CN104561040A

CN104561040A - 植物抗热基因htt3及其应用

Info

Publication number: CN104561040A
Application number: CN201410850508.0A
Authority: CN
Inventors: 何玉科; 李晓荣
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2031-12-26
Also published as: CN104561040B

Abstract

本发明涉及植物抗热基因HTT3及其应用。本发明公开了能够明显提高植株抗热能力的抗热基因，这些抗热基因可应用于抗热分子育种，提高植物耐热性，获得品种改良的植物。

Description

植物抗热基因HTT3及其应用

本发明是申请号为CN 201110443047.1的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术以及植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物抗热基因及其应用。

背景技术

温度逆境是影响蔬菜生产和限制其地域分布的主要因子之一。由于“温室效应”日益加剧，高温天气出现越来越频繁，尤其是近年来我国长江流域夏季的持续高温，严重制约粮食作物和果蔬类植物的生长和发育，农业生产面临严峻挑战。近50年中国长江流域共发生重大水稻热害事件6次。最近一次发生在2003年，保守估计全流域受害面积达3×10⁷公顷，损失稻谷达5.18×10⁷吨^[1]。20世纪80年代末，我国南方柑桔产区曾遭受3次大范围的高温热潮，给果蔬生产造成了巨大的损失。逆境胁迫可以引起植物体内一系列的生理生化反应：细胞膜透性增大，胞质外渗量增加；膜脂过氧化程度加剧，MDA积累；活性氧含量增加。植物体内启动抗氧化酶和非酶抗氧化物质发生应答性反应，以阻止、降低或修复由高温造成的损伤^[2,3]。由此可见，逆境下的植物并不是被动承受伤害，而是主动的调节适应。正是对这种逆境的不断适应过程，使植物在长期的进化过程中形成了完善的和复杂抗逆系统以适应不良环境。因此，对植物抗热机理进行更深入的研究，是认识植物与环境关系和培育新的抗性品种的重要途径之一，在理论和应用方面都有重要意义。

对植物抗热性的研究已成为目前一项重要的研究课题。受到种质资源的限制，传统育种方法很难在短期内显著改良非耐热作物的抗热性，所以通过重组耐热物种的抗热基因来实现提高非耐热作物的抗热性是现在研究的重要方向。植物体受到高温等不良环境胁迫时，体内自身的免疫系统会及时作出应急反应，产生一系列的应急反应，其中热激因子(Heat Shock factor，HsF)是胁迫诱导过程中的主要转录因子，通过转录激活其下游靶基因的表达，产生各种各样的酶类，增加了膜脂饱和度，提高了可溶性蛋白和一些保护性细胞组分的含量，保护机体蛋白质免遭损伤或修复已受损伤的蛋白质，对植物起保护作用，从而使植物获得耐热性，提高生物体的应激能力和在逆境中的存活率^{[2，3，4，5]}。由于热激因子与植物抗热性紧密联系在一起，因此热激蛋白及其下游基因的表达调控是当今分子生物学、蛋白质生物化学和植物抗逆生理的一个重要研究内容。很遗憾的是，对于其靶基因在植物体内是如何启动并进行抗热生理响应的机制研究尚不清楚。

近年来分子生物学研究发展迅速，尤其是基因芯片技术在作物分子育种上的应用也越来越广泛^[6，7]。其快速、敏感、高效、定量地分析基因的表达变化，满足了对植物抗热基因进行大通量的筛选需求。因此，本领域有必要以基因技术为平台，筛选在植物中具有抗热能力的基因，进行植物品种改良，提高植物耐热性，为丰富和平衡我国农作物市场提供抗热种质资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一类植物抗热基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种HTT多肽(Heat induced Ta-siR255Targets)或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高植物耐热性。

在一个优选例中，所述HTT多肽选自：

(a)具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的多肽；或

(b)将SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-50个；较佳地1-40个；较佳地1-30个；较佳地1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐热性功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21所示氨基酸序列具有40％(较佳地50％；更佳地60％；更佳地70％；更佳地80％；更佳地90％；更佳地95％；更佳地98％)以上相同性，且具有提高植物耐热性功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的编码HTT多肽的多核苷酸选自：具有SEQ ID NO:1，或SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3，或SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:7，或SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:14，或SEQ ID NO:16，或SEQ ID NO:18、或SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的植物选自：十字花科植物；更佳地选自芸苔属植物或鼠耳芥属植物；更佳地选自白菜(Brassica.rapa)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的多核苷酸；或

(b)将SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列中第11-14位核苷酸经过一个或多个(如1-8个；较佳的1-6个，更佳的1-5个，如2、3、4个)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合的功能的多核苷酸；或

(c)将SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列中第236-239位核苷酸经过一个或多个(如1-8个；较佳的1-6个，更佳的1-5个，如2、3、4个)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的，且具有拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合的功能的多核苷酸；或

(d)与上述(a)、(b)、(c)中所述核苷酸互补的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于提高植物耐热性。

在一个优选例中，所述植物选自：十字花科植物；更佳地选自芸苔属植物或鼠耳芥属植物；更佳地选自白菜(Brassica.rapa)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

在本发明的另一方面，提供一种提高植物耐热性的方法，所述方法包括：提高植物中HTT多肽的表达或活性；或

降低植物中ta-siR255的表达或活性；或

提高植物中ta-siR255的靶基因的表达。

在一个优选例中，所述的方法包括：将编码HTT多肽的多核苷酸转入植物中；或

将所述的多核苷酸转入植物中。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码HTT多肽的多核苷酸或所述的多核苷酸；

(ii)将植物细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述编码HTT多肽的多核苷酸或所述的多核苷酸转入植物。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述编码HTT多肽的多核苷酸或所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官；以及

(iv)将步骤(c)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。

在另一优选例中，所述植物选自：十字花科植物；更佳地选自芸苔属植物或鼠耳芥属植物；更佳地选自白菜(Brassica.rapa)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

在本发明的另一方面，提供一种耐热的植物，其是由前述方法制备获得的转基因植物。

在本发明的另一方面，提供一种HTT多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用作鉴定植物的耐热性的分子标记物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A-C、HTT1、HTT2、HTT3、At4G29760和At1G51670的表达分析。其中，ck表示野生型植株。

图1D、HTT1、HTT2、HTT3、At4G29760和At1G51670以及其它候选基因的聚类关系分析。

图2、HTT1、HTT2和HTT3的序列特征分析。

A、HTT1、HTT2和HTT3的mRNA上均存在ta-siR255的结合位点。

B、MIM255过表达载体的构建示意图。

C、HTT1.1、HTT2和HTT3启动子上均存在nnGAAnnTTCnnGAAnn和AGGGG基序。

图3、HTT1、HTT2和HTT3过量表达的转基因株系热处理实验。

A-C过量表达的转基因株系热处理后的植株生长情况，各自的左图表示植物生长情况，右图为左图中各分区所代表的植株的示意图。

D-G、定量RT-PCR分析mRNA在对照植株以及过表达植株中的积累量。

图4A、Ta-siR255前体TAS1a、TAS1b、TAS1c在热处理前后的响应。

图4B、Ta-siR255在热处理前后的响应。

图5A、HTT1和HTT2过表达株系热处理后植株存活率。

图5B、HTT3过表达株系热处理后植株存活率。

图5C、MIM255过表达株系热处理后三个株系存活率。

图6、拟南芥中HTT多肽与白菜中相应多肽的同源性预测和分析。

具体实施方式

本发明人致力于抗热基因的筛选，最终确定了一类能够明显提高植株抗热能力的抗热基因。这些抗热基因可应用于抗热分子育种，提高植物耐热性，获得品种改良的植物。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科的植物。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥属植物；禾本科的水稻、小麦、高粱、玉米；此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科芸薹属或鼠耳芥属的植物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“HTT多肽”是指来源于拟南芥或其它植物的与序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19或SEQ ID NO:21具有较高同源性(如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％)的一类多肽的总称。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的多肽(蛋白)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括HTT多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种HTT多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，所述的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持相应的全长多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持40％的全长多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长多肽的50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，所述的“HTT多肽”指具有提高植物耐热性功能活性的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11序列的多肽。该术语还包括具有与所述多肽相同功能的、上述序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽的功能。该术语还包括所述多肽的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与上述蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗所述蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

任何与所述的多肽同源性高的、且具有提高植物耐热性功能的多肽也包括在本发明内。

发明还提供所述蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“本发明的多肽的保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的氨基酸序列相比，有至多50个，较佳地至多40个，更佳地至多30个，更佳地至多20个，更佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还涉及编码本发明多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列，即HTT基因或其同源基因。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。所述的多核苷酸可以与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14，SEQID NO:16，SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的序列相同或者是简并的变异体。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽也具有提高植物耐热性的功能。

A.lyrata(Arabidopsis.lyrata)与拟南芥为同为十字花科鼠耳芥属，白菜(Brassica.rapa)属于十字花科芸苔属。拟南芥中HTT多肽与白菜中相应多肽的同源性预测和分析如图6，可见两种植物来源的多肽是高度同源的，具有同样的结构域，在植物中发挥的功能也是类同的。

应理解，虽然本发明的植物抗热(耐热)基因优选获自十字花科植物，但是获自其它植物的与拟南芥来源的HTT基因高度同源(如具有40％以上，较佳地50％以上，60％以上，更佳地70％以上，更佳地80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的多核苷酸的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐热性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的多肽或其编码基因的用途，用于提高植物的耐热性。

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括提高所述植物中HTT多肽的表达。

在得知了所述的多肽的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来提高所述多肽的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带多核苷酸的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的多肽。

作为本发明的一种实施方式，将多核苷酸通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到植物细胞中，使所述的植物细胞表达所述的多肽。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达所述多肽的植物。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的HTT基因或其同源基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入HTT基因或其同源基因的植物细胞、组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源HTT基因或其同源基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有HTT基因或其同源基因；

(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使HTT基因或其同源基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入HTT基因或其同源基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

其它增加HTT基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强HTT基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强HTT基因或其同源基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

此外，本发明还涉及利用HTT基因或其同源基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用HTT基因或其同源基因作为一种分子标记，通过检测植物中HTT基因或其同源基因的表达情况，鉴定植物的耐热性，并可作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。

本发明人在研究中还发现，HTT基因的mRNA上存在ta-siR255(该siRNA参见文献[10])的结合位点，植物中HTT基因或其同源基因的表达还受到ta-siR255的调控。ta-siR255与HTT基因的mRNA的结合导致HTT基因表达的降低，影响植物的耐热能力。因此，抑制ta-siR255的表达或活性的物质或者减少ta-siR255与HTT基因的mRNA结合的物质对于提高植物的耐热性是有用的。

在植物中表达特异性与一种阻断、减少或拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA互补或结合的多核苷酸，对于提高植物的耐热性也是有用的。过表达阻断、减少或拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA互补或结合的多核苷酸，可使得内源的ta-siR255竞争性地与该多核苷酸结合，从而减少了内源的ta-siR255对HTT表达的干扰。本领域技术人员基于公知的常识应理解，任何可与ta-siR255互补(部分互补或全部互补)或结合、且能够阻断、减少或拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合的多核苷酸对于本发明而言均是有用的。

作为本发明的优选方式，所述的阻断、减少或拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA互补或结合的多核苷酸是MIM255，其具有SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。MIM255可以竞争性地与内源的ta-siR255结合，使ta-siR255不起剪切作用，从而减少了ta-siR255对HTT表达的干扰。或者，所述的阻断、减少或拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA互补或结合的多核苷酸具有SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列(其中包含有MIM255的核苷酸序列)。

在具有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列的多核苷酸基础上，经过一个或多个(如1-8个；较佳的1-6个，更佳的1-5个，如2、3、4个)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的多核苷酸也包括在本发明中，只要其也具有阻断、减少或拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA互补或结合的活性。在设计这类多核苷酸时，适当的核苷酸取代、缺失或添加是本领域公知的技术，所述技术易于被实施并且确保不改变所得分子的生物活性(阻断、减少或拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合)。

因此，本发明还提供了一种提高植物耐热性的方法，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有能够拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合的多核苷酸；

(ii)将植物细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述能够拮抗ta-siR255与编码HTT多肽的mRNA结合的多核苷酸转入植物。

(iii)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织、器官；以及

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料与方法

一些基因的序列说明

拟南芥中：

HTT1(At4G29770)基因组序列如SEQ ID NO:1；

HTT1.1(At4G29770.1)开放阅读框序列如SEQ ID NO:2；

HTT1.2(At4G29770.2)开放阅读框序列如SEQ ID NO:3；

HTT1.1(AT4G29770)编码蛋白序列如SEQ ID NO:4；

HTT1.2(AT4G29770)编码蛋白序列如SEQ ID NO:5；

HTT2(At5G18040)基因组序列如SEQ ID NO:6；

HTT2(At5G18040)开放阅读框序列如SEQ ID NO:7；

HTT2(At5G18040)编码蛋白序列如SEQ ID NO:8；

HTT3(At5G18065)基因组序列如SEQ ID NO:9；

HTT3(At5G18065)开放阅读框序列如SEQ ID NO:10；

HTT3(At5G18065)编码蛋白序列如SEQ ID NO:11；

AT4G29760开放阅读框序列如SEQ ID NO:12；

AT4G29760编码蛋白序列如SEQ ID NO:13。

大白菜中，HTT同源基因有四个，分别为Bra039897，Bra011210，Bra010277和Bra010276：

Bra039897开放阅读框序列如SEQ ID NO:14；

Bra039897蛋白序列如SEQ ID NO:15；

Bra011210开放阅读框序列如SEQ ID NO:16；

Bra011210蛋白序列如SEQ ID NO:17；

Bra010277开放阅读框序列如SEQ ID NO:18；

Bra010277蛋白序列如SEQ ID NO:19；

Bra010276开放阅读框序列如SEQ ID NO:20；

Bra010276蛋白序列如SEQ ID NO:21。

干扰RNA：ta-siR255序列如SEQ ID NO:22。

MIM255的序列如SEQ ID NO:23。该序列作为ta-siR255的互补序列，比ta-siR255多了3个碱基，这可以有效地达到竞争性结合的作用。

植物组织总RNA提取

采用TaKaRa RNAiso Reagent抽提试剂盒提取植物组织总RNA。步骤：

a)将材料于液氮中充分研磨，以100mg材料1ml抽提缓冲液的量加入样品中，充分混匀，室温静置10分钟。

b)13000rpm离心5分钟，将上清转入新的离心管中，加入200μl氯仿，充分混匀，室温静置10分钟使其分层。

c)13000rpm离心5分钟，小心吸取上清于新的离心管中。

d)加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10分钟。

e)13000rpm离心5分钟，弃上清后用1ml75％乙醇洗一次。

f)7800rpm离心5分钟，弃上清后低速离心，用枪头吸去残留液体，室温晾干，待RNA刚刚干燥后加入适量的无RNase的水，65℃、10分钟充分溶解后存于-70℃。

定量RT-PCR引物

HTT1：

HTT1-RT-S：5’>GAAGCGTTGAAGCTGGGTATG<3’；(SEQ ID NO:25)

HTT1-RT-A：5’>GTCGTCACCATTAAGCGGGAG<3’(SEQ ID NO:26)；

HTT1.1：

HTT1.1-S：5’>AACTACGCTGAGGGGGAAATAAG<3’(SEQ ID NO:27)；

HTT1.1-A：5’>ACTAAGGAGGTTTCCGACAGTGT<3’(SEQ ID NO:28)；

HTT1.2:

HTT1.2-S：5’>GCAACGAAAATTGACAAAAACGG<3’(SEQ ID NO:29)；

HTT1.2-A：5’>ACTAAGGAGGTTTCCGACAGTGT<3’(SEQ ID NO:30)；

HTT2：

HTT2-RT-S：5’>TGGATAATGCTGGGAAGGAAG<3’(SEQ ID NO:31)；

HTT2-RT-A：5’>CTGGACAAACATACGGCTCAA<3’(SEQ ID NO:32)；

HTT3:

HTT3-RT-S：5’>GACTAAGAGTTTGGATGAAGCGT<3’(SEQ ID NO:33)；

HTT3-RT-A：5’>TTAGTTGACAGATAAGCGTGGG<3’(SEQ ID NO:34)；

ACTIN：

正向：5’>TGGCATCAYACTTTCTACAA<3’(SEQ ID NO:35)；

反向：5’>CCACCACTDAGCACAATGTT<3’(SEQ ID NO:36)。

TAS1a：

正向：5’>AGTAAACATGAGCGCCGTCAA<3’(SEQ ID NO:37)；

反向：5’>TGGCTGGTGACAAATAGACAGG<3’(SEQ ID NO:38)。

TAS1b：

正向：5’>AGTAAACATGAGCGCCGTCAA<3’(SEQ ID NO:39)；

反向：5’>CAAAGTTGTCTCCTCCTGAAA<3’(SEQ ID NO:40)。

TAS1c：

正向：5’>TCCTTCCCGTCCTCTTCTTTG<3’(SEQ ID NO:41)；

反向：5’>GATGCTTCTTCGCTACACCTC<3’(SEQ ID NO:42)。

Northern杂交探针

Ta-siR255：5’>TACGCTATGTTGGACTTAGAA(biotin)<3’(SEQ ID NO:43)。

U6：5’>TCATCCTTGCGCAGGGGCCA(biotin)<3’(SEQ ID NO:44)。

Real Time RT-PCR

试剂：AMV反转录酶(TAKARA)；RNase抑制剂(TAKARA)；DNase I(RNase free)(TAKARA)；SYBR green Kit(TAKARA)。

步骤：

a)分别提取不同热处理的拟南芥叶片的总RNA，用DNase I(RNase free)处理30分钟之后酚氯仿抽提，沉淀，吹干，无RNase的水溶解。

b)测OD260及电泳定量后，取1μg总RNA，按说明书操作，42℃反应1小时，94℃5分钟以使反转录酶失活。

c)反应使用TAKARA的SYBR green Kit。程序为94℃2min，94℃15sec，退火15sec，72℃30sec，40个循环。cDNA稀释10倍后加10μl，以ACTIN的引物作为内参。

PCR体系(25μl)：

SYBR green Kit 12.5μl；

5’引物 0.5μl；

3’引物 0.5μl；

cDNA 10μl；

ddH₂O 1.5μl。

构建过表达载体PCR引物

HTT1.1：

HTT1.1-S：5’>CTCTAGAGATGGAGTCATTGTTAGAATGTT<3’(SEQ ID NO:45)；

HTT1.1-A：

5’>CGCCATGGCGTCGACGTTGATAGAAAAACGTGGGATACAG<3’(SEQ IDNO:46)；

HTT1.2：

HTT1.2-S：5’>CGGGGTACCCGATGTTGTTGTTTAAGCCTTCA<3’(SEQ ID NO:47)；

HTT1.2-A：5’>CGCGGATCCTTAGTTGATAGAAAAACGTGGGATAC<3’(SEQ IDNO:48)；

HTT2：

HTT2-S：5’>CGGGGTACCATGAATATGATTCAGCGATTC<3’(SEQ ID NO:49)；

HTT2-A：5’>AACTGCAGTTAGTTGATAGATAAGCGTGGGAT<3’(SEQ ID NO:50)；

HTT3：

HTT3-S：5’>CGGGATCCTATGGATATGAATCAGCTATTCATGC<3’(SEQ ID NO:51)；

HTT3-A：

5’>CATGCCATGGTGTCGACCTTGAAAGCACATTCAAGGC<3’(SEQ ID NO:52)；

Mutant IPS1：

MIM255-S：

5’>AATACGCTATGTGCTAGGACTTAGAAAGCTTCGGTTCCCCTCG<3’(SEQID NO:53)；

MIM255-A：

5’>CTTTCTAAGTCCTAGCACATAGCGTATTTCTAGAGGGAGATAA<3’(SEQID NO:54)；

IPS1-S：5’>GTGGATCCAAGAAAAATGGCCATCCCCTAGC<3’(SEQ ID NO:55)；

IPS1-A：5’>ACGCGTCGACGAGGAATTCACTATAAAGAGAATCG<3’(SEQ IDNO:56)。

35S过表达载体构建

本文中抗热转基因株系使用的是基因组片段用PCR的方法从拟南芥基因组总DNA中克隆。具体的构建方法如下：

采用HTT1.1引物：在引物的两端分别加了Xba1，Sal1限制性内切酶位点，在克隆到HTT1.1的gDNA片段后，使用Xba1，Sal1双酶切后，连入表达载体pCAMBIA1301(购自CAMBIA)中。

分别采用HTT1.2，HTT2，HTT3引物，分别通过Kpn1/BamH1；Kpn1/Pst1；BamH1/Sal1双酶切连接到表达载体pCAMBIA1301中。

Mutant IPS1(SEQ ID NO:24，含有MIM255序列，在植物体内过表达后，可以与内源的ta-siR255结合，从而减少了ta-siR255对HTT表达的干扰，提高植物体内HTT的表达量)构建：利用IPS1-S，MIM255-A与MIM255-S，IPS1-A两对引物分别克隆MIM255前体的5’和3’端后，再通过IPS1-S，IPS1-A以5’和3’端片段为模板克隆全长片段。由于IPS1-S，IPS1-A引物的两端分别加入了BamH1/Sal1限制性内切酶位点，所以使用BamH1/Sal1双酶切后，连入表达载体pCAMBIA1301中即可。

c)利用冻融转化方法将转基因载体导入农杆菌GV3101(购自Invitrogen)中，并PCR鉴定。

冻融法农杆菌感受态细胞的制备及转化

a)从28℃培养48小时的新鲜平板中挑取农杆菌GV3101单菌落，转到20ml LB液体培养基(rif 50mg/l，GM 50mg/l)中，于28℃250rpm振荡培养过夜(不可太浓)。

b)冰浴20分钟后，将菌液分装5ml的离心管(每管4ml)中，冰浴10分钟。

c)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃菌液。

d)每管加入1ml充分预冷的20mM CaCl₂以重悬菌体。冰浴10分钟。

e)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃上清。

f)每管加入300μl 20mM CaCl₂(视菌体浓度而定)，合并后分管于1.5ml的离心管中。

g)每管加入1μl质粒或所有连接产物，冰浴5分钟，再放入液氮中4-5分钟。

h)37℃放5分钟，每管加入400μl LB培养基于28℃温育2小时使细菌复苏，并表达相应的抗生素抗性基因。

i)各取200μl体积涂板，室温放置一会儿，于28℃培养。

浸花法转化拟南芥及筛选

试剂：转化缓冲液(1L)：大量元素(50×)：10ml；微量元素(1000×)：0.5ml；CaCl₂(100×)：5ml；铁盐(200×)：2.5ml；有机(100×)：10ml；蔗糖：50g；6-BA(1mg/ml)：10μl；Silwet L-77：400μl(真空抽滤则用200μl)；用KOH调至pH5.8，定容1L。

筛选培养基平板：3％蔗糖MS₀固体培养基(pH5.8)加入卡那霉素(Kan)至50mg/l(用于Nossen背景拟南芥的筛选)。

步骤：

a)当拟南芥抽苔后茎高约5厘米时可以进行转化，若待转化的植株结实率低则要在植株打顶4天后进行。

b)转化前，将已授粉的花和角果去除掉。并使土壤吸水过夜。

c)将已培养过夜的农杆菌1:100稀释于大瓶培养基中，28℃培养24小时后，4℃5000rpm离心20分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于原菌液的两倍体积的转化缓冲液中，使OD600在0.8左右。

d)拟南芥的地上部分完全浸入菌液中30秒，取出平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日移入人工气候室正常竖直培养。收种子后干燥2周。

e)种子经无菌消毒后铺于含50mg/l Kan的Ms0固体平板中，经4℃春化两天后移到组培室，卡那抗性苗移到土中继续生长。

f)取叶片提取基因组DNA经PCR检测得到阳性苗，再经两代筛选得到转基因的纯系，用于进一步分析。

白菜转基因方法

真空抽滤法转化大白菜：接种含有目标载体的农杆菌于液体YEP培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，牛肉浸膏5g/L调节pH值为7)中，28℃，暗培养至适当浓度。4℃，5000rpm，离心15分钟收集菌体。向菌体沉淀中加入转化缓冲液(MS₀加适量silwet77)，用玻璃棒将沉淀打散，摇匀后置于真空罐待转化。将抽薹的白菜花序浸入菌液，盖好真空罐盖，真空泵抽气5分钟，放气2分钟。抽滤后的植物避光过夜。隔天将遮盖物拿开，之后视开花程度进行授粉。收获的种子在含有相应抗生素的MS₀培养基上进行抗性筛选。阳性植株可用于进一步的表型分析。

转基因抗热表型分析

分别挑选转HTT1，HTT2，HTT3基因过量表达和转MIM255的拟南芥T3代株系与野生型分别播种在MS₀培养基上，于22℃光照条件下培养7天。在野生型与转基因株系长一致的条件下，将培养皿放在44℃条件下热激1小时后，拿出来放在22℃光照条件下再培养7天，此时可观察到转基因株系较野生型在热激后能正常存活，显示其具有显著抗热性。白菜的转基因抗热表型也采用该存活试验进行分析。

II.实施例

实施例1、定量RT-PCR检测候选抗热基因在热处理后的表达

定量RT-PCR实验结果与芯片数据一致，热处理后，HTT1、HTT2和HTT3表达较处理前均有明显升高(图1)。其中，HTT2(At5G18040)的表达量在热处理0.5小时后上升了约10倍左右，之后则持续缓慢的上升，在本试验处理时间内，其最终达到的最高倍数约为处理前的18倍(图1A)；HTT3(At5G18065)的表达量在处理0.5小时提高了约23倍左右，并保持缓慢上升，处理时间内所能达到的最高倍数为40倍左右(图1A)；最有趣的是HTT1，在拟南芥中本发明人共检测到了两个转录本，分别命名为HTT1.1(At4G29770.1)和HTT1.2(At4G29770.2)。总的来说，HTT1的表达量在热处理0.5小时表现为急剧升高，达到了处理前的80倍左右，之后仍然持续升高。处理时间内，其所能达到的最高倍数为280倍左右(图1B)。其中HTT1.1和HTT1.2的表达发生类似的变化，只是，在同样的处理时间点下，HTT1.1的表达量较HTT1.2高出20-80倍左右；此外，本发明人还检测了At4G29760和At1G51670在热处理前后的表达模式(图1C)，结果表明At4G29760在处理后表现为逐渐升高的趋势，处理时间内其所能达到的最高倍数为8倍左右。而At1G51670的表达则在热处理后0.5-3小时出现下降的趋势，之后又逐渐上调直至处理前5倍左右。

综上，这五个基因mRNA水平对热处理表现出来的响应，尤其是HTT1、HTT2和HTT3，无不揭示着它们与植物抗热存在着密切的关系。

本发明人分别克隆了HTT1、HTT2和HTT3，并对其序列进行了分析。结果表明：

(1)HTT1、HTT2和HTT3在亲缘关系上非常接近(图1D)，提示三者之间可能存在功能上的冗余。

(2)它们的mRNA上均存在ta-siR255的结合位点(图2A)，这一发现表明HTT1、HTT2和HTT3的基因表达存在转录后水平调控。

(3)启动子序列分析表明，HTT1.1、HTT2和HTT3启动子上均存在nnGAAnnTTCnnGAAnn和AGGGG基序(图2C)，这两类基序被认为是植物体内HSF结合基序^[8，9]。

所有这些序列特征无疑为本发明人更好的利用基因工程手段，通过各种层面调控HTT1、HTT2和HTT3的表达，从而改善植物抗热性提供了可能。

实施例2、拟南芥的抗热基因转基因植株表型

本发明人分别构建了多个转基因载体并转化拟南芥，获得了多个HTT1、HTT2和HTT3过量表达的转基因株系，并对这些转基因株系进行了热处理实验。结果如下：

HTT1和HTT2过表达株系较野生型对照和hsfA1a/1b双突变体(参见参考文献[11])(HsfA1A/1B是热激因子，它们可以激活HTT1、HTT2和HTT3的表达)均出现抗热表型(图3A)，定量RT-PCR分析表明其mRNA在过表达拟南芥植株中的积累量明显高于对照(图3D和3E)。

拟南芥中，HTT3过表达株系抗热分析表明，在所有的7个过表达株系中有2个株系有明显的抗热表型(图3B)，同样地，在这两个株系中本发明人也检测到了mRNA的高量积累(图3F)。

本发明人将前述构建的含有HTT1.2、HTT2、HTT3的pCAMBIA1301重组载体导入农杆菌GV3101，转化白菜，获得了多个HTT1、HTT2和HTT3过量表达的转基因株系，并对这些转基因株系进行热处理实验。

转基因白菜抗热实验结果：对转基因白菜T2代阳性苗进行44℃热激1小时后，于22℃光照条件下培养7天，可见转HTT1，HTT2，HTT3过量表达的白菜幼苗存活率远远高于野生型对照植株，高50％以上。

实施例3、调控HTT1、HTT2和HTT3的表达改善植物抗热性

本发明人拟通过转录后水平调控HTT1、HTT2和HTT3的表达，进而改善植物抗热性。

为此，本发明人构建了MIM255过表达载体(图2B)并转入拟南芥。在得到的4个株系中，有3个株系表现出明显的抗热表型(图3C)。与之相对应的是其mRNA的过量积累(图3G)。

本发明人还测定了Ta-siR255前体TAS1a、TAS1b、TAS1c在热处理前后的响应，结果如图4A；以及测定了Ta-siR255在热处理前后的响应，结果如图4B。可见Ta-siR255前体在热处理之后，发生显著表达上调；但是，Ta-siR255响应热处理上调的时间明显滞后于其靶基因热响应的时间，这一现象暗示靶基因在热处理后表达急剧增加可能是由于Ta-siR255的剪切效应暂时解除所致，随着热处理时间的延长，Ta-siR255也会上调，这也保证了HTT基因的表达不会失控。

实施例4、热处理成活率的定量统计结果

所有获得的T3代纯合转基因拟南芥株系热处理后的成活率统计如图5。由图5A可见，HTT1和HTT2过表达株系热处理后，植株存活率均在90％以上。由图5B可见，HTT3过表达株系热处理后植株存活率约为90％。由图5C可见，MIM255过表达株系热处理后三个株系存活率在85％以上，个别株系存活率约为12％，与此对应的是此株系中MIM255的表达量也相对较低。此外，热处理野生型植株(CK)的存活率仅为5％左右。

综上，拟南芥HTT1、HTT2和HTT3是非常有效的抗热基因。合理地利用它们多种多样的调控方式，通过基因工程改善植物的抗热性，提高植物在热胁迫逆境条件下的生存能力有着非常广阔的应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

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[2]曾庆平，郭勇.植物逆境应答与系统抗性诱导.生命的化学.1997，17(3)：31-33.

[3]宋洪元，雷建军，李成琼.植物热胁迫反应及抗热性鉴定与评价.中国蔬菜.1998，(1)：48-50.

[4]马德华，庞金安，霍振荣等.黄瓜对不同温度逆境的抗性研究.中国农业科学1999，32(5)：28-35.

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[6]李同祥，王进科.基因芯片与植物基因差异表达分析.植物研究.2002.22(3)：310-313.

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[10]Angela P,Manabu Y,Gang W,Heidi L.A,R.Scott P.SGS3andSGS2/SDE1/RDR6are required for juvenile development and the production oftrans-acting siRNAs in Arabidopsis.Genes Dev.2004.(18):2368-2379.

[11]Lohmann C,Eggers-Schumacher G,Wunderlich M,F.Two different heatshock transcription factors regulate immediate early expression of stress genes inArabidopsis.Mol Genet Genomics.2004.271(1):11-21.

Claims

1.一种HTT多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高植物耐热性；所述HTT多肽选自：

(a)SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽；或

(b)将SEQ ID NO:11所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高植物耐热性功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列具有40％以上相同性，且具有提高植物耐热性功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的编码HTT多肽的多核苷酸选自：SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的多核苷酸。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的植物是十字花科植物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的植物选自芸苔属植物或鼠耳芥属植物；更佳地选自白菜(Brassica.rapa)或拟南芥(Arabidopsisthaliana)。

5.一种提高植物耐热性的方法，所述方法包括：提高植物中HTT多肽的表达或活性，所述HTT多肽选自：

(a)SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽；或

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将编码HTT多肽的多核苷酸转入植物中。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码HTT多肽的多核苷酸；

(ii)将植物细胞、组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述编码HTT多肽的多核苷酸转入植物。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的植物是十字花科植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的植物选自芸苔属植物或鼠耳芥属植物；更佳地选自白菜(Brassica.rapa)或拟南芥(Arabidopsisthaliana)。

10.一种HTT多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用作鉴定植物的耐热性的分子标记物；所述HTT多肽选自：

(a)SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的多肽；或