CN101376674B - 水稻黄素蛋白基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因技术领域，公开了一种水稻黄素蛋白基因及应用。所述的水稻黄素蛋白基因可用于调节作物的生长，提高作物对盐胁迫的抗性，提高作物种子的耐储藏性，延长作物种子的寿命，提高种子的发芽率等。本发明人还发现所述水稻黄素蛋白的活性和表达受到光的调控，从而调节水稻的生长。本发明的水稻黄素蛋白基因在作物耐盐、作物生长调节以及作物耐储藏育种方面具有广泛的用途。

Description

水稻黄素蛋白基因及应用

技术领域

本发明属于基因技术领域，更具体地，本发明涉及一种水稻黄素蛋白基因及应用。

背景技术

黄素蛋白基因HAL3最早在酵母中克隆发现，其控制酵母的细胞分裂、离子平衡等。植物拟南芥也发现有黄素蛋白基因AtHAL3(a，b)，在拟南芥中过量表达AtHAL3a能够提高拟南芥对Na⁺和渗透胁迫的抗性，加速拟南芥的生长，而转反义的拟南芥株系的生长比野生型缓慢，植株矮小。

对AtHAL3a和ScHAL3(酵母)氨基酸序列进行比对，发现它们有较保守的FMN(黄素单核苷酸)结合位点，即三聚体的结合位点，这暗示ScHal3和AtHAL3a具有相似的三聚体结构和功能。晶体结构分析结果表明HAL3的生物活性单位是三聚体。

前人的研究结果表明，HAL3在酵母和拟南芥的生长和耐盐性上具有重要的功能。但是，酵母和拟南芥均是与农作物(如水稻、高粱、玉米等)存在极大差异的物种。而在农作物中是否存在该种基因，以及该种基因在农作物中的功能研究还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻黄素蛋白基因及应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的OsHAL3蛋白，该蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；或

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：

(i)编码所述的OsHAL3蛋白的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。

另一方面，本发明还提供一种制备所述遗传工程化的宿主细胞的方法，所述方法包括步骤：将编码所述OsHAL3蛋白的多核苷酸或携带该多核苷酸的载体转化细胞，从而获得含有上述载体或基因组中整合有上述的多核苷酸的宿主细胞。

更佳地，所述的宿主细胞包括(但不限于)：细菌细胞、低等真核细胞、高等真核细胞。例如：大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母或植物细胞。

在本发明的第五方面，提供所述的OsHAL3蛋白或其编码基因的用途，用于调节作物的生长，提高作物对盐胁迫的抗性，提高作物种子的耐储藏性，从而还可延长作物种子的寿命，提高种子的发芽率。

在本发明的第六方面，提供一种提高作物对胁迫(如盐胁迫)的抗性或提高作物种子的耐储藏性的方法，该方法包括提高所述作物中OsHAL3基因的表达或活性。

在本发明的第七方面，提供一种改良作物的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的OsHAL3蛋白的编码序列；

(2)将作物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述OsHAL3蛋白的编码序列转入作物细胞，并且整合到作物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述OsHAL3蛋白的编码序列的作物细胞或组织；

(4)将步骤(3)中的作物细胞或组织再生成植株。

在本发明的第八方面，提供一种所述的OsHAL3或其编码基因的激动剂或拮抗剂。

在本发明的第九方面，提供一种促进作物中OsHAL3蛋白表达或活性的方法，所述的方法包括：将作物置于黑暗的环境中，或降低作物照射光中蓝光和/或白光的量。

在本发明的第十方面，提供一种抑制作物中OsHAL3蛋白表达或活性的方法，所述的方法包括：提高作物照射光中蓝光和/或白光的量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了水稻OsHAL3基因序列(A)及其编码的氨基酸序列(B)。

图2显示了水稻OsHAL3的过量表达转基因株系(OE-HAL3)的耐盐性明显比对照(空质粒)强，并且Na⁺离子浓度较低而K⁺浓度较高。其中，

图2A显示了给予120mM的NaCl培养10天(上图)和25天(下图)后，过量表达OsHAL3的转基因水稻和pHB空质粒的转基因水稻的生长情况。

图2B显示了盐处理前(上图)和盐处理7天后(下图)，过量表达OsHAL3的转基因水稻和pHB空质粒的转基因水稻中Na⁺和K⁺的含量。

图3A显示了过量表达OsHAL3的转基因株系(OE-HAL3)的种子虽然经过1-2年的储藏，其种子发芽率高达95％，而空质粒的转基因水稻对照种子的发芽率仅为25％(储藏2年的2005年种子)。

图3B显示了OsHAL3在胚中强表达。

图4显示了在黑暗条件下，OsHAL3蛋白形成三聚体而具有活性，但在蓝光条件下，OsHAL3蛋白的三聚体被解聚而没有活性。而阳性对照CRY1-CNT1形成多聚体不受光的调节。

具体实施方式

本发明人经过细致的研究和试验，首次从水稻中获得一种水稻黄素蛋白基因，本发明人将之命名为水稻HAL3基因(OsHAL3)。进一步的，本发明人对该基因进行了深入的功能研究，首次发现OsHAL3的活性和表达量受光的调控，从而控制水稻的生长；组织定位结果表明其主要在水稻幼嫩和伸长组织以及胚中表达；过量表达OsHAL3明显加快水稻生长和增加水稻的耐盐性，并且明显提高水稻种子的发芽率，显著延长水稻种子的寿命、增加种子的储藏时间。在此基础上完成本发明。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的水稻黄素蛋白”、“分离的OsHAL3蛋白”或“分离的OsHAL3多肽”是指OsHAL3蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的普通技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化OsHAL3蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括OsHAL3蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的OsHAL3蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“OsHAL3蛋白”指具有OsHAL3蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与OsHAL3蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括OsHAL3蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与OsHAL3蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗OsHAL3蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含OsHAL3蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了OsHAL3蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有OsHAL3蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供OsHAL3蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然OsHAL3蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“OsHAL3蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

 

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明OsHAL3蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码OsHAL3蛋白的多聚核苷酸。

本发明的OsHAL3蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或OsHAL3蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的OsHAL3蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码OsHAL3蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，OsHAL3蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含OsHAL3蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞(尤其是非生殖植物细胞)等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的OsHAL3蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗OsHAL3蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组OsHAL3蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激OsHAL3蛋白功能的多肽分子。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用OsHAL3蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测OsHAL3蛋白的转录产物。

本发明还涉及一种改良作物的方法，该方法包括：调节所述植物中OsHAL3基因或其同源基因的表达或活性。促进还是抑制OsHAL3的表达或活性主要取决于作物所需改良的性状而定。当需要提高作物的耐盐性、提高作物的发芽率、延长作物种子的寿命、增加作物种子的储藏时间时，可通过提高作物中OsHAL3的表达或活性来实现；当需要抑制作物生长时，可通过抑制作物中OsHAL3的表达或活性来实现。

本发明还涉及通过调节光照来调节作物(所述的作物含有OsHAL3基因)生长的方法。在黑暗条件下，OsHAL3基因能够促进作物的生长，而在蓝光下可抑制作物的生长。

增加OsHAL3基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带OsHAL3编码基因的表达构建物使植株过表达OsHAL3；或可通过用强启动子驱动从而增强OsHAL3基因或其同源基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该OsHAL3基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

抑制OsHAL3基因表达的方法也是本领域周知的。例如，可通过反义或RNA干扰(RNAi)或基因敲除的技术来实现。

作为本发明的一种优选方式，获得OsHAL3高表达的植株的方法如下：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有OsHAL3蛋白的DNA编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该OsHAL3蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述OsHAL3蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。

本发明还包括OsHAL3蛋白或其编码基因的拮抗剂或激动剂。由于OsHAL3的拮抗剂或激动剂可调节OsHAL3的活性或表达，因此，所述的OsHAL3的拮抗剂或激动剂也可通过对OsHAL3的影响来调节作物的生长、调节作物的耐盐性、调节作物的发芽率、调节作物种子的寿命、或调节作物种子的储藏时间时等，从而达到使作物性状改良的目的。

所述的OsHAL3的拮抗剂是指任何可降低OsHAL3的活性、降低OsHAL3的稳定性、下调OsHAL3的表达、减少OsHAL3有效作用时间、或抑制OsHAL3的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为调节作物生长有用的物质。

所述的OsHAL3的激动剂是指任何可提高OsHAL3的活性、维持OsHAL3的稳定性、促进OsHAL3表达、延长OsHAL3有效作用时间、或促进OsHAL3的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为提高作物的耐盐性、提高作物的发芽率、延长作物种子的寿命、增加作物种子的储藏时间时有用的物质。

在本发明的一个实例中，提供了一种OsHAL3基因，其基因序列如SEQ IDNO：1所示，编码一个含有220个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)。

本发明的主要优点在于：

首次从水稻中发现水稻黄素蛋白基因(OsHAL3)，该基因的揭示可以为水稻的生长、耐盐性、种子耐储藏性，种子发芽率等方面的改良提供新的途径，因而具有巨大的应用前景。另外，OsHAL3基因也将在其它作物包括小麦、玉米、高梁等抗逆、种子耐储藏等的育种中起重要作用。

材料和方法

(一)OsHAL3水稻转基因实验

本实施例采用来源于植物表达载体pCAMBIA3301的双元载体pHB(Mao等，Proc Natl Acad Sci USA102，12270-12275，2005)作为水稻转基因载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kan^r)、潮霉素抗性基因(Hyg^r)、除草剂抗性基因(Bar)、CaMV35S启动子、NOS基因的终止信号序列以及后两者之间的限制性内切酶克隆位点(MCS)。在限制性内切酶克隆位点可正向插入OsHAL3的cDNA构建成转基因质粒。

1.OsHAL3正义过量表达的转基因质粒构建

以水稻“中花11”品种的mRNA为模板，合成第一条链cDNA，以该DNA序列的5’端和3’端的PCR寡核苷酸为引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)，用高保真Taq酶pfu Taq进行扩增，获得OsHAL3的cDNA扩增产物。

5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-CGAAGCTTATGACTACATCAGAGTCAG-3’(SEQ ID NO：3)；

3’端寡核苷酸引物序列为：

5’-CCTGCAGTCAGCTAGATGGGAGGTTTC-3’(SEQ ID NO：4)。

将上述扩增产物通过HindIII和PstI限制性酶切重组连接到载体pHB，并对多个重组子进行测序，以验证序列的正确性。

连接物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有Kan(50μg/ml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用HindIII和PstI酶解挑选出有约0.6Kb片段插入的克隆，并用该基因对应的引物(SEQ ID NO：3和SEQID NO：4)测序检验核苷酸序列是否正确。这样成功构建pHB-35S-OsHAL3质粒(即OE-HAL3质粒)。

2.OsHAL3转化水稻

上述pHB-35S-OsHAL3重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105(参见Hood，E.E.等，Transgenic Res.，1993，2，208-218)。每200μl EHA105感受态细胞加0.5-1μg(约10μl)质粒DNA混匀，依次于冰上、液氮和37℃水浴中各放置5分钟；用新鲜的YEB液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4小时；取200μl涂布于含抗生素Kan(50μg/ml)的YEB平板上，28℃培养2-3天。长出的菌落在含抗生素的YEB平板上划单菌，连续划3次。从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD₆₀₀为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻中花11的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的中花11未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中(与水1:3混合，加2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D₂培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D₂C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌Vir基因活化物，使用浓度为100μmol/L。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入选择培养基N6D₂S1(Hyg25mg/l)进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到N6D₂S2(Hyg50mg/l)选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS₀H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。

获得的再生植株移栽成活后以除草剂再次筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。

3.盐胁迫试验

对OsHAL3转化水稻T2代进行盐胁迫，即在转基因植物的培养液中加入NaCl至终浓度120mM，观察植株在盐处理前以及盐处理7天、10天、25天后的耐盐性表型，以转入pHB质粒(空质粒)的转基因水稻为对照。并且，检测盐处理前后植物中Na⁺和K⁺的含量和比例。

4.种子出芽试验

在制备了OsHAL3过表达的转基因植物后，收获其种子，将其种子储藏1-2年(陈年种子)，然后检测种子的发芽率，研究OsHAL3基因功能。即将陈年水稻种子置于含水的培养皿中，置30℃培养3天后，观察出芽情况，统计出芽比例；并且，以相同条件下储藏1-2年的转入pHB质粒(空质粒)的转基因水稻种子或野生型“中花11”水稻种子的出芽情况作为对照。

5.OsHAL3的组织表达特异性

以水稻基因组DNA为模板，扩增OsHAL3基因起始密码子前1534bp，常规方法在扩增产物的两端引入Sal1和Pst1酶切位点，用Sal1和Pst1酶切后连接到经过同样酶切的pCAMBIA1300GN(pCAMBIA1300购自CAMBIA公司，常规方法在pCAMBIA1300载体的多克隆位点的末端加入报告基因GUS，构成pCAMBIA1300GN)载体上，用农杆菌转化方法转入“中花11”品种中，获得转基因植株。将获得的阳性转基因植株各个部位放入GUS染色液中37℃放置2小时左右，观察各个部位的染色情况。OsHAL3基因除了在根尖和茎的分生组织以及分裂旺盛的幼嫩组织中表达，还在种子的胚中有很高表达(图3B)。

(二)OsHAL3蛋白质分析实验

1、抗体制备

以水稻“中花11”品种的mRNA为模板，以下列序列为引物(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)，PCR扩增获得OsHAL3cDNA扩增产物。

5’端寡核苷酸引物序列为：

5’CCGCGAATTCATGACTACATCAGAGTCAG3’(SEQ ID NO：5)；

3’端寡核苷酸引物序列为：

5’CCGCCTCGAGCGCTAGATGGGAGGTTTCTG3’(SEQ ID NO：6)。

扩增产物用EcoR I和Xho I酶切后重组连接到pET32a(+)的相应酶切位点中。将重组有OsHAL3的原核表达载体pET32a(+)转化入大肠杆菌BL21，IPTG诱导原核表达，然后用His-tag柱(珠)纯化蛋白，常规方法免疫兔子，从而获得抗OsHAL3的抗体。

2、检测抗体效价

采用常规的Western印迹法检测OsHAL3过量表达的表达量，并同时以未转化亲本、空质粒及反义转基因植株作为负对照，OsHAL3原核表达蛋白作为正对照。

3、检测水稻HIS-OsHAL3融合蛋白对光谱的吸收

将重组有OsHAL3全长cDNA的原核表达载体pET32a(+)(购自Novagen)转化入大肠杆菌BL21中，IPTG、低温(12℃)诱导原核表达，利用Ni-柱采用非变性的方法从原核表达细菌中提取活性蛋白，以等体积的洗脱液为空白对照，用Beckman DU640核酸&蛋白分析仪扫描此蛋白在300～800nm范围内的吸收峰值。该蛋白的吸收峰在蓝光区有两个吸收峰与FMN(黄素单核苷酸)的吸收峰一致。表明OsHAL3具有蓝光吸收特性。

实施例1 水稻黄素蛋白基因

经鉴定，水稻黄素蛋白基因OsHAL3的全长ORF为663个核苷酸，编码220个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或见图1B；其核苷酸序列如SEQID NO：1所示或见图1A。

实施例2 OsHAL3基因对于水稻耐盐性的影响

将OsHAL3基因按正义方向置于CaMV35S启动子的控制下，构建到水稻表达载体pHB上；接着，通过农杆菌介导法将其导入水稻品种“中花11”中。

对阳性转化植株进行盐胁迫分析表明，过量表达OsHAL3基因导致转基因水稻株系的耐盐性明显提高，这是由于转基因株系的Na⁺离子显著下降而K⁺离子显著增加引起的，见图2。

由图2A和图2B可见，给予120mM的NaCl培养10天后，过量表达OsHAL3的转基因水稻生长基本正常，而pHB空质粒的转基因水稻生长不佳，叶子枯萎较为严重；在培养25天后，过量表达OsHAL3的转基因水稻尽管叶子有所损害，但还处于存活状态，然而pHB空质粒的转基因水稻已处于枯死状态。

上述结果明确表明，OsHAL3基因在水稻耐盐过程中起着重要的作用，有良好的应用前景。

实施例3 OsHAL3基因提高水稻种子耐储藏性

过量表达OsHAL3基因转基因株系的种子虽然经过2年的储藏，其种子发芽率高达95％，而pHB空质粒的转基因水稻或野生型对照种子的发芽率仅为25％，见图3A。

这明确表明OsHAL3基因在水稻种子耐储藏过程中起着重要的作用，有重要应用前景。

实施例4 OsHAL3基因的组织表达

采用GUS染色的方法，本发明人鉴定了OsHAL3基因在水稻组织中的表达情况。结果发现，该基因在水稻幼嫩和伸长组织以及水稻种子的胚乳中表达(见图4B)。

实施例5 OsHAL3蛋白的活性和表达量受光的调控

本发明人发现一个非常值得关注的结果，OsHAL3蛋白的活性和表达量受光的调控，从而控制水稻的生长。经确定OsHAL3蛋白的活性形式是三聚体。本发明人通过酵母双杂交实验发现OsHAL3蛋白的多聚化是受光调控的。具体实验如下：

用以下引物扩增水稻获得OsHAL3的cDNA产物，用EcoRI和BamHI酶切后分别连入在pEG202载体(ClonTech，作为诱饵载体)和pJG4-5载体(ClonTech，作为捕获载体)上。

5’CCGCGAATTCATGACTACATCAGAGTCAG3’(SEQ ID NO：7)；

5’CCGCGGATCCGCTAGATGGGAGGTTTCTG3’(SEQ ID NO：8)。

将上述载体转化酵母EGY48(购自Clontech公司)后，在SD/Xgal培养基中生长。

结果发现，在黑暗中，OsHAL3蛋白可以发生多聚化，启动酵母中半乳糖苷酶的活性，使生长在SD/Xgal培养基中的菌落变蓝，OsHAL3蛋白的多聚化也能启动酵母体内亮氨酸的合成，将转化后的酵母稀释四个梯度后(10⁰，10^-1，10^-2，10^-3)仍能在SD/-Leu的培养基中生长；而在蓝光、红光和远红光下，该蛋白的多聚化受到抑制。在实验中，用已知多聚化不受光影响的CRY1蛋白和其N端-CNT1(参见Sang，Y.等，Plant Cell17，1569-1584(2005))作为对照(图4)。结果表明OsHAL3蛋白黑暗中具有活性，但在蓝光(或白光)条件下，OsHAL3蛋白的三聚体被解聚而没有活性，见图4。

另外，用Westhern Blot方法检测到在黑暗条件下OsHAL3蛋白表达量增加，而在蓝光(或白光)条件下OsHAL3蛋白表达量受到抑制。

因此，在黑暗条件下OsHAL3促进水稻生长，而在蓝光条件下OsHAL3抑制水稻生长。

实施例6 OsHAL3蛋白变体的功能

采用常规的基因技术，本发明人将SEQ ID NO：2所示的OsHAL3氨基酸序列的第217位Leu替换为Ile，构成OsHAL3蛋白变异体(OsHAL3-M)。如前所述类似的方法，利用农杆菌制备转入了OsHAL3-M基因且能够高表达OsHAL3-M的转基因水稻，测定该转基因水稻的生长情况、耐盐性、种子储藏时间，发现高表达OsHAL3-M的转基因植物也具有生长快、耐盐性好、种子储藏时间长的特点；并且，其表达量和活性也受光的调控。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>水稻黄素蛋白基因及应用

<130>074503

<160>8

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>663

<212>DNA

<213>稻属(Oryza sativa L.)

<400>1

<210>2

<211>220

<212>PRT

<213>稻属(Oryza sativa L.)

<400>2

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

Claims (5)

1.OsHAL3蛋白或其编码基因的用途，其特征在于，用于提高水稻种子的耐储藏性；所述的OsHAL3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的OsHAL3蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种提高水稻种子的耐储藏性的方法，其特征在于，该方法包括提高所述水稻中OsHAL3蛋白的表达或活性；所述的OsHAL3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有OsHAL3蛋白的编码序列；

(2)将水稻细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述OsHAL3蛋白的编码序列转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述OsHAL3蛋白的编码序列的水稻细胞或组织；

(4)将步骤(3)中的水稻细胞或组织再生成植株。

4.一种促进OsHAL3蛋白表达或活性的方法，其特征在于，所述的方法包括：将水稻置于黑暗的环境中；所述的OsHAL3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种抑制OsHAL3蛋白表达或活性的方法，其特征在于，所述的方法包括：提高水稻照射光中蓝光的量；所述的OsHAL3蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

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