CN1833025A - 高抗草苷膦的epsp合成酶及其编码序列 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的5－烯醇丙酮酸莽草酸－3－磷酸合酶(简称为“EPSP合成酶”)，编码EPSP合成酶的多核苷酸和经重组技术产生这种EPSP合成酶的方法。本发明还公开了编码这种EPSP合成酶的多核苷酸的用途。
Description
髙抗草苷膦的 EPSP合成酶及其编码序列
技术领域
本发明属于生物学领域， 具体地说， 本发明涉及从采用免培养技术构建的群 落水平 DNA库中分离的 5-烯醇丙酮酸莽草酸 -3-磷酸合酶 (EPSP合成酶)基因及其 蛋白产物。 本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。 具体地说， 本发明的 多肽是一种具有抗草甘膦抗性的酶。 背景技术
草甘膦 (Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂， 其作用机制是通过抑 制植物体内 5-烯醇丙酮酸莽草酸 -3-磷酸合酶 (EPSPS)活性， 干扰植物体内芳香族 氨基酸的生物合成， 导致植物死亡。
应用化学诱变细菌产生的 aroA突变体， 抗药性机理研究确证了 A基因 是草甘膦作用靶标 EPSP合成酶的编码基因。 近年来包括美国和中国在内的国家 草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦品种的选育和大面积的推广有直接 的关系。美国 Mosanto和 Calegene等公司在 EPSP合成酶的编码基因 aroA及其抗 草甘膦转基因植物等方面已申请了 100余份专利， 获得转基因抗草甘膦大豆、 玉 米、 油菜、 甜菜和棉花等作物系列品种， 其中大豆等多种转基因作物已进入商品 化生产。
我国在转基因抗草甘膦作物方面的研究已取得一定进展， 但目前尚无转抗草 甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。 同时， 由于没有配套出口转基因抗除草剂 种子的优势和抗草甘膦基因专利， 与国外大公司在市场销售竞争中处于极为不利 的地位。
因此，本领域迫切需要开发新的抗草甘膦的 5-烯醇丙酮酸莽草酸- 3-磷酸合酶。 发明内容
本发明的目的是提供一种新的 5-烯醇丙酮酸莽草酸 -3-磷酸合酶 (简称为" EPSP 合成酶"）以及其片段、 类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用 途， 尤其是在提高植物抗草甘膦抗性方面的用途。 在本发明的第一方面， 提供新颖的分离出的 EPSP合成酶多肽， 它包含： 具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、 或其保守性变异多肽、 或其活性片段、 或其活 性衍生物。 较佳地， 该多肽选自下组： （a)具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；
确 认 本
(b)将 SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个 (较佳地 1-20个)氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且具有抗草甘膦抗性和 EPSP合成酶活性的由 (a)衍生的多 肽。
在本发明的第二方面， 提供编码分离的这些多肽的多核苷酸， 该多核苷酸包 含一核苷酸序列， 该核苷酸序列选自下组： （a)编码上述 EPSP 合成酶多肽的多核 苷酸； 和 (b)与多核苷酸 (a)互补的多核苷酸。较佳地， 该多核苷酸编码具有 SEQ ID NO: 2或 3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种： (a)具有 SEQ ID NO: 1中 40-1371位的序列; (b)具有 SEQ ID NO: 1中 1-1500位的 序列。
在本发明的第三方面， 提供了含有上述多核苷酸的载体， 以及被该载体转化 或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面， 提供了制备具有活性的多肽的方法， 该方法包含： （a) 在适合表达的条件下， 培养上述被转化或转导的宿主细胞； （b)从培养物中分离出 具有活性的多肽。 在本发明的第五方面， 提供了本发明多肽和编码序列的用途。
在本发明的第六方面， 提供了一种改变植物抗草甘膦抗性的方法， 它包括步 骤-
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有 EPSP合成酶 DNA编码 序列， 所述的 EPSP合成酶选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO : 2氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID N0 : 2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或 添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和 EPSP合成酶活性的由（a)衍生的多肽；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤 (1)中的农杆菌接触， 从而使 EPSP合成酶 DNA编码序列转入植物细胞， 并且整合到植物细胞的染色体上；
C3)选择出转入 EPSP合成酶 DNA编码序列的植物细胞或组织或器官； (4)将步骤 (3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开， 对本领域的技术人员而言是显而 易见的。 具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究， 首次从从采用免培养技术构建的群落水平 DNA库中分离获得了新的 EPSP合成酶， 并且通过实验证实了它具有高抗草甘膦 抗性， 并且转入植物后， 可导致植物抗草甘膦抗性的提髙。 在此基础上完成了本 发明。 在本发明中， 术语 "EPSP合成酶" 、 "EPSP多肽"或 " 5-烯醇丙酮酸莽草
酸 -3-磷酸合酶"可互换使用， 都指具有 5-烯醇丙酮酸莽草酸 -3-磷酸合酶 EPSPS 氨基酸序列 (SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。 它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的 EPSP合成酶。
如本文所用， "分离的"是指物质从其原始环境中分离出来 (如果是天然的物 质， 原始环境即是天然环境)。 如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是 没有分离纯化的， 但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质 中分开， 则为分离纯化的。
如本文所用， "分离的 EPSP合成酶或多肽"是指 EPSP多肽基本上不含天然 与其相关的其它蛋白、 脂类、 糖类或其它物质。 本领域的技术人员能用标准的蛋 白质纯化技术纯化 EPSP合成酶。
本发明的多肽可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。 本发 明的多肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组技术从原核 或真核宿主 (例如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞)中产生。 根据 重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。 本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括 EPSP合成酶的片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术语 "片 段" 、 "衍生物"和 "类似物"是指基本上保持本发明的天然 EPSP合成酶相同的 生物学功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是 (i)有一个 或多个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样 的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的， 或 (ii)在一个或多个氨 基酸残基中具有取代基团的多肽， 或 (iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多 肽，或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽 (如前导序列或分泌序 列或用来纯化此多肽的序列)。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生物和类似物属于 本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中， 术语 "EPSP多肽"指具有 EPSP合成酶活性的 SEQ ID NO. 2 序列的多肽。 该术语还包括具有与 EPSP合成酶相同功能的、 SEQ ID NO. 2序列 的变异形式。这些变异形式包括 (但并不限于)：若干个 (通常为 1-50个，较佳地 1-30 个， 更佳地 1-20个， 最佳地 1-10个)氨基酸的缺失、 插入和 /或取代， 以及在 C末 端和 /或 N末端添加一个或数个 (通常为 20个以内，较佳地为 10个以内，更佳地为 5 个以内)氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在 C末端和 /或 N末端添加一个或数个氨基 酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括 EPSP合成酶的活性片段和活性衍 生物。
该多肽的变异形式包括： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变 体、 诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与 EPSPS DNA 杂交的 DNA所编码
的蛋白、 以及利用抗 EPSP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他 多肽， 如包含 EPSP多肽或其片段的融合蛋白。 除了几乎全长的多肽外， 本发明还 包括了 EPSP多肽的可溶性片段。 通常， 该片段具有 EPSP多肽序列的至少约 10 个连续氨基酸， 通常至少约 30个连续氨基酸， 较佳地至少约 50个连续氨基酸， 更佳地至少约 80个连续氨基酸， 最佳地至少约 100个连续氨基酸。
发明还提供 EPSP合成酶或多肽的类似物。这些类似物与天然 EPSP多肽的差 别可以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者 兼而有之。 这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。 诱导变异体可以通过各种技 术得到。 在本发明中， "EPSP合成酶保守性变异多肽"指与 SEQ ID NO : 2的氨基酸序 列相比， 有至多 10个， 较佳地至多 8个， 更佳地至多 5个， 最佳地至多 3个氨基酸被 性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表 1进 行氨基酸替换而产生。 表 1
Val (V) lie ; Leu ; Met； Phe ; Ala Leu 本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或 .RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、 基 因组 DNA或人工合成的 DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编码 链或非编码链。 编码成熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID ΝΟ:1所示的编码区序 列相同或者是简并的变异体。 如本文所用， "简并的变异体"在本发明中是指编 码具有 SEQ ID NO:2的蛋白质， 但与 SEQ ID ΝΟ:1所示的编码区序列有差别的核 酸序列。
编码 SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列； 成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列； 成熟多肽的编码序列 (和任选的附加编 码序列)以及非编码序列。
术语 "编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸， 也可以是 还包括附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。
本发.明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明有相同的氨基酸序列 的多肽或多肽的片段、 类似物和衍生物。 此多核苷酸的变异体可以是天然发生的 等位变异体或非天然发生的变异体。 这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变 异体和插入变异体。 如本领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式， 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入， 但不会从实质上改变其编码的 多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少 50%， 较佳地至少 70%, 更佳地至少 80%相同性的多核苷酸。 本发明特别涉及在严格条件下与本发 明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。 本发明中， "严格条件"是指 :（1)在较低离 子强度和较高温度下的杂交和洗脱， 如 0.2 X SSC, 0.1%SDS，60°C ; 或 (2)杂交时加 有变性剂， 如 50%(v/v)甲酰胺， 0.1%小牛血清 /0.1% Ficoll, 42°C等； 或 (3)仅在两 条序列之间的相同性至少在 90%以上,更好是 95%以上时才发生杂交。 并且， 可杂 交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和 活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。 如本文所用， "核酸片段" 的 长度至少含 15个核苷酸， 较好是至少 30个核苷酸， 更好是至少 50个核苷酸， 最 好是至少 100个核苷酸以上。 核酸片段可用于核酸的扩增技术 (如 PCR)以确定和 / 或分离编码 EPSP合成酶的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供， 更佳地被纯化至均质。 本发明的 EPSPS核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、 PCR扩增法、 或重组法的方法获得。 例如首先根据 SEQ ID NO:l的序列进行全序列合成。
对于 PCR扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤其是开放阅读 框序列来设计引物，并用人工合成的 EPSPS核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩 增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常 是将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离 得到有关序列。
此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。 通 常， 通过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白 (或其片段和衍生物) 的 DNA序列。然后可将该 DNA序列弓 I入本领域中已知的各种现有的 DNA分子 (或 如载体)和细胞中。 此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或 EPSP 合成酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞， 以及经重组技术产生本发明所述多 肽的方法。
通过常规的重组 DNA技术 (Science, 1984； 224： 1431), 可利用本发明的多 聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的 EPSP多肽。 一般来说有以下步骤：
(1) .用本发明的编码 EPSP多肽的多核苷酸 (或变异体)， 或用含有该多核苷酸 的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3) .从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。
本发明中， EPSP合成酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。 术语 "重组 表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳 动物细胞病毒或其他载体。 总之， 只要能在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载 体都可以用。 表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、 启动子、 标记基因 和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含 EPSP合成酶编码 DNA序列和合适 的转录 /翻译控制信号的表达载体。 这些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合成技 术、体内重组技术等。所述的 DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上， 以指导 mRNA合成。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转 化的宿主细胞的表型性状， 如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性以 及绿色荧光蛋白（GFP)， 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体， 可以用于转 化适当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞；
或是高等真核细胞， 如植物细胞。 代表性例子有： 大肠杆菌， 链霉菌属、 农杆菌； 真菌细胞如酵母； 植物细胞； 昆虫细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时， 如果在载体中插入增强子序列 时将会使转录得到增强。 增强子是 DNA 的顺式作用因子， 通常大约有 10到 300 个碱基对， 作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、 启动子、 增强子和宿主细 胞。
用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。 当宿主 为原核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用 &( 12法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。 另一种方法是使用 MgCl2。 如果需 要， 转化也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA转染 方法： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。 转 化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法， 例如叶盘法。 对于转化的植物 细胞、 组织或器官可以用常规方法再生成植株， 从而获得抗草甘膦抗性提高的植 物。
获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的基因所编码的多肽。 根据 所用的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适于宿主细胞 生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法 (如 温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子， 将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞 外。 如果需要， 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯 化重组的蛋白。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些方法的例子包括但并 不限于： 常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、 离心、 渗透破菌、 超 处理、 超离心、 分子筛层析 (凝胶过滤）、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层 析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
另一方面，本发明还包括对 EPSP合成酶 DNA或是其片段编码的多肽具有特异 性的多克隆抗体和单克隆抗体， 尤其是单克隆抗体。 较佳地， 指那些能与 EPSP 合成酶基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。 本发 明中抗体包括那些能够结合并抑制 EPSP合成酶的分子，也包括那些并不影响 EPSP 合成酶功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的 EPSP合成酶基 因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体， 而且还包括具有免疫活性的抗 体片段、 或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。 例如， 纯化的 EPSP合成酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多
克隆抗体的产生。与之相似的，表达 EPSP合成酶或其具有抗原性的片段的细胞可 用来免疫动物来生产抗体。 此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。 本发明 的各类抗体可以利用 EPSP合成酶基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获 得。 这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。 与 EPSP 合成酶基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞（例如 ^ oZi)中生产 的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体（如糖基化或磷酸化 的蛋白或多肽），可以用真核细胞（例如酵母或昆虫细胞）中产生的基因产物来免疫 动物而获得。 抗 EPSP合成酶的抗体可用于检测样品中的 EPSP合成酶。
多克隆抗体的生产可用 EPSP合成酶或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。 多种佐剂可用于增强免疫反应， 包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明还涉及定量和定位检测 EPSP合成酶水平的测试方法。这些试验是本领 域所熟知的， 且包括 FISH测定和放射免疫测定。
一种检测检测样品中是否存在 EPSP合成酶的方法是利用 EPSP合成酶的特异 性抗体进行检测， 它包括： 将样品与 EPSP合成酶特异性抗体接触； 观察是否形成 抗体复合物， 形成了抗体复合物就表示样品中存在 EPSP合成酶。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列 (microarray)或 DNA芯片（又称为 "基因芯片"）上， 用于基因的表达分析。 用 EPSP合成酶特异的 引物进行 RNA-聚合酶链反应（RT- PCR)体外扩增也可检测 EPSP合成酶的转录产物。 在本发明的一个实例中， 提供了一种分离的多核苷酸， 它编码具有 SEQ ID N0 : 2所示氨基酸序列的多肽。 本发明的多核苷酸是从釆用免培养技术构建的群落 水平 DNA库中分离的并人工全合成的。 其序列如 SEQ ID N0 : 1所示， 它包含的多 核苷酸序列全长为 1500个碱基， 其开放读框位于 40-1371位， 编码全长为 444个 氨基酸的 EPSP合成酶 (SEQ ID NO: 2)。
本发明的 EPSP合成酶具有如下特性： A)草苷膦抗性功能明确， 且显示了高 于以前报道 5-10倍的抗草苷膦能力； B)结构新，在核酸水平上与已见报道的 EPSP 合成酶编码基因无任何同源性， 在氨基酸水平上与根瘤脓杆菌 C58 的同源性为 60.79%, 与 Monsanto公司专利报道的根瘤脓杆菌 CP4的同源性为 24.53%， 且不 含有专利保护序列和突变位点。
EPSP合成酶为改变植物的抗草甘膦抗性提供了新的途径， 因而具有巨大的应 用前景。可以通过将 EPSP合成酶的编码基因导入， 改变现有优良农作物品种的抗 草甘膦抗性， 可获得抗草甘膦的小麦、 水稻或其它农作物品种， 解决农业生产中 存在的实际问题。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明
本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条 件。
实施例 1: 高抗草苷膦的 DNA片段克隆
1、 草苷膦极端污染环境中土壤样品的采集
自然环境中特别是在长期使用草甘膦等除草剂地区的土壤中， 存在种类繁多 的能耐受草甘膦或其它除草剂的细菌菌株。 从被 50%左右草苷膦污染达十年以上 的土壤中 (河北奇峰化工有限公司草甘膦生产工厂开放式分装点)釆集样品。
2、 采用免培养方法从草苷膦极端污染土壤样品中分离群落水平总 DNA 称取草苷膦污染土壤样品 2克， 加入 0.6g 细玻璃珠 (d<0.11mm)， 4000转 /分 振荡 2 次。 加入 300 μ 1 2%SDS + 12%苯酚 Tris缓冲液 (pH8.0)溶液冰上 1小时， 加入等量苯酚 Tris缓冲液， pH8.0(约 700ml)， 充分混匀， 经 4 °C， 13,000rpm 离心 5分钟。 上层溶液加入 0.1倍体积的 3M NaAc pH5.2， 混勾后加入 0.6倍体积异丙 醇混匀。 DNA沉淀溶于 200 μ 1 ΙχΤΕ (粗 DNA)。 称 lOOmg氯化铯置于一个新的 1.5ml Epp.离心管中， 加入 ΙΟΟ μ Ι 粗 DNA轻轻混匀， 室温黑暗条件下静置 1-3 小时。室温， 13,000rpm， 离心 20分钟。上清液中加入 400 μ 1无菌去离子水和 300 μ ΐ异丙醇， 室温静置 30分钟。 室温， 13,000rpm， 离心 20分钟。 沉淀溶于 100 μ 1 ΙχΤΕ和 40 μ 1 8Μ 醋酸钾 (KAc)， 室温静置 15分钟。 4°C， 13,000rpm离心 15 分钟。 上清液加入 0.6倍体积异丙醇混匀。 室温静置 30分钟。 室温， 15,000rpm 离心 20分钟。 DNA沉淀溶于 100 μ 1 1χΤΕ。 釆用 Wizard spin column clean-u 分 离试剂盒纯化 DNA 样品。 纯化 DNA 溶于总体积为 100 μ 1 的 1 OmMTris- EDTA(pHS.O)缓冲液中。
3、 群落水平总 DNA粘粒文库的构建
采用粘粒 SuperCosl Cosmid Vector Kit (购自 Stratagene公司）构建群落水平 总 DNA的粘粒文库。釆用 0.006u/ g DNA的 Sau3A I酶量大量酶切纯化的群落水 平总 DNA， 冻融法回收 40 kb左右的部分酶切片段， 与载体 SuperCosl/ BamHl 片段连接。 按公司提供的试剂盒说明书构建粘粒文库。 由于本实验要筛选草甘膦 抗性克隆， 而草甘膦只能在限制型培养基 (如 M9、 MOPS)上起作用， 因此本实验 釆用能在限制性培养基上生长的大肠杆菌 JM109 作为受体菌株， 将群落水平总 DNA片段与载体的连接产物用噬菌体包装蛋白包装后， 转入大肠杆菌 JM109中。 将转染的大肠杆菌 JM109涂布于四环素抗性 LB固体培养基上， 将长出的菌落分 别点于四环素抗性和四环素加卡那霉素抗性的 LB 固体培养基上， 在两种抗性培
养基上生长的转化子为粘粒载体自连转化， 减去背景菌落数， 根据经验公式计算 滴度 (pfii/ml)为 4χ106(大于 106)， 表明文库构建符合要求。
4、 筛选草甘膦抗性转化子
将转染细菌涂布于加入磷酸盐和 10mM草甘膦的 MOPS固体培养基上，两天 后生长出十余个菌落， 用无菌牙签点于含有不同浓度草甘膦的 MOPS固体培养基 上， 挑选出一个抗性最高的克隆 pGRl， 可以耐受 60mM草甘膦， 提取这个克隆 的质粒， 电激法将 pGRl和载体质粒 pLA2917转回大肠杆菌 JM109中， 将转化子 用无菌牙签点于含 20mM草甘膦的 MOPS固体培养基上检验抗性， 结果证明这个 克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性， 表明抗草甘膦特性确实是由于转入 pGRl引起的。
5. 高抗草苷膦的 DNA片段的亚克隆及抗性验证
将草甘膦抗性克隆质粒 pGRl用限制性内切酶 HindIII、 PstK Hindlll+Pstl消 化与克隆载体质粒 (pBlueScriopt KS, pGEM-3zf)连接， 转化大肠杆菌 JM109,涂布 于含 Amp的 LB固体培养基上，挑取白色菌落煮沸法提质粒筛选不同的重组子，并 在含有 20mM草甘膦的 MOPS固体培养基上筛选抗性亚克隆，得到一个抗草甘膦 亚克隆 pGRHl。 提取质粒后重新转化大肠杆菌 JM109， 以载体质粒为阴性对照。
结果表明， 这个亚克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性， 这证明抗草甘 膦特性确实是由于转入 pGRHl引起的。
酶切分析表明， 所亚克隆的高抗草苷膦 DNA片段大小为 2.4kb。 将 OD值相 同的 pGRl、 pGRHl和载体对照 pGEM-3zf菌液以 1%的接种量分别接种于含有 50mM、 150mM草甘膦的 MOPS液体培养基中， 37°C振荡培养 24小时，于 600nm 波长测定 OD值， EPSP合成酶的克隆 pGRl及亚克隆 pGRHl均能耐受 150mM 浓度的草甘膦， 生长状况良好， 而载体对照不能生长。 实施例 2: 髙抗草苷膦的 DNA片段的序列分析及其 EPSP合成酶功能验证 1、 髙抗草苷膦的 DNA片段的序列分析
对实施例 1中所亚克隆的髙抗草苷膦 DNA片段进行全核苷酸序列测定。 分 析结果表明， 其序列如 SEQ ID N0 : 1 所示， 它包含的多核苷酸序列全长为 1500 个碱基，其开放读框位于 40-1371位，编码全长为 444个氨基酸的 EPSP合成酶 (SEQ ID NO: 2)。
将所亚克隆的高抗草苷膦编码序列与已报道的 EPSP 合成酶编码基因 (aroA) 比较， 在核苷酸水平几乎没有任何同源性。
氨基酸序列同源性分析结果表明， 与已知的 Classl EPSP合成酶 (来源于大肠
杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌等)氨基酸同源性同源性并不高， 与大肠杆菌和鼠伤寒沙门 氏菌来源的 EPSP合成酶氨基酸同源性分别为 30.4%和 31.7%。 与 Monsanto公司 专利报道的根癌农杆菌 CP4 的 EPSP合成酶同源性为 24.53% , 且没有发生 80- 120(-L-G-N-A-A-T-A)的氨基酸取代，与 170-210(-A-L-L-M-x.sub. l -A-P-L-T-)的序 列也不同。与之同源性最高
tumefaciens)CS , 同源 性为 60.79%， 与同一属的鼻疽假单胞菌的 BPSP合成酶同源性为 20.53%。
2、 高抗草苷膦的 DNA片段的 EPSP合成酶功能验证
序列分析结果显示抗性克隆中含有 EPSP 合成酶的 ORF, 为了证实其具有 EPSP合成酶活性， 本实验以大肠杆菌 EPSP合成酶缺陷型菌株 ER2799为受体菌 株， 采用。&02法将草甘膦抗性亚克隆 pGRHl转入， 用无菌牙签将转化子菌落点 于 MOPS 固体培养基上， 受体菌株 ER2799、 含有载体质粒 (pBuleScript KS、 pGEM-3zf)的 ER2799为阴性对照， 如抗草甘膦亚克隆含有可表达的 EPSP合成酶 基因， 互补了受体菌的缺陷， 则能够利用限制性培养基的无机物合成氨基酸并生 长， 否则就不能生长。
试验结果表明，草甘膦抗性亚克隆 R3H1和 R7H1中所含的 DNA片段均能在 功能上互补 EPSP合成酶缺陷型菌株， 因此， 可以确定亚克隆 pGRHl中含有完整 功能的 EPSP合成酶基因。 实施例 3: 高抗草苷膦的 EPSP合成酶基因的人工合成
根据已完成的含 1335编码区的核苷酸序列，首先分 8个区段分别根据正链和 副链序列， 分别合成出长度约 150-200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将 正链和副链各一一对应的 8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火， 形成 8个带有 粘性末端的双链寡核苷酸片段。 混合双链寡核苷酸片段， 经 T4DNA连接酶催化 组装成一个完整的 EPSP合成酶基因。 该合成的 DNA片段含有 SEQ ID ΝΟ: 1中 40- 1374位的核苷酸序列， 并且合成基因的两端含 Xbal和 Sacl位点。
将上述人工合成的 5 '和 3 '端酶切位点为 Xbal和 Sacl位点 EPSP基因， 用于 下面高抗草苷膦的 EPSP合成酶基因植物表达载体的构建。 实施例 4: 高抗草苷膦的 EPSP合成酶基因植物表达载体的构建
高抗草苷膦的 EPSP合成酶基因植物表达载体构建的具体方法如下：
A. pBI121(ClonTech 公司）和 pCAMBIA2301(ClonTech 公司）用 Hindlll 和 EcoRI双酶切，将 pBI121带有 p35S-GUS- Nos-ter的片段连入 pCAMBIA2301， 形 成中间载体 p35S-2301-GUS;
B. 用 Xbal和 Sacl双切 p35S-2301-GUS和上述人工合成的 EPSP基因， 用
EPSP置换 p35S-2301-GUS相应酶切位点的 GUS， 从而获得高抗草苷膦的 EPSP 合成酶基因植物表达载体。 再将其转入农杆菌中， 用于转化模式植物烟草。 实施例 5: 利用叶盘法转化构建抗草苷膦的转基因烟草
(1) 用无菌牙签挑取 YPE选择平板上的实施例 5中制备的阳性克隆， 接种 于 2MLYPE液体 (Sm+，Kan+),28 °C， 200rpm振荡培养 24-36小时；
(2) 室温下 4， OOOg离心 10分钟；
(3) 弃上清， 菌体用 1 I 2MS液体培养基悬浮， 稀释到原体积的 5-20倍， 使菌体的 OD600在 0. 5左右；
(4) 取生长两周左右的烟草的无菌叶片， 去掉其主叶脉， 将其剪成约 lcm2 见方的小叶片；
(5) 将叶片放入制备好的菌液中， 浸泡 2-5分钟， 在无菌滤纸上吸干菌液； 把经浸染的叶片放于 MS培养基上， 28Ό暗培养 48小时；
(6) 将叶片转到愈伤培养基 (MS+6-BA l.Omg/l+NAA 0.1mg/l+Kan 50mg/l+ 羧苄青霉素 250mg/l)上， 25-28°C光照下培养， 7-15天可见愈伤组织的形成；
(7) 约 20天后可见分化芽长出， 待芽长大后， 切下， 置于生根培养基 (1 / 2MS+NAA 0.5mg/l+Kan 25mg/l)上进行生根培养， 2-7天左右生根；
(8) 待根系发达后， 将植株取出， 用无菌水洗净附着着的固体培养基， 移 入土壤中， 刚开始几天用玻璃罩罩几天， 待植株健壮后再取下玻璃罩， 转移至在 含 10mM的草苷膦的固体培养基中筛选草苷膦抗性的植株。
(9) 抗性植株经 Southern、 Northern杂交以及 Westhem blot验证为转基因 的抗性植株。
(10)在温室中经草甘膦抗性梯度实验证明， 转基因植物能在含 15mM草甘膦 的培养基上良好生长。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。
Claims (1)
1.一种分离的 EPSP合成酶多肽， 其特征在于， 它包含： 具有 SEQ ID NO: 2氨 基酸序列的多肽、 或其保守性变异多肽、 或其活性片段、 或其活性衍生物。
2.如权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 该多肽选自下组：
(a)具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成的， 且具有抗草甘膦抗性和 EPSP合成酶活性的由 (a)衍生的多肽。
3.—种分离的多核苷酸， 其特征在于， 它包含一核苷酸序列， 该核苷酸序列选 自下组-
, (a)编码如权利要求 1和 2所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸 (a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求 3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求 3所述的多核苷酸， 其特征在于， 该多核苷酸的序列选自下组的 一种：
(a) 具有 SEQ ID NO: 1中 40-1371位的序列；
(b) 具有 SEQ ID NO: 1中 1-1500位的序列。
6.—种载体， 其特征在于， 它含有权利要求 3所述的多核苷酸。
7.—种遗传工程化的宿主细胞， 其特征在于， 它含有权利要求 6所述的载体。
8. 一种具有 EPSP合成酶活性的多肽的制备方法， 其特征在于， 该方法包含：
(a)在适合表达的条件下， 培养权利要求 7所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出具有 EPSP合成酶活性的多肽。
9.一种能与权利要求 1所述的 EPSP合成酶特异性结合的抗体。
10.—种改变植物抗草甘膦抗性的方法， 其特征在于， 它包括步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有 EPSP合成酶 DNA编码 序列， 所述的 EPSP合成酶选自下组. -
(a)具有 SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；
(b)将 SEQ ID N0: 2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或 添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和 EPSP合成酶活性的由（a)衍生的多肽；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤 (1)中的农杆菌接触， 从而使 EPSP合成酶 DNA编码序列转入植物细胞， 并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入 EPSP合成酶 DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；
(4)将步骤 (3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
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