CN102645535B - 检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其专用酶联免疫试剂盒 - Google Patents
检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其专用酶联免疫试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明所提供的酶联免疫试剂盒中含有独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的单克隆抗体；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9；所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株AntiG2-5F11 CGMCC No.5772产生。利用本发明所提供的酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测玉米等转基因植物中耐草甘膦蛋白G2-aroA的表达情况，具有快速、灵敏、特异性强的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
背景技术
草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，它通过抑制EPSPS(5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的一个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，强烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来，得到了广泛的应用。但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入作物，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护作物免受药害，最终达到增产增收的目的。
目前，国际上在耐草甘膦转基因植物的研究方面，已经取得了突破性进展。美国孟山都(Mosanto)和Calegene等公司在基于对EPSP合成酶的编码基因aroA的研究，已获得耐草甘膦转基因大豆、玉米、油菜和棉花等作物系列品种，其中大豆等多种转基因作物已经进入商品化生产。Mosanto公司生产的耐草甘膦二型转基因玉米在2007年的播种面积预计超过3200万英亩，相当于美国玉米播种面积的40％。2004年，中国农业科学院生物技术研究所发现了一个新的耐草甘膦基因G2-aroA(中国专利，申请号03826892.2，授权公告号CN 100429311C)。目前尚没有抗G2-aroA蛋白的单克隆抗体，也未见利用G2-aroA蛋白单克隆抗体鉴别转G2-aroA基因植物的相关报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的酶联免疫试剂盒。
本发明所提供的酶联免疫试剂盒中含有独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的单克隆抗体；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9；所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株AntiG2-5F11产生；所述杂交瘤细胞株AntiG2-5F11在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5772。
所述酶联免疫试剂盒中还含有分别独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的多克隆抗体和/或所述G2-aroA蛋白标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；所述多克隆抗体是以所述G2-aroA蛋白为免疫原免疫脊椎动物得到的。
在本发明的一个实施例中，所述多克隆抗体具体是以所述G2-aroA蛋白为免疫原免疫家兔(体重约2kg的新西兰大耳白兔)得到的。所述G2-aroA蛋白标准品可为G2-aroA蛋白或由所述G2-aroA蛋白配制成的一系列不同浓度的G2-aroA蛋白溶液。所述一系列不同浓度的G2-aroA蛋白溶液具体可为从浓度为10μg/mL开始，按照2倍比进行稀释所得的溶液。所述G2-aroA蛋白溶液的溶剂具体可为PBST。
所述酶联免疫试剂盒中还含有分别独立包装的包被缓冲液和/或洗涤液和/或底物缓冲液和/或终止缓冲液和/或封闭液；
在本发明的一个实施例中，所述包被缓冲液具体为碳酸盐缓冲液，其溶剂为水，Na2CO3和NaHCO3；溶质Na2CO3和NaHCO3在所述包被缓冲液中的浓度分别为15mM和35mM；所述包被缓冲液的pH为9.6。
在本发明的一个实施例中，所述洗涤液具体为PBST，其溶剂为水，溶质为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和吐温20；溶质Na2HPO4、KH2PO4和NaCl在所述洗涤液中的浓度分别为8.3mM、1.5mM和200mM；所述吐温20在所述洗涤液中的体积百分含量为0.1％；所述洗涤液的pH为7.5。
在本发明的一个实施例中，所述底物缓冲液具体为PNPP缓冲溶液，其溶剂为水，溶质为MgCl2和二乙醇胺；溶质MgCl2在所述底物缓冲液中的浓度为1mM；所述二乙醇胺在所述底物缓冲液中的体积百分含量为9.7％；所述底物缓冲液的pH为9.8。
在本发明的一个实施例中，所述终止缓冲液具体为3M的NaOH水溶液；
在本发明的一个实施例中，所述封闭液具体为3％(3g/100ml)的BSA，其溶剂为水，溶质为牛血清白蛋白(BSA)、Na2CO3和NaHCO3；Na2CO3和NaHCO3在所述封闭液中的浓度分别为15mM和35mM；所述封闭液的pH为7.5。
在本发明的一个实施例中，所述标记酶具体为碱性磷酸酯酶。
所述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测所述G2-aroA蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。
所述酶联免疫试剂盒在鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物中的应用也属于本发明的保护范围；所述G2-aroA基因编码氨基酸序列为序列表中序列9的蛋白质。
在本发明的一个实施例中，所述待测植物具体为玉米，如玉米品种综31。
所述酶联免疫试剂盒在定量检测G2-aroA蛋白含量中的应用也属于本发明的保护范围；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
由杂交瘤细胞株AntiG2-5F11 CGMCC No.5772产生的单克隆抗体在制备所述的酶联免疫试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
利用本发明所提供的酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测玉米等转基因植物中耐草甘膦蛋白G2-aroA的表达情况，具有快速、灵敏、特异性强的优点。
保藏说明
参椐的生物材料(株)：AntiG2-5F11
科学描述：小鼠杂交瘤细胞
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2012年2月7日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5772
附图说明
图1为纯化后G2-aroA蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图。其中，泳道1为蛋白Marker，自上到下依次为72KD、45KD、32KD、14.4KD；泳道2-4均为原核重组表达载体pET-28a-G2-aroA中表达后纯化所得的G2-aroA蛋白，上样量分别为5μl、10μl、15μl。
图2为SDS-PAGE检测纯化后单克隆抗体的纯度。其中，泳道1为蛋白Marker；泳道2为纯化后的单克隆抗体，较大的目的条带为重链，较小的目的条带为轻链。
图3为酶联免疫试剂盒检测G2-aroA蛋白浓度的标准曲线。
图4为重组表达载体pS3300-UMG2的质粒图谱。
图5为载体pS3300-UG0的质粒图谱。
图6为转G2-aroA基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道1为阳性对照；泳道2为DNA Marker(D2000)；泳道3为空白对照组；泳道4为阴性对照组；泳道5-24为20株转G2-aroA基因玉米植株。
图7为转G2-aroA转基因玉米植株的草甘膦耐性田间鉴定图。其中，1所示一行玉米为mG2-aroA转基因玉米植株；2所示一行玉米为空载体转基因玉米植株；3所示一行玉米为未转基因的玉米植株。
图8为载体pUC19-UG2的质粒图谱。
图9为载体pCAMBIA3300的质粒图谱。
图10为载体pS3300的质粒图谱。
图11为重组表达载体pS3300-UG2的质粒图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
弗氏完全佐剂：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM001；
弗氏不完全佐剂：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM002；
HAT：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM003；
PEG4000：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM005；
RPMI 1640培养基：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM006；
胎牛血清(FBS)：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM007；
山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP：北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CW0102；
K8：孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810的提取液。。
实施例1、杂交瘤细胞株的获得及抗G2-aroA蛋白单克隆抗体的制备
Balb/C小鼠：北京维通利华实验动物有限公司
Sp2/0：北京康为世纪生物科技有限公司
一、免疫原S780的制备
将序列1所示的DNA片段连接到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中，得到表达G2-aroA蛋白的原核表达载体pET-28a-G2-aroA。将pET-28a-G2-aroA转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导其表达G2-aroA蛋白，收集菌体后，将菌体通过超声波破碎，将所表达蛋白释放到提取液中，后用His标签蛋白纯化试剂盒(购自北京康为世纪生物科技有限公司，目录号CW0009A)纯化，G2-aroA蛋白经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测。
SDS-PAGE电泳鉴定结果如图1所示。经page胶鉴定，纯度能够达到95％，经eppendorf蛋白核酸测定仪biophotometer plus测定浓度为1.3mg/ml，将纯化后的G2-aroA蛋白作为免疫原S780。
G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
二、动物免疫
以5只6周龄的雌性Balb/C小鼠为试验动物，按照如下免疫程序及流程进行免疫：
1、免疫前：采用断尾采血法采集血清，用作阴性对照。
2、初次免疫：将浓度为0.64μg/μl的G2-aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多点注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射80μg的G2-aroA蛋白(250μl乳化好的免疫原)。
3、第一次加强免疫：初次免疫21天后，将浓度为0.32μg/μl的G2-aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多点注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射40μg的G2-aroA蛋白(250μl乳化好的免疫原)。
4、第二次加强免疫：第一次加强免疫14天后，进行第二次加强免疫。具体方法同步骤3的第一次加强免疫。
5、终加强免疫：第二次加强免疫14天后，将浓度为0.8μg/μl的G2-aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后，得到免疫原。用所得免疫原脾内注射加强免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射80μg的G2-aroA蛋白(100μl的免疫原)。
三、细胞融合和克隆化
在第二次加强免疫14天后，断尾采血法采集血清，并用间接ELISA法(以S780为包被抗原)测定血清效价。在上述步骤一终加强免疫后第3天，选择上述间接ELISA法测定血清效价最佳的小鼠(效价为1∶720000)取脾细胞，再将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按9∶1(数量配比)的比例，用PEG(PEG4000)常规融合方法进行细胞融合。
融合后的第3天和第6天进行换液处理，第7天采用间接ELISA法(以S780为包被抗原)对融合细胞上清进行筛选，选取阳性细胞孔，将孔内细胞分别转入24孔培养板扩增培养。待细胞长至显微镜视野1/3时，收集细胞上清液，采用间接ELISA法(分别以S780、K8(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、阳性(耐草甘膦材料提取液)、阴性(非转基因材料提取液)作为包被抗原)进行复筛，从中选择与S780及阳性反应均较强，同时与K8和阴性均未反应的细胞(表1中的粗体的5F11)，应用有限稀释法进行亚克隆。经过3次亚克隆最终获得稳定分泌抗G2-aroA蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，命名为AntiG2-5F11。该杂交瘤细胞株已于2012年2月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.5772。
上述作为包被抗原的K8(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、阳性(我公司耐草甘膦材料提取液)、阴性(非转基因材料提取液)具体按照如下方法制备得到：取0.3g样品材料(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810，或实施例2所获得的T6代mG2-aroA转基因玉米，或未转基因的玉米品种综31)，液氮磨碎后，转入2ml离心管中加入1ml样品提取液，剧烈震动，4℃提取1h，12000转/分离心10分钟后取上清进行样品测定。其中，样品提取液配方为：Tris-Cl(pH8.0)25mm；KCl 10mm；MgCl2·6H2O 20mm；DTT 1mm；PMSF 1mm(用前加)。
上述间接ELISA法的步骤具体如下：
1)包被：在96孔酶标板中加入100μL的2μg/mL的抗原溶液，同时设置不包被抗原的对照，4℃包被过夜，用PBS缓冲液洗涤3次。
上述抗原溶液可为S780、K8、阳性和阴性溶液。
2)封闭：加入150μL/孔的封闭液(3％牛血清蛋白)，在37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。
3)加待测样品：
a.对于血清效价检测，第一个孔1∶1000稀释，往下以1∶3的梯度倍比稀释，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
b.对于细胞上清检测，吸取细胞上清100μl，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
同时设置未经免疫的小鼠血清/抗体/腹水/细胞上清的对照；以PBS代替待检测样品的对照(阴性对照孔)。
4)加酶标二抗：取山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP，按1∶5000倍稀释后，100μl/孔，37℃孵育20至30min，洗涤4次，拍干。
5)显色：将20×TMB稀释至1×TMB，按100μl/孔加入，37℃显色15-30min。
6)终止：加入终止液(2M H2SO4)50μl/孔。
7)读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔(以PBS代替待测样品的对照)OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
ELISA结果判定方法：(1)筛选阳性细胞时，若P/N＞2.1，则判别为阳性细胞；若1＜P/N＜2.1，则加大包被浓度后再次检测，P/N＞2.1的仍判为阳性。(2)测定效价时，以P/N＞2.1的血清(或是腹水或是抗体)最大稀释倍数表示。
表1采用间接ELISA法对融合细胞上清进行复筛的结果
| 包被抗原 | 1C2 | 1C11 | 1E6 | 2C1 | 2F7 | 3D12 | 3F9 | 4B11 | 5B2 | 5F11 | PBS | 阳性 |
| S780 | 2.398 | 2.463 | 2.655 | 2.232 | 2.067 | 2.332 | 3.431 | 3.400 | 3.474 | 3.452 | 3.489 | 3.470 |
| K8 | 0.048 | 0.057 | 0.044 | 0.049 | 0.041 | 0.053 | 0.048 | 0.045 | 0.050 | 0.046 | 0.053 | 0.104 |
| 阳性 | 0.297 | 0.162 | 0.398 | 0.289 | 1.424 | 0.245 | 1.762 | 0.920 | 0.393 | 2.427 | 0.068 | 1.291 |
| 阴性 | 0.050 | 0.046 | 0.041 | 0.045 | 0.043 | 0.045 | 0.067 | 0.043 | 0.045 | 0.044 | 0.057 | 0.052 |
注：1C2-5F11分别代表细胞融合后第7天采用间接ELISA法(以S780为包被抗原)所筛选的阳性细胞。吸光值越大，说明抗体对抗原的亲和力越高。
四、单克隆抗体的制备与纯化
1、增量培养法
将杂交瘤细胞株AntiG2-5F11CGMCC No.5772置于RPMI 1640培养基中，37℃培养3天，收集细胞上清。采用protein G亲和柱(Pharmacia)进行纯化。具体操作如下：
(1)平衡：用结合缓冲液平衡protein G亲和柱至基线平稳。
(2)上样：将收集的细胞上清上柱，收集流穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳。
(3)洗脱：加入洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
(4)用0.01M的PBS(pH7.2)透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在0.01M的PBS(pH7.2)中。
(5)用蛋白定量检测仪(Amersham Biosciences)测定纯化后单克隆抗体的浓度。
(6)SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度，抗体上样量：8μg。
2、腹水制备
取2只BALB/C小鼠，每只注射0.5ml石蜡油，7天后取杂交瘤细胞株AntiG2-5F11 CGMCC No.5772重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5ml/只量注射石蜡小鼠，注射细胞14天后收集腹水。采用间接ELISA法(包被抗原为S780)进行腹水效价检测，具体操作及结果判定方法同步骤三中所述(步骤3)按照a进行)，结果表明其效价为1∶81000。采用protein G亲和柱(Phamacia)对腹水进行纯化。具体操作同步骤1所述。
五、单克隆抗体的鉴定
1、单克隆抗体亚型的鉴定
利用Southern Biotech公司生产的亚型检测试剂盒套装(包括Goat anti MouseIgG1-HRP(1070-50)、Goat anti Mouse IgG2a-HRP(1080-05)、Goat anti MouseIgG2b-HRP(1090-05)、Goat anti Mouse IgG3-HRP(1100-05)、Goat anti Mouse IgA-HRP(1040-05)、Goat anti Mouse IgM-HRP(1020-05)、Goat anti Mouse kappa-HRP(1050-05)和Goat anti Mouse Lambda-HRP(1060-05)共8种组分)对上述步骤四制备的单克隆抗体进行抗体亚型的检测，包被抗原为S780，浓度为2μg/ml，包被量为100μl，检测波长为450nm。具体操作过程按照试剂盒说明书进行。检测结果如表2所示，单克隆抗体的重链恒定区为IgG1型，轻链恒定区为Lamda型。
表2单克隆抗体亚型的鉴定
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgM | IgA | Kappa | Lamda | |
| 单抗 | 2.252 | 0.051 | 0.048 | 0.058 | 0.055 | 0.056 | 0.065 | 0.461 |
2、单克隆抗体效价的检测
采用间接ELISA法(包被抗原为S780、K8、阳性和阴性，具体同步骤三)对步骤四所得纯化后单克隆抗体进行效价检测，以PBS溶液替代待测样品作为阴性对照。具体操作及结果判定方法同步骤三中所述(步骤3)按照a进行)。
检测结果如表5所示，以阳性作为包被抗原，腹水纯化的单克隆抗体的效价为1∶81000(0.292/0.083＝3.518＞2.1)。
表3单克隆抗体效价检测结果
3、单克隆抗体的SDS-PAGE胶鉴定其纯度
通过SDS-PAGE凝胶对步骤四所得纯化后单克隆抗体进行纯度检测，结果如图2所示，凝胶上显示两个目的条带，上面较大的一条为重链，下面较小的一条为轻链，目的条带清晰，无杂带，可见，经过步骤四的纯化后单克隆抗体已经达到一定纯度。
实施例2、检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的ELISA试剂盒及应用
一、检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的ELISA试剂盒的制备
本发明的耐草甘膦蛋白G2-aroA的酶联免疫试剂盒由抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体、碱性磷酸酯酶标记的抗G2-aroA蛋白的单克隆抗体(简称酶标抗体)、包被缓冲液、洗涤液、G2-aroA蛋白标准品、底物缓冲液、终止缓冲液和封闭液组成。
1、各种缓冲液的配制方法
(1)包被缓冲液(碳酸盐包被缓冲液)：取1.5g Na2CO3，2.93g NaHCO3，用蒸馏水定容至1000mL，pH9.6。
(2)洗涤液(PBST)：取1mL吐温20，加磷酸盐缓冲液(PBS)定容至1000mL，pH7.5；磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，加1000mL蒸馏水，pH7.5。
(3)样品缓冲液(PBST)：取1mL吐温20，加磷酸盐缓冲液(PBS)定容至1000mL，pH7.5；磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，加1000mL蒸馏水，pH7.5。
(4)底物缓冲液(PNPP底物缓冲液)：取0.1g MgCl2或0.2g MgCl2·6H2O，97.0mL二乙醇胺，溶于1000mL蒸馏水中，pH9.8，4℃保存。
(5)终止缓冲液：3mol/LNaOH，pH12.0。
(6)封闭液(3％的BSA)：取3g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL包被缓冲液，包被缓冲液(碳酸盐包被缓冲液)：取1.5g Na2CO3，2.93g NaHCO3，，用蒸馏水定容至1000mL，pH9.6。
2、抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体的制备
以纯化后的G2-aroA蛋白为免疫原免疫体重约2kg的新西兰大耳白兔，经过血清提取及抗体纯化步骤得到抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体，具体步骤如下：利用与实施例1步骤一相同的方法制备免疫原；用得到的免疫原对体重约2kg的新西兰大耳白兔进行免疫；之后分离血清制备抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体。所述抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体可用于双抗夹心法检测G2-aroA蛋白时作为包被抗体使用。
3、酶标抗体的制备
采用常规方法，用碱性磷酸酯酶对实施例1制备得到的抗G2-aroA蛋白的单克隆抗体进行标记。
4、G2-aroA蛋白标准品的制备
具体方法同实施例1步骤一。纯化后的G2-aroA蛋白即为G2-aroA蛋白标准品。G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9所示。
二、试剂盒的应用
样品稀释液(PBST)：取0.1mL的吐温20，加入步骤一中1所述磷酸盐缓冲液(PBS)定容至100mL。
1、制作标准曲线
(1)包被：将浓度为1.5mg/ml的上述步骤一制备的抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体用步骤一所述包被缓冲液进行稀释，按照抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体与包被缓冲液的体积比为1∶1000的比例稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，4℃湿盒内包被过夜。
(2)洗板：将样品甩掉，在报纸上摔两下，然后放到洗板机中用步骤一所述洗涤液洗板5遍。
(3)封闭：每孔加入120μL步骤一所述封闭液，湿盒内37℃孵育1h，然后甩掉封闭液。
(4)反应：将步骤一制备的G2-aroA蛋白标准品用样品稀释液到浓度为10μg/mL，然后2倍比稀释11个梯度(包括0孔)，重复3次，每孔100μL。其中0孔(不添加标准品溶液而加入100μL样品稀释液)作为对照孔，其余10个梯度孔作为试验孔。置37℃下，温育1h。
(5)洗板：同步骤(2)。
(6)加酶标抗体：按1∶1000用样品稀释液稀释步骤一制备的酶标抗体(鼠单抗)，混匀后每孔加100μL。置37℃下，温育1h。
(7)洗板：同步骤(2)。
(8)加底物显色：称取30mg硝基酚磷酸二钠(PNPP)加入到30ml步骤一所述的PNPP底物缓冲液中(配制完后，10分钟内使用)碱性磷酸酯酶，每孔100μL，20min后加入50μL步骤一所述终止缓冲液终止反应。
(9)测量：在405nm下测定OD值。
(10)绘制标准曲线：以不同浓度的G2-aroA蛋白标准品溶液浓度(ng/mL)作为X轴，以OD值的作为Y轴，用EXCEL绘制标准曲线。
实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线如图3所示。标准曲线方程为y＝9035.2x+198.75(R2＝0.9997)。
2、转G2-aroA基因植物真伪的鉴定
(1)将同为5叶期的转G2-aroA基因玉米(品种：综31)(取10株)和非转基因玉米(品种：综31)(取3株)的根、茎或叶(约0.3g)于研钵中液氮研磨，用样品提取液(Tris-Cl(pH8.0)25mM，KCl 10mM，MgCl2·6H2O 20mM，DTT 1mM，PMSF 1mM(用前加))于4℃提取12小时，8000r/min 4℃离心取上清，得到样本提取液。
(2)多克隆抗体的包被：与上述步骤1中的(1)相同。
(3)洗板：与上述步骤1中的(2)相同。
(4)封闭：与上述步骤1中的(3)相同。
(5)反应：将步骤(1)制备的样本提取液用步骤一所述样品缓冲液按照1∶5的比例稀释后每孔加入100μL，置37℃下，温育1h。
(6)洗板：与上述步骤1中的(5)相同。
(7)加酶标抗体：与上述步骤1中的(6)相同。
(8)洗板：与上述步骤1中的(7)相同。
(9)加底物显色：与上述步骤1中的(8)相同。
(10)测量：与上述步骤1中的(9)相同。
(11)将步骤(10)测量所得的OD值代入上述步骤1绘制的标准曲线方程，计算样品提取液中G2-aroA蛋白含量。
G2-aroA蛋白占鲜重的含量＝提取液中G2-aroA蛋白含量×提取液的体积/样品鲜重，单位：μg/g
(12)利用统计分析软件DPS V7.05版进行分析，通过测量数据的方差分析，确定G2-aroA蛋白在根、茎、叶及幼嫩籽粒中的分布，并计算其差异显著性。
对反应后的鉴定样品进行观察发现，转G2-aroA基因样品提取液的孔与非转基因样品提取液的孔颜色有明显不同，转G2-aroA基因样品提取液的孔颜色深，非转基因样品提取液的孔颜色浅。以非转基因样品为对照，待肉眼观测到鉴定样品的颜色明显深于非转基因样品时，认为其为转G2-aroA基因样品，颜色没有差别时，认为所鉴定样品为非转基因样品。由此初步鉴定转G2-aroA基因植物的真伪。
对鉴定样品进行定量检测，结果如表4所示。其中转G2-aroA基因玉米与非转基因玉米不同组织间的G2-aroA蛋白的差异显著性测定结果见表5。这一结果表明，转G2-aroA基因玉米各组织器官中G2-aroA蛋白的含量均显著高于非转基因玉米，其中转G2-aroA基因玉米叶片中G2-aroA蛋白的含量最高，达7.9416μg/g，即鲜重每克叶片中含有G2-aroA蛋白7.9416μg。
表45叶期耐草甘膦玉米单株各部位G2-aroA蛋白含量单位：μg/g
| 株系及株号 | 根 | 茎 | 叶 |
| 转G2-aroA基因玉米-1 | 0.5809 | 0.8026 | 6.8572 |
| 转G2-aroA基因玉米-2 | 0.6353 | 1.0283 | 8.2385 |
| 转G2-aroA基因玉米-3 | 0.6739 | 0.9067 | 7.8321 |
| 转G2-aroA基因玉米-4 | 0.5585 | 1.0018 | 6.5136 |
| 转G2-aroA基因玉米-5 | 0.6831 | 0.7111 | 8.0486 |
| 转G2-aroA基因玉米-6 | 0.576 | 0.7874 | 7.5969 |
| 转G2-aroA基因玉米-7 | 0.4147 | 0.8914 | 7.7035 |
| 转G2-aroA基因玉米-8 | 0.5709 | 0.7825 | 9.2893 |
| 转G2-aroA基因玉米-9 | 0.5262 | 1.0527 | 7.0903 |
| 转G2-aroA基因玉米-10 | 0.7029 | 1.0254 | 10.2464 |
| 非转基因玉米-1 | 0.0281 | 0.0178 | 0.0222 |
| 非转基因玉米-2 | 0.0339 | 0.0216 | 0.0219 |
| 非转基因玉米-3 | 0.0239 | 0.017 | 0.0223 |
表5转基因玉米与非转基因对照5叶期的G2-aroA蛋白含量多重比较结果(LSD法)
注：平均值单位：μg/g；不同大写字母之间表示差异显著。
上述步骤2中，所述转G2-aroA基因玉米是按照如下方法制备并鉴定所得：
(1)玉米转化起始材料：玉米品种综31(优良玉米自交系展示综3和综31.玉米科学，2009(5))授粉后9～13天的幼穗，剥去苞叶，进行表面消毒。从消毒后的幼穗中剥取幼胚，将其放入感染培养液(配方参考：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)中清洗一到两次，备用。
(2)重组表达载体PS3300-UMG2转化农杆菌：将携带有mG2-aroA序列重组表达载体pS3300-UMG2(质粒图谱如图4所示，具体构建方法见文章末尾处)。mG2-aroA序列为根据G2-aroA蛋白的编码基因(中国专利，申请号03826892.2，授权公告号CN100429311C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列1所示)，在保证氨基酸序列不变的前提下，采用玉米偏好密码子对其进行人工优化改造所得(mG2-aroA序列如序列2所示)。这样改造是为了提高G2-aroA蛋白在转基因玉米中的表达水平。将重组表达载体pS3300-UMG2转化农杆菌LBA4404(参考文献：Methods in MolecularBiology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)。同时设置转入pS3300-UG0空载体(质粒图谱如图5所示，具体构建方法见文章末尾处)的对照。将经过上述鉴定证实转入了重组表达载体pS3300-UMG2的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UMG2。将转入pS3300-UG0空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-U G0。
(3)农杆菌转化玉米幼胚：将上述步骤(1)经感染培养液清洗过的幼胚放入OD600为0.3-0.5左右的步骤(2)的两种农杆菌的菌液中，放置5分钟，然后将幼胚置于共培养培养基(参考文献：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)上，在20℃左右黑暗条件下共培养3天。
(4)转G2-aroA基因玉米再生苗的获得：将上述步骤(3)共培养后的幼胚转入选择培养基(参考文献：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)，在选择培养基中加入终浓度为1mM的草甘膦作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养，每两周继代一次，直至生长出松脆，颜色鲜黄且生长旺盛的抗性愈伤组织。
将所得抗性愈伤转入诱导培养基(参考文献：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)进行诱导分化，一个月后即可获得成熟的胚状体。再将胚状体放到MS培养基上生根，即得到转基因玉米的再生苗。
(5)转G2-aroA基因玉米植株的PCR鉴定：提取转基因玉米植株(转入mG2-aroA基因的植株以及转入pS3300-UG0空载体的植株)的基因组DNA。以其为模板，进行PCR鉴定。正向引物：CCACCTGGCTCCAAGTCTATCA；反向引物：GCGTCAACCTGTGCTCCAAA。反应体系(20μL)：DNA 1μL(20-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl2(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加无菌水至20μL。反应条件：94℃5分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。同时设置未转基因的玉米植株对照。检测结果表明转G2-aroA基因玉米植株均扩增得到大小为610bp的目的条带；而未转基因植株以及转入空载体的玉米植株均没有扩增出目的条带(图6)。这一结果说明G2-aroA基因已经整合进转G2-aroA基因玉米的基因组中。
(6)转G2-aroA基因玉米植株的田间除草剂耐性检测：按照800ml/亩的用量对大田种植的转G2-aroA基因玉米植株(5-6叶期)喷施农达(Roundup，含41％的草甘膦，田间推荐使用剂量为150-250ml/亩)。同时设置转入pS3300-UG0空载体的植株对照和未转基因的玉米植株对照。结果如图7所示：转G2-aroA基因玉米植株在800ml/亩农达处理后，无明显的药害，表现正常，后期的生长期内均无药害反应。转入pS3300-UG0空载体的植株和未转基因的玉米植株均在短时间内(15天内)全部死亡。这一结果表明，转G2-aroA基因玉米对草甘膦具有极强的耐受性。
前述重组表达载体pS3300-UMG2的pS3300-UG0的构建方法如下：
1、中间载体pUC19-UG2的构建
a.人工合成Ubi启动子(序列5)，并在两端添加Pst I酶切位点；Pst I酶切pUC19质粒(购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品编号90202)，去磷酸化后，与Ubi启动子片段连接，得到pUC19-Ubi。
b.人工合成G2-aroA基因(序列1)，并在两端添加BamH I和Kpn I酶切位点；连入经BamH I和Kpn I酶切的上述步骤1a所得的pUC19-Ubi，得到pUC19-Ubi-G2。
c.人工合成PolyA+T-NOS终止序列(序列8)，并在两端添加Kpn I和EcoR I酶切位点；连入经Kpn I和EcoR I酶切的上述步骤1b所得的pUC19-Ubi-G2，得到pUC19-Ubi-G2-polyA-T-NOS。
d.人工合成OMK序列(序列6)+CTP序列(序列7)，并在两端添加BamH I位点；BamH I酶切上述步骤1c所得的pUC19-Ubi-G2-polyA-T-NOS，去磷酸化后连接OMK-CTP(序列6和序列7之间直接连接)，得到pUC19-UG2(质粒图谱见图8)。
2、改造pCAMBIA3300载体获得pS3300载体
a.表达载体pCAMBIA3300(质粒图谱见图9)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(CA：MCV038)，用限制性内切酶Sph I、Sac II双酶切，回收纯化大片段。
b.人工合成序列表中序列4所示基因片段(自5’端由T-Border的右边界序列，连接序列和T-Border的左边界序列组成，所述连接序列中自5’端含有HindIII和EcoR I酶切位点的识别序列)，用限制性内切酶Sph I、Sac II酶切后，与步骤a回收的大片段连接，得到pS3300载体(质粒图谱见图10)。
3、携带mG2-aroA基因的重组表达载体pS3300-UMG2的构建
a.将步骤2b所得pS3300载体用Hind III和EcoR I双酶切，回收纯化。
b.将表达载体pUC19-UG2(质粒图谱见图8)用Hind III和EcoR I双酶切后回收小片段(Ubi-OMK-CTP-G2-polyA-T-NOS)，与步骤3a所得回收产物连接，得到携带有G2-aroA基因的重组表达载体pS3300-UG2(质粒图谱见图11)。
c.用BamH I与Kpn I双酶切上述步骤b所得的pS3300-UG2载体，分别回收片段pS3300-Ubi-polyA-T-NOS及OMK+CTP。
d.将新合成的两端分别带有带有BamH I与Kpn I酶切位点的mG2-aroA基因(序列3，在序列2的5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入Kpn I酶切酶切位点)经BamH I与Kpn I酶切后，与上述步骤c得到的大片段pS3300-Ubi-polyA-T-NOS相连，得到重组载体pS3300-Ubi-mG2-polyA-T-NOS。
e.用BamH I酶切上述步骤d得到的重组载体pS3300-Ubi-mG2-polyA-T-NOS，之后进行去磷酸化处理，再与上述步骤d回收的OMK+CTP序列连接，得到携带mG2-aroA基因完整阅读框的重组表达载体pS3300-UMG2(质粒图谱见图4)。
4、pS3300-UG0空载体(对照)的构建
a.以上述步骤3e所得的pS3300-UMG2载体为模板，利用如下引物重新扩增OMK+CTP：
OMK+CTP_F：5′GGATCCTATTTTTACAACAATTA-3′(下划线部分为BamHI酶切位点识别序列)；
OMK+CTP_R：5′-GGTACCTTCCGCCGTTGCTGAC-3′(下划线部分为Kpn I酶切位点识别序列)。
b.扩增产物经BamH I和Kpn I双酶切后与步骤3c所得pS3300-Ubi-polyA-T-NOS大片段连接，得到空载体pS3300-UG0(质粒图谱见图5)。
Claims (6)
1.一种检测或辅助检测G2-aroA蛋白的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的单克隆抗体；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9；所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株AntiG2-5F11产生；所述杂交瘤细胞株AntiG2-5F11在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5772。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶联免疫试剂盒中还含有分别独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的多克隆抗体和/或所述G2-aroA蛋白标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；所述多克隆抗体是以所述G2-aroA蛋白为免疫原免疫新西兰大耳白兔得到的。
3.权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测G2-aroA蛋白中的应用；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
4. 权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒在鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物中的应用；所述G2-aroA基因编码氨基酸序列为序列表中序列9的蛋白质。
5.权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒在定量检测G2-aroA蛋白含量中的应用；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
6.由杂交瘤细胞株AntiG2-5F11产生的单克隆抗体在制备权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒中的应用；所述杂交瘤细胞株AntiG2-5F11在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.5772。
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