液体培养基(50mg/mL Str，50mg/mLKan，25mg/mLRif)中，28℃200rpm震荡培养1-2天，取1-2ml菌液接种于50ml新鲜的YEP液体培养基中震荡培养至OD600为0.6-0.8，将菌液放在4000rpm的离心机中离心10min，富集菌体后再用等量的液体CCM培养基重悬。

(2)种子灭菌：选取饱满、无菌斑的东农50种子于培养皿中，采用氯气灭菌法，将种子放入通风厨的干燥器内，在干燥器的三角瓶中倒入96ml次氯酸钠，再快速加入6ml浓盐酸后迅速盖紧封盖。灭菌16小时后置于超净工作台内吹走残留的氯气，约30min左右，密封待用。

(3)种子萌发：将灭菌后的种子种脐向下种于萌发培养基中，每瓶种10粒，在23℃、16小时光照/8小时黑暗条件下萌发5-6天。

(4)子叶节的制备：选取无菌、萌发充分的植株，去掉种皮，于子叶下端5mm处将下胚轴切掉，沿下胚轴中线将两片子夜切开，去除真叶，得到子叶节外植体。用实验刀在子叶与胚轴交接处直径约3mm的范围内划3-5刀。

(5)侵染与共培养：将制备好的外植体放入侵染液中28℃ 120rpm恒温震荡培养30min，倒掉侵染液，用无菌纸将外植体表面的侵染液吸干，倒置平铺在共培养培养基上并进行3天暗培养。

(6)丛生芽的诱导及筛选：将暗培养后的子叶节外植体装入无菌的培养瓶中，用灭菌蒸馏水清洗3遍，用无菌纸将子叶节表面的液体吸干，以与培养基表面45度角斜插在恢复培养基中进行芽诱导。在诱导7-10天后，将丛生芽转移至含有6mg/L PPT的筛选培养基中，筛选7-10天。

(7)丛生芽的伸长与生根：取经筛选后的丛生芽，去掉大芽并用解剖刀刮掉丛生芽的黑头，再将其插入到伸长培养基中。待伸长20-30天左右，将长出2组三出叶的大豆苗从丛生芽处切下，转移至生根培养基中，待15天左右，将苗转移栽至土壤中。

4.转GmMT1基因大豆子叶节的鉴定

(1)利用上述步骤3的方法得到转基因植株，在T0代进行PPT(草铵膦)筛选，并用Bar引物以及GmMT1基因特异性引物(如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示)进行连代PCR鉴定，结果如图21所示，最终在T1代得到潜在阳性植株12株，其后在T2代共鉴定出7株候选阳性植株。提取PCR检测为阳性的T2代植株的RNA，将其反转录后的cDNA进行qRT-PCR检测，结果如图22所示，表明在PCR检测为阳性的T2代植株中GmMT1基因均能正常表达。通过数据分析和比较再次筛选阳性植株，留下比对照组表达量高3倍左右的阳性植株，并培养和收获后代，得到5株转基因株系。

(2)T2代转GmMT1基因大豆植株的Western-blot检测：从上述5株转基因大豆植株的叶片中提取粗蛋白质，通过12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，并使用电泳转移细胞(Bio-Rad，Hercules)转移至硝酸纤维素膜上30min。用含有Tween-20(TBST)的Tris缓冲盐水溶液洗涤后，将膜与5％(w/v)脱脂奶粉在37℃下孵育2小时，并在4℃下与多克隆抗体(1：200v/v稀释)或来自感染山羊(1：200v/v稀释)的血清孵育12小时，然后用1：1,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗兔IgG或兔抗山羊IgG)孵育2小时。使用增强的化学发光(ECL)试剂盒显色印迹。结果如图23所示，结果表示非转基因植株未检出Bar蛋白，而在3株转基因大豆植株中有较明显的Bar蛋白表达，即确定该3个株系为转GmMT1基因株系，可用于后续的实验。

(3)转基因大豆籽粒的异黄酮含量测定：从野生型东农50和过量表达GmMT1基因的东农50大豆籽粒中提取异黄酮，提取步骤如下：在液氮中用研钵将大豆籽粒研磨成粉，准确称取0.1g研磨后粉末，放入带有螺帽的有机玻璃试管中，加入5mL含0.1％(V/V)乙酸的70％(V/V)乙醇水溶液，室温下振荡过夜，5,000rpm离心10min，上清液通过0.2um滤膜过滤，4℃冰箱保存待用。

用高效液相色谱法测定异黄酮的含量(进样量：10μL；柱温：35℃；流动相A为含0.1％(V/V)乙酸的超纯水，流动相B为含0.1％(V/V)乙酸的乙腈；梯度洗脱：13-35％；运行时间：65min；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：260nm。)结果表示，大豆苷和染料木苷在转基因大豆籽粒中的含量显著高于野生型东农50中的含量。结果如图24所示，转GmMT1基因T2代植株籽粒中的总异黄酮的含量(5032.02ug/g～5731.18ug/g)比非转基因株系籽粒(1603.3ug/g)提高了3倍以上。证实GmMT1基因具有促进异黄酮合成的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 大豆的GmMT1基因和含有GmMT1基因的载体及其制备方法与应用

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> Glyma.19G017500基因

<400> 1

atggcggttt tgtcgcctcc aacactctcc ttactccttc aaaaaaccaa gattattaat 60

tttcgggtca ccaccacttc ctcttctcac cttcttctcc tcctaacccc tcctaacccc 120

tcttcgtctc ttacaccaat tattgcattg caatctcgta tttttgcaga atccggaaat 180

gggttggcca gtgaggacaa aaaaatcttg cttgacaagt atggctgcga tgttgacgct 240

gatgagtact tttctcagtc gtcttctaag tccaagagga gaaaggactc aaaggagcaa 300

ccaaggagaa gaggagggaa gcaagtgcag gacccaccag aggaccctaa gcctcctcgt 360

actacccata aattgcttca ggttcttggt ggaacagctc gaagagtgaa gctactctca 420

ccaaagggca tggatgtacg ccccatgatg gaagtggtga aaggtgcagc ctttgatata 480

ttacaggcag ctggtggctg tcctgcagct ctgagacctg gtcactggtt agacttgtat 540

agtggtacag gttctgttgg aattgaagca ctcagccgag gatgttctga ggtgcattta 600

gttgagatgg atccatgggt tgtatcagac gtgttacgcc caaacttaga ggaaactgga 660

ttccttgatg cctcagtcat acatactgtc cgtgtggaaa aattcttcga acgaaaccgt 720

ggcccatttg attacattag tgtcacccct ccatatacac aagttgacta tggggtgctg 780

atgaggcaaa tatcagaatc atccttgatt ggagagaaca catttattgt agttgagtat 840

gctttaaaaa ctgacatgct ggattcttgt ggaagccttg taaagataac tgacaggcgg 900

tttggccgga cactcttggc aatttatgga ccaacatggt cccagaataa gagatga 957

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> GmMT1-S

<400> 2

caggacccac cagaggaccc t 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> GmMT1-A

<400> 3

ggcgtaacac gtctgataca ac 22

<210> 4

<211> 927

<212> DNA

<213> GmMT1基因

<400> 4

atggtcgttt cgtcgcctcc accattctcc cactctacca gacaccaaga cagatttggg 60

tcaccaccat ttctcttctc accctctgct cctcgtcaca acctcctcac ccctcttcgt 120

ctcttccccc aatccggaaa tgggttggcc agtgaggaca aaaaaatcat gcttgagaag 180

tatggctacg atattgatgc tgatgagtac ttttcacagt catcttctaa gtccaagagg 240

agaaaggagc aaccaaggag aagaggaggg aagcaagtgc aggacccacc agaggaccct 300

aagcctcctc gtgtaaccca taaattgctt caggttcttg gaggaacagc tcgaagagtg 360

aagctacttt caccaaaggg catggatgtg cgccccatga tggaagtggt gaaaggtgca 420

gcctttgata tattacaggc agctggtggc tgtcctgcag cattgagacc tggtcgctgg 480

ttagacttgt atagcggtac aggttctgtt ggaattgaag cacttagccg aggatgttct 540

caggtgcatt ttgttgagat ggatccgtgg gttgtatcag atgttttacg tccaaacctg 600

gaggaaactg gattcctaga tgcttcagtc atacatactg tccgtgtaga aaaattcttt 660

gagcgtgcag agcaatttgt aggaaacagt ggcccatttg attacattag tgtcacccct 720

ccatatacac aagttgacta tggggtgctg atgaggcaga tatcagaatc atccttgatt 780

ggagagaaca cgtttattgt agttgagtat cctttaaaaa ctgacatgct ggattcttgt 840

ggaagtcttg taaagataac cgacagacgg tttggccgga cactcttggc aatttatgga 900

ccaacatggt cccagaataa gagatga 927

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> qGmMT1-F

<400> 5

cccctcttcg tctcttacac c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> qGmMT1-R

<400> 6

cgtcaacatc gcagccatac 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> GmActin4-F

<400> 7

gtgtcagcca tactgtcccc attt 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> GmActin4-R

<400> 8

gtttcaagct cttgctcgta atca 24

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> scGmMT-F

<400> 9

cgggggactc ttgacatggc ggttttgtcg cctcc 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> scGmMT-R

<400> 10

gtcagatcta ccatgctctt attctgggac catgt 35

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 3301-Bar-433-F

<400> 11

tgcaccatcg tcaaccacta catc 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 3301-Bar-433-R

<400> 12

gctgccagaa acccacgtca t 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> GmMT1.1-35s-F

<400> 13

acaagtctaa ccagtgacca gg 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> GmMT1.1-35s-R

<400> 14

tggcgaacag ttcatacaga 20

<210> 15

<211> 308

<212> PRT

<213> GmMT1蛋白质

<400> 15

Met Val Val Ser Ser Pro Pro Pro Phe Ser His Ser Thr Arg His Gln

1 5 10 15

Asp Arg Phe Gly Ser Pro Pro Phe Leu Phe Ser Pro Ser Ala Pro Arg

20 25 30

His Asn Leu Leu Thr Pro Leu Arg Leu Phe Pro Gln Ser Gly Asn Gly

35 40 45

Leu Ala Ser Glu Asp Lys Lys Ile Met Leu Glu Lys Tyr Gly Tyr Asp

50 55 60

Ile Asp Ala Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser Ser Ser Lys Ser Lys Arg

65 70 75 80

Arg Lys Glu Gln Pro Arg Arg Arg Gly Gly Lys Gln Val Gln Asp Pro

85 90 95

Pro Glu Asp Pro Lys Pro Pro Arg Val Thr His Lys Leu Leu Gln Val

100 105 110

Leu Gly Gly Thr Ala Arg Arg Val Lys Leu Leu Ser Pro Lys Gly Met

115 120 125

Asp Val Arg Pro Met Met Glu Val Val Lys Gly Ala Ala Phe Asp Ile

130 135 140

Leu Gln Ala Ala Gly Gly Cys Pro Ala Ala Leu Arg Pro Gly Arg Trp

145 150 155 160

Leu Asp Leu Tyr Ser Gly Thr Gly Ser Val Gly Ile Glu Ala Leu Ser

165 170 175

Arg Gly Cys Ser Gln Val His Phe Val Glu Met Asp Pro Trp Val Val

180 185 190

Ser Asp Val Leu Arg Pro Asn Leu Glu Glu Thr Gly Phe Leu Asp Ala

195 200 205

Ser Val Ile His Thr Val Arg Val Glu Lys Phe Phe Glu Arg Ala Glu

210 215 220

Gln Phe Val Gly Asn Ser Gly Pro Phe Asp Tyr Ile Ser Val Thr Pro

225 230 235 240

Pro Tyr Thr Gln Val Asp Tyr Gly Val Leu Met Arg Gln Ile Ser Glu

245 250 255

Ser Ser Leu Ile Gly Glu Asn Thr Phe Ile Val Val Glu Tyr Pro Leu

260 265 270

Lys Thr Asp Met Leu Asp Ser Cys Gly Ser Leu Val Lys Ile Thr Asp

275 280 285

Arg Arg Phe Gly Arg Thr Leu Leu Ala Ile Tyr Gly Pro Thr Trp Ser

290 295 300

Gln Asn Lys Arg

305

Claims

1.一种大豆的GmMT1基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种含有权利要求1所述的基因的载体，其特征在于，所述的载体为pCAMBIA3301-GmMT1载体。

3.如权利要求2所述的载体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为利用BstEII和BglII酶切pCAMBIA3301质粒得到pCAMBIA3301质粒的酶切产物，然后利用BstEII和BglII酶切pGEM-T-GmMT1载体得到GmMT1基因序列片段，然后利用T4 DNA连接酶将pCAMBIA3301质粒的酶切片段与GmMT1基因序列片段进行连接反应，得到pCAMBIA3301-GmMT1载体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的连接反应的体系为：T4 DNA连接酶1μL、10×T4 DNABuffer 2μL、pCAMBIA3301载体片段0.4μL、GmMT1基因序列片段4μL和ddH₂O 12.6μL。

5.权利要求1所述的基因在提高植物的根或叶片中异黄酮含量中的应用。

6.权利要求1所述的基因在提高植物的根对干旱胁迫耐受性中的应用。

7.权利要求1所述的基因在提高植物的根对盐胁迫耐受性中的应用。

8.根据权利5-7任意一项所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆和拟南芥。

9.权利要求1所述的基因在提高大豆的根对疫霉根腐病的抗性中的应用。

10.权利要求1所述的基因在提高大豆籽中异黄酮含量中的应用。