CN100429311C - 高抗草苷膦的epsp合成酶及其编码序列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(简称为“EPSP合成酶”)，编码EPSP合成酶的多核苷酸和经重组技术产生这种EPSP合成酶的方法。本发明还公开了编码这种EPSP合成酶的多核苷酸的用途。

Description

高抗草苷膦的EPSP合成酶及其编码序列
技术领域
本发明属于生物学领域，具体地说，本发明涉及从采用免培养技术构建的群落水平DNA库中分离的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合成酶)基因及其蛋白产物。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种具有抗草甘膦抗性的酶。
背景技术
草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，其作用机制是通过抑制植物体内5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，干扰植物体内芳香族氨基酸的生物合成，导致植物死亡。
应用化学诱变细菌产生的aroA突变体，抗药性机理研究确证了aroA基因是草甘膦作用靶标EPSP合成酶的编码基因。近年来包括美国和中国在内的国家草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦品种的选育和大面积的推广有直接的关系。美国Mosanto和Calegene等公司在EPSP合成酶的编码基因aroA及其抗草甘膦转基因植物等方面已申请了100余份专利，获得转基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品种，其中大豆等多种转基因作物已进入商品化生产。
我国在转基因抗草甘膦作物方面的研究已取得一定进展，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。同时，由于没有配套出口转基因抗除草剂种子的优势和抗草甘膦基因专利，与国外大公司在市场销售竞争中处于极为不利的地位。
因此，本领域迫切需要开发新的抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(简称为“EPSP合成酶”)以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在提高植物抗草甘膦抗性方面的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的EPSP合成酶多肽，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合成酶活性的由(a)衍生的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：(a)编码上述EPSP合成酶多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中40-1371位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-1500位的序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。在本发明的第五方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。
在本发明的第六方面，提供了一种改变植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合成酶DNA编码序列，所述的EPSP合成酶选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合成酶活性的由(a)衍生的多肽；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使EPSP合成酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入EPSP合成酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次从从采用免培养技术构建的群落水平DNA库中分离获得了新的EPSP合成酶，并且通过实验证实了它具有高抗草甘膦抗性，并且转入植物后，可导致植物抗草甘膦抗性的提高。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“EPSP合成酶”、“EPSP多肽”或“5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶”可互换使用，都指具有5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合成酶。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的EPSP合成酶或多肽”是指EPSP多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EPSP合成酶。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括EPSP合成酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然EPSP合成酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“EPSP多肽”指具有EPSP合成酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与EPSP合成酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括EPSP合成酶的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与EPSPS DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗EPSP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EPSP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了EPSP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有EPSP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供EPSP合成酶或多肽的类似物。这些类似物与天然EPSP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。
在本发明中，“EPSP合成酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
  最初的残基   代表性的取代   优选的取代
  Ala(A)   Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)   Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)   Gln；His；Lys；Arg   Gln
  Asp(D)   Glu   Glu
  Cys(C)   Ser   Ser
  Gln(Q)   Asn   Asn
  Glu(E)   Asp   Asp
  Gly(G)   Pro；Ala   Ala
  His(H)   Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)   Leu；Val；Met；Ala；Phe   Leu
  Leu(L)   Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)   Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)   Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)   Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Leu
  Pro(P)   Ala   Ala
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser  Phe
  Val  (V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala  Leu
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EPSP合成酶的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的EPSPS核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、PCR扩增法、或重组法的方法获得。例如首先根据SEQ ID NO：1的序列进行全序列合成。
对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用人工合成的EPSPS核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或EPSP合成酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的EPSP多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码EPSP多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，EPSP合成酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含EPSP合成酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗草甘膦抗性提高的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
另一方面，本发明还包括对EPSP合成酶DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与EPSP合成酶基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制EPSP合成酶的分子，也包括那些并不影响EPSP合成酶功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的EPSP合成酶基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的EPSP合成酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达EPSP合成酶或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用EPSP合成酶基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与EPSP合成酶基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗EPSP合成酶的抗体可用于检测样品中的EPSP合成酶。
多克隆抗体的生产可用EPSP合成酶或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明还涉及定量和定位检测EPSP合成酶水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。
一种检测检测样品中是否存在EPSP合成酶的方法是利用EPSP合成酶的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与EPSP合成酶特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EPSP合成酶。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因的表达分析。用EPSP合成酶特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测EPSP合成酶的转录产物。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从采用免培养技术构建的群落水平DNA库中分离的并人工全合成的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1500个碱基，其开放读框位于40-1371位，编码全长为444个氨基酸的EPSP合成酶(SEQ ID NO：2)。
本发明的EPSP合成酶具有如下特性：A)草苷膦抗性功能明确，且显示了高于以前报道5-10倍的抗草苷膦能力；B)结构新，在核酸水平上与已见报道的EPSP合成酶编码基因无任何同源性，在氨基酸水平上与根瘤脓杆菌C58的同源性为60.79％，与Monsanto公司专利报道的根瘤脓杆菌CP4的同源性为24.53％，且不含有专利保护序列和突变位点。
EPSP合成酶为改变植物的抗草甘膦抗性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以通过将EPSP合成酶的编码基因导入，改变现有优良农作物品种的抗草甘膦抗性，可获得抗草甘膦的小麦、水稻或其它农作物品种，解决农业生产中存在的实际问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：高抗草苷膦的DNA片段克隆
1、草苷膦极端污染环境中土壤样品的采集
自然环境中特别是在长期使用草甘膦等除草剂地区的土壤中，存在种类繁多的能耐受草甘膦或其它除草剂的细菌菌株。从被50％左右草苷膦污染达十年以上的土壤中(河北奇峰化工有限公司草甘膦生产工厂开放式分装点)采集样品。
2、采用免培养方法从草苷膦极端污染土壤样品中分离群落水平总DNA
称取草苷膦污染土壤样品2克，加入0.6g细玻璃珠(d＜0.11mm)，4000转/分振荡2次。加入300μl 2％SDS+12％苯酚Tris缓冲液(pH8.0)溶液冰上1小时，加入等量苯酚Tris缓冲液，pH8.0(约700ml)，充分混匀，经4℃，13,000rpm离心5分钟。上层溶液加入0.1倍体积的3M NaAc pH5.2，混匀后加入0.6倍体积异丙醇混匀。DNA沉淀溶于200μl 1xTE(粗DNA)。称100mg氯化铯置于一个新的1.5ml Epp.离心管中，加入100μl粗DNA轻轻混匀，室温黑暗条件下静置1-3小时。室温，13,000rpm，离心20分钟。上清液中加入400μl无菌去离子水和300μl异丙醇，室温静置30分钟。室温，13,000rpm，离心20分钟。沉淀溶于100μl 1xTE和40μl 8M醋酸钾(KAc)，室温静置15分钟。4℃，13,000rpm离心15分钟。上清液加入0.6倍体积异丙醇混匀。室温静置30分钟。室温，15,000rpm离心20分钟。DNA沉淀溶于100μl 1xTE。采用Wizard spin column clean-up分离试剂盒纯化DNA样品。纯化DNA溶于总体积为100μl的10mMTris-EDTA(pH8.0)缓冲液中。
3、群落水平总DNA粘粒文库的构建
采用粘粒SuperCosl Cosmid Vector Kit(购自Stratagene公司)构建群落水平总DNA的粘粒文库。采用0.006u/μg DNA的Sau3A I酶量大量酶切纯化的群落水平总DNA，冻融法回收40kb左右的部分酶切片段，与载体SuperCosl/BamH1片段连接。按公司提供的试剂盒说明书构建粘粒文库。由于本实验要筛选草甘膦抗性克隆，而草甘膦只能在限制型培养基(如M9、MOPS)上起作用，因此本实验采用能在限制性培养基上生长的大肠杆菌JM109作为受体菌株，将群落水平总DNA片段与载体的连接产物用噬菌体包装蛋白包装后，转入大肠杆菌JM109中。将转染的大肠杆菌JM109涂布于四环素抗性LB固体培养基上，将长出的菌落分别点于四环素抗性和四环素加卡那霉素抗性的LB固体培养基上，在两种抗性培养基上生长的转化子为粘粒载体自连转化，减去背景菌落数，根据经验公式计算滴度(pfu/ml)为4×106(大于106)，表明文库构建符合要求。
4、筛选草甘膦抗性转化子
将转染细菌涂布于加入磷酸盐和10mM草甘膦的MOPS固体培养基上，两天后生长出十余个菌落，用无菌牙签点于含有不同浓度草甘膦的MOPS固体培养基上，挑选出一个抗性最高的克隆pGR1，可以耐受60mM草甘膦，提取这个克隆的质粒，电激法将pGR1和载体质粒pLA2917转回大肠杆菌JM109中，将转化子用无菌牙签点于含20mM草甘膦的MOPS固体培养基上检验抗性，结果证明这个克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性，表明抗草甘膦特性确实是由于转入pGR1引起的。
5.高抗草苷膦的DNA片段的亚克隆及抗性验证
将草甘膦抗性克隆质粒pGR1用限制性内切酶HindIII、PstI、HindIII+PstI消化与克隆载体质粒(pBlueScriopt KS，pGEM-3zf)连接，转化大肠杆菌JM109，涂布于含Amp的LB固体培养基上，挑取白色菌落煮沸法提质粒筛选不同的重组子，并在含有20mM草甘膦的MOPS固体培养基上筛选抗性亚克隆，得到一个抗草甘膦亚克隆pGRH1。提取质粒后重新转化大肠杆菌JM109，以载体质粒为阴性对照。
结果表明，这个亚克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性，这证明抗草甘膦特性确实是由于转入pGRH1引起的。
酶切分析表明，所亚克隆的高抗草苷膦DNA片段大小为2.4kb。将OD值相同的pGR1、pGRH1和载体对照pGEM-3zf菌液以1％的接种量分别接种于含有50mM、150mM草甘膦的MOPS液体培养基中，37℃振荡培养24小时，于600nm波长测定OD值，EPSP合成酶的克隆pGR1及亚克隆pGRH1均能耐受150mM浓度的草甘膦，生长状况良好，而载体对照不能生长。
实施例2：高抗草苷膦的DNA片段的序列分析及其EPSP合成酶功能验证
1、高抗草苷膦的DNA片段的序列分析
对实施例1中所亚克隆的高抗草苷膦DNA片段进行全核苷酸序列测定。分析结果表明，其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1500个碱基，其开放读框位于40-1371位，编码全长为444个氨基酸的EPSP合成酶(SEQID NO：2)。
将所亚克隆的高抗草苷膦编码序列与已报道的EPSP合成酶编码基因(aroA)比较，在核苷酸水平几乎没有任何同源性。
氨基酸序列同源性分析结果表明，与已知的ClassI EPSP合成酶(来源于大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等)氨基酸同源性同源性并不高，与大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌来源的EPSP合成酶氨基酸同源性分别为30.4％和31.7％。与Monsanto公司专利报道的根癌农杆菌CP4的EPSP合成酶同源性为24.53％，且没有发生80-120(-L-G-N-A-A-T-A)的氨基酸取代，与170-210(-A-L-L-M-x.sub.1-A-P-L-T-)的序列也不同。与之同源性最高的是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58，同源性为60.79％，与同一属的鼻疽假单胞菌的EPSP合成酶同源性为20.53％。
2、高抗草苷膦的DNA片段的EPSP合成酶功能验证
序列分析结果显示抗性克隆中含有EPSP合成酶的ORF，为了证实其具有EPSP合成酶活性，本实验以大肠杆菌EPSP合成酶缺陷型菌株ER2799为受体菌株，采用CaCl2法将草甘膦抗性亚克隆pGRH1转入，用无菌牙签将转化子菌落点于MOPS固体培养基上，受体菌株ER2799、含有载体质粒(pBuleScript KS、pGEM-3zf)的ER2799为阴性对照，如抗草甘膦亚克隆含有可表达的EPSP合成酶基因，互补了受体菌的缺陷，则能够利用限制性培养基的无机物合成氨基酸并生长，否则就不能生长。
试验结果表明，草甘膦抗性亚克隆R3H1和R7H1中所含的DNA片段均能在功能上互补EPSP合成酶缺陷型菌株，因此，可以确定亚克隆pGRH1中含有完整功能的EPSP合成酶基因。
实施例3：高抗草苷膦的EPSP合成酶基因的人工合成
根据已完成的含1335编码区的核苷酸序列，首先分8个区段分别根据正链和副链序列，分别合成出长度约150-200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链各一一对应的8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火，形成8个带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段，经T4DNA连接酶催化组装成一个完整的EPSP合成酶基因。该合成的DNA片段含有SEQ ID NO：1中40-1374位的核苷酸序列，并且合成基因的两端含XbaI和SacI位点。
将上述人工合成的5’和3’端酶切位点为XbaI和SacI位点EPSP基因，用于下面高抗草苷膦的EPSP合成酶基因植物表达载体的构建。
实施例4：高抗草苷膦的EPSP合成酶基因植物表达载体的构建
高抗草苷膦的EPSP合成酶基因植物表达载体构建的具体方法如下：
A.pBI121(ClonTech公司)和pCAMBIA2301(ClonTech公司)用HindIII和EcoRI双酶切，将pBI121带有p35S-GUS-Nos-ter的片段连入pCAMBIA2301，形成中间载体p35S-2301-GUS；
B.用XbaI和SacI双切p35S-2301-GUS和上述人工合成的EPSP基因，用EPSP置换p35S-2301-GUS相应酶切位点的GUS，从而获得高抗草苷膦的EPSP合成酶基因植物表达载体。再将其转入农杆菌中，用于转化模式植物烟草。
实施例5：利用叶盘法转化构建抗草苷膦的转基因烟草
(1)用无菌牙签挑取YPE选择平板上的实施例5中制备的阳性克隆，接种于2MLYPE液体(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；
(2)室温下4,000g离心10分钟；
(3)弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌体的OD600在0.5左右；
(4)取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1cm2见方的小叶片；
(5)将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5分钟，在无菌滤纸上吸干菌液；把经浸染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；
(6)将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/l+NAA 0.1mg/l+Kan 50mg/l+羧苄青霉素250mg/l)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；
(7)约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/l+Kan 25mg/l)上进行生根培养，2-7天左右生根；
(8)待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着着的固体培养基，移入土壤中，刚开始几天用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，转移至在含10mM的草苷膦的固体培养基中筛选草苷膦抗性的植株。
(9)抗性植株经Southern、Northern杂交以及Westhem blot验证为转基因的抗性植株。
(10)在温室中经草甘膦抗性梯度实验证明，转基因植物能在含15mM草甘膦的培养基上良好生长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>四川禾本生物工程有限公司
     中国农业科学院生物技术研究所
<120>高抗草苷膦的EPSP合成酶及其编码序列
<130>033655
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1500
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(40)..(1371)
<223>EPSP合成酶编码序列
<400>1
ctcctacagt tagggcaagt cccccaccac tcgacaagc atg gcg tgt ttg cct     54
                                           Met Ala Cys Leu Pro
                                           1               5
gat gat tcg ggt ccg cat gtc ggc cac tcc acg cca cct cgc ctt gac    102
Asp Asp Ser Gly Pro His Val Gly His Ser Thr Pro Pro Arg Leu Asp
                10                  15                  20
cag gag cct tgt acc ttg agt tcg cag aaa acc gtg acc gtt aca ccg    150
Gln Glu Pro Cys Thr Leu Ser Ser Gln Lys Thr Val Thr Val Thr Pro
            25                  30                  35
ccc aac ttc ccc ctc act ggc aag gtc gcg ccc ccc ggc tcc aaa tcc    198
Pro Asn Phe Pro Leu Thr Gly Lys Val Ala Pro Pro Gly Ser Lys Ser
        40                  45                  50
att acc aac cgt gcg ctg ttg ctg gcg gca ttg gcc aag ggc acc agc    246
Ile Thr Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Lys Gly Thr Ser
    55                  60                  65
cgt ttg agc ggt gcg ctc aaa agc gat gac acg cgc cac atg tcg gtc    294
Arg Leu Ser Gly Ala Leu Lys Ser Asp Asp Thr Arg His Met Ser Val
70                  75                  80                  85
gcc ctg cgg cag atg ggc gtc acc atc gac gag ccg gac gac acc acc    342
Ala Leu Arg Gln Met Gly Val Thr Ile Asp Glu Pro Asp Asp Thr Thr
                90                  95                  100
ttt gtg gtc acc agc caa ggc tcg ctg caa ttg ccg gcc cag ccg ttg    390
Phe Val Val Thr Ser Gln Gly Ser Leu Gln Leu Pro Ala Gln Pro Leu
            105                 110                 115
ttc ctc ggc aac gct ggc acc gcc atg cgc ttt ctc acg gct gcc gtg    438
Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Phe Leu Thr Ala Ala Val
        120                 125                 130
gcc acc gtg caa ggc acc gtg gta ctg gac ggc gac gag tac atg caa    486
Ala Thr Val Gln Gly Thr Val Val Leu Asp Gly Asp Glu Tyr Met Gln
    135                 140                 145
aaa cgc ccg att ggc ccg ctg ctg gct acc ctg ggc cag aac ggc atc    534
Lys Arg Pro Ile Gly Pro Leu Leu Ala Thr Leu Gly Gln Asn Gly Ile
150                 155                 160                 165
cag gtc gac agc ccc acc ggt tgc cca ccg gtc acc gtg cac ggc atg    582
Gln Val Asp Ser Pro Thr Gly Cys Pro Pro Val Thr Val His Gly Met
                170                 175                 180
ggc aag gtc cag gcc aag cgt ttc gag att gat ggt ggt ttg tcc agc    630
Gly Lys Val Gln Ala Lys Arg Phe Glu Ile Asp Gly Gly Leu Ser Ser
            185                 190                 195
cag tac gta tcg gcc ctg ctg atg ctc gcg gcg tgc ggc gaa gcg ccg    678
Gln Tyr Val Ser Ala Leu Leu Met Leu Ala Ala Cys Gly Glu Ala Pro
        200                 205                 210
att gaa gtg gcg ctg acc ggc aag gat atc ggt gcc cgt ggc tac gtg    726
Ile Glu Val Ala Leu Thr Gly Lys Asp Ile Gly Ala Arg Gly Tyr Val
    215                 220                 225
gac ctg acc ctc gac tgc atg cgt gcc ttc ggg gcc cag gtg gac gcc    774
Asp Leu Thr Leu Asp Cys Met Arg Ala Phe Gly Ala Gln Val Asp Ala
230                 235                 240                 245
gtg gac gac acc acc tgg cgc gtc gcc ccc acc ggc tat acc gcc cat    822
Val Asp Asp Thr Thr Trp Arg Val Ala Pro Thr Gly Tyr Thr Ala His
                250                 255                 260
gat tac ctg atc gaa ccc gat gcg tcc gcc gcc acg tat ttg tgg gcc    870
Asp Tyr Leu Ile Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Leu Trp Ala
            265                 270                 275
gca gaa gtg ctg acc ggt ggg cgt atc gac atc ggc gta gcc gcg cag    918
Ala Glu Val Leu Thr Gly Gly Arg Ile Asp Ile Gly Val Ala Ala Gln
        280                 285                 290
gac ttc acc cag ccc gac gcc aag gcc cag gcc gtg att gcg cag ttc    966
Asp Phe Thr Gln Pro Asp Ala Lys Ala Gln Ala Val Ile Ala Gln Phe
    295                 300                 305
ccg aac atg caa gcc acg gtg gta ggc tcg caa atg cag gat gcg atc    1014
Pro Asn Met Gln Ala Thr Val Val Gly Ser Gln Met Gln Asp Ala Ile
310                 315                 320                 325
ccg acc ctg gcg gtg ctc gcc gcg ttc aac aac acc ccg gtg cgt ttc    1062
Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe Asn Asn Thr Pro Val Arg Phe
                330                 335                 340
act gaa ctg gcg aac ctg cgc gtc aag gaa tgt gac cgc gtg cag gcg    1110
Thr Glu Leu Ala Asn LeuArg Val Lys Glu Cys Asp Arg Val Gln Ala
            345                 350                 355
ctg cac gat ggc ctc aac gaa att cgc ccg ggc ctg gcg acc atc gag    1158
Leu His Asp Gly Leu Asn Glu Ile Arg Pro Gly Leu Ala Thr Ile Glu
        360                 365                 370
ggc gat gac ctg ctg gtc gcc agc gac ccg gcc ctg gca ggc acc gcc    1206
Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Ser Asp Pro Ala Leu Ala Gly Thr Ala
    375                 380                 385
tgc acc gca ctg atc gac acc cac gcc gac cat cgc atc gcc atg tgc    1254
Cys Thr Ala Leu Ile Asp Thr His Ala Asp His Arg Ile Ala Met Cys
390                 395                 400                 405
ttt gcc ctg gcc ggg ctt aaa gtc tcg ggc att cgc att caa gac ccg    1302
Phe Ala Leu Ala Gly Leu Lys Val Ser Gly Ile Arg Ile Gln Asp Pro
                410                 415                 420
gac tgc gtg gcc aag acc tac cct gac tac tgg aaa gcc tgg ccc agc    1350
Asp Cys Val Ala Lys Thr Tyr Pro Asp Tyr Trp Lys Ala Trp Pro Ser
            425                 430                 435
ctg ggc gtt cac cta aac gac tgacacacaa aacctgtagc agagcttgct       1401
Leu Gly Val His Leu Asn Asp
        440
cgcgaaaaac gcacacgtgc cgcgtttgtt caggaaacac gcgttatcgt tgacgtttat  1461
cgagctaagc tcgctcctac attttgcagc gagatcttg                         1500
<210>2
<211>444
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(444)
<223>EPSP合成酶
<400>2
Met Ala Cys Leu Pro Asp Asp Ser Gly Pro His Val Gly His Ser Thr
1               5                   10                  15
Pro Pro Arg Leu Asp Gln Glu Pro Cys Thr Leu Ser Ser Gln Lys Thr
            20                  25                  30
Val Thr Val Thr Pro Pro Asn Phe Pro Leu Thr Gly Lys Val Ala Pro
        35                  40                  45
Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu
    50                  55                  60
Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Ser Gly Ala Leu Lys Ser Asp Asp Thr
65                  70                  75                  80
Arg His Met Ser Val Ala Leu Arg Gln Met Gly Val Thr Ile Asp Glu
                85                  90                  95
Pro Asp Asp Thr Thr Phe Val Val Thr Ser Gln Gly Ser Leu Gln Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Gln Pro Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Phe
        115                 120                 125
Leu Thr Ala Ala Val Ala Thr Val Gln Gly Thr Val Val Leu Asp Gly
    130                 135                 140
Asp Glu Tyr Met Gln Lys Arg Pro Ile Gly Pro Leu Leu Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Gly Gln Asn Gly Ile Gln Val Asp Ser Pro Thr Gly Cys Pro Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val His Gly Met Gly Lys Val Gln Ala Lys Arg Phe Glu Ile Asp
            180                 185                 190
Gly Gly Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala Leu Leu Met Leu Ala Ala
        195                 200                 205
Cys Gly Glu Ala Pro Ile Glu Val Ala Leu Thr Gly Lys Asp Ile Gly
    210                 215                 220
Ala Arg Gly Tyr Val Asp Leu Thr Leu Asp Cys Met Arg Ala Phe Gly
225                 230                 235                 240
Ala Gln Val Asp Ala Val Asp Asp Thr Thr Trp Arg Val Ala Pro Thr
                245                 250                 255
Gly Tyr Thr Ala His Asp Tyr Leu Ile Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala
            260                 265                 270
Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Glu Val Leu Thr Gly Gly Arg Ile Asp Ile
        275                 280                 285
Gly Val Ala Ala Gln Asp Phe Thr Gln Pro Asp Ala Lys Ala Gln Ala
    290                 295                 300
Val Ile Ala Gln Phe Pro Asn Met Gln Ala Thr Val Val Gly Ser Gln
305                 310                 315                 320
Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe Asn Asn
                325                 330                 335
Thr Pro Val Arg Phe Thr Glu Leu Ala Asn Leu Arg Val Lys Glu Cys
            340                 345                 350
Asp Arg Val Gln Ala Leu His Asp Gly Leu Asn Glu Ile Arg Pro Gly
        355                 360                 365
Leu Ala Thr Ile Glu Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Ser Asp Pro Ala
    370                 375                 380
Leu Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Leu Ile Asp Thr His Ala Asp His
385                 390                 395                 400
Arg Ile Ala Met Cys Phe Ala Leu Ala Gly Leu Lys Val Ser Gly Ile
                405                 410                 415
Arg Ile Gln Asp Pro Asp Cys Val Ala Lys Thr Tyr Pro Asp Tyr Trp
            420                 425                 430
Lys Ala Trp Pro Ser Leu Gly Val His Leu Asn Asp
        435                 440

Claims (10)

1.一种分离的EPSP合成酶多肽，其特征在于，该多肽选自下组：
(a)SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合成酶活性的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：
(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：
(a)SEQ ID NO：1中40-1371位的序列；
(b)SEQ ID NO：1中1-1500位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种具有EPSP合成酶活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出具有EPSP合成酶活性的多肽。
9.一种改变植物抗草甘膦抗性的方法，其特征在于，它包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合成酶DNA编码序列，所述的EPSP合成酶选自下组：
(a)SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合成酶活性的由(a)衍生的多肽；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使EPSP合成酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入EPSP合成酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的EPSP合成酶是氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽。
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