CN111574605B

CN111574605B - 水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收积累中的应用

Info

Publication number: CN111574605B
Application number: CN202010522403.8A
Authority: CN
Inventors: 徐汉虹; 余迪雅; 林菲
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2040-06-10
Also published as: CN111574605A

Abstract

本发明公开了水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收积累中的应用。本发明发明人发现水稻基因OsLAT5可通过调控水稻对敌草快的吸收积累来降低水稻中敌草快含量，提高水稻对敌草快的抗性；也可以从遗传上改良水稻品种对敌草快的输导性，选育抗敌草快水稻品种。

Description

水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收积累中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收积累中的应用。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物，稻谷总产量居于世界产稻国家之首，水稻种植优劣直接关乎我国的粮食安全问题。杂草在稻田生产中普遍发生危害，它不仅与作物在养料、水分、阳光和空间上的争夺，还作为病虫的中间寄主诱导病虫害发生，对水稻产量和品质构成了严重的威胁。由此，转基因抗除草剂作物的研究得以快速发展，并大幅度改革了杂草治理技术，但研发周期长、效率偏低、容易产生基因逃逸等问题同样使得转基因抗除草剂作物面临着巨大的挑战。

敌草快，化学名称：1,1’-乙撑-2,2’-联吡啶，是典型的光合系统抑制剂，具有速效、不伤根、遇土钝化、利于后茬等特点，被广泛应用于大田、果园、非耕地、水生杂草的防除。分离克隆水稻的敌草快转运基因和蛋白，利用基因编辑技术培育出抗敌草快水稻品种，在生产上既能保证除草的目的也能减少水稻中敌草快残留积累，降低环境污染和人体健康风险，还能避免转基因抗除草剂作物的不足，具有重要的商业价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收积累中的应用。

本发明的另一目的在于提供水稻基因OsLAT5在培育抗敌草快水稻品种中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收积累中的应用，是基于本发明发明人发现敲除OsLAT5基因可以抑制水稻对敌草快的吸收累积，降低水稻中敌草快含量，提高水稻对敌草快的抗性。

所述的水稻基因OsLAT5编码的蛋白质，其氨基酸序列为下列A、B或C：

A.如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

B.以上A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加(不超过10个)而获得的仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列；

C.以上A或B蛋白质的N段和/或C端连接标签得到的融合蛋白质的氨基酸序列。

所述的水稻基因OsLAT5，其核苷酸序列为下列D、E或F中的任意一种：

D.如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

E.与D所限定的核苷酸序列至少具有70％以上同源性，且编码如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸的核苷酸序列；

F.严格条件下与D所限定的核苷酸杂交，且编码如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸的核苷酸序列。

水稻基因OsLAT5在培育抗敌草快水稻品种中的应用。

A.如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

D.如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

所述的水稻基因OsLAT5在培育抗敌草快水稻品种中的应用，具体通过抑制出发植物水稻中蛋白质OsLAT5的表达和/或活性，得到抗敌草快水稻品种。

所述的抑制出发植物水稻中蛋白质OsLAT5的表达和/或活性的方法为基因定点编辑、RNA干扰、同源重组、基因敲除等本领域常规方法。

所述的基因敲除具体可为使出发植物含有CRISPR-Cas9系统，系统中含有识别靶标为出发植物的OsLAT5基因的sgRNA。

所述的靶标的序列如SEQ ID NO：7所示。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.敲除水稻基因OsLAT5可以抑制水稻对除草剂敌草快的吸收累积，减少水稻植株中敌草快的含量，降低对人体的健康风险。

2.敲除水稻基因OsLAT5可以从遗传上改良水稻品种对敌草快的输导性，提高水稻对敌草快的抗性，选育抗敌草快水稻品种。

3.本申请将敌草快吸收积累和抗性机理结合的手段为抗除草剂作物的研究提供一个很好的选择。

附图说明

图1为中花11和OsLAT5基因的突变体的序列比对结果图。

图2为中花11和OsLAT5基因的突变体的叶片离体浸泡敌草快后的表型图。

图3为中花11和OsLAT5基因的突变体的叶片中叶绿素总含量检测结果图。

图4为中花11和OsLAT5基因的突变体的叶片中敌草快含量的检测结果图。

图5为5mmol/L敌草快喷雾处理中花11后，不同时间OsLAT5基因的实时荧光定量PCR检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。实施例中所使用的化学试剂均为进口或国产分析纯。

实施例中大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105为常用的菌株，可商业上购买得到；水稻品种为野生型中花11(公开使用的水稻品种，市售)。实施例中所使用的引物由深圳华大基因公司合成，测序在深圳华大基因公司进行。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：CRISPR敲除构建OsLAT5突变体植株

1、利用CRISPR/Cas9系统，根据OsLAT5的外显子序列选择靶标序列

利用简单、高效的CRISPR/Cas9系统，根据OsLAT5外显子序列选择特异的靶标序列，靶标序列：5’-ggcccactcctagcaattgc-3’。靶标序列针对OsLAT5基因，特异的使OsLAT5蛋白失活。

2、构建含上述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体

1)根据靶标序列，设计带粘性末端的接头引物

将设计的靶标序列添加pCRISPR/Cas9系统的特异粘性末端接头，并合成完整的接头引物。

F1：5’-TGTGTGGCCCACTCCTAGCAATTGC-3’；

R1：5’-AAACGCAATTGCTAGGAGTGGGCCA-3’。

2)将带粘性末端的接头引物退火互补形成带粘性末端的双链小片段

将F1引物和R1引物稀释成浓度为10μM的溶液，各取10μL混匀，在PCR仪中进行退火反应，从98℃降至22℃，使F1引物和R1引物互补形成带粘性末端的双链小片段。

3)酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA(TAKARA Cat#632640)

用限制性内切酶BsaⅠ酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA，产生可以和靶标序列粘性末端互补的粘性末端。用BsaⅠ酶切pOs-sgRNA原始载体的体系为：10×buffer 2μL、BsaⅠ酶1μL、pOs-sgRNA载体4μg、ddH₂O补足至20μL；37℃酶切12h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳核查条带大小后，试剂盒(OMEGACat#D2500-02)过柱回收纯化酶切产物，得到酶切过的pOs-sgRNA载体，加入灭菌的ddH₂O溶解，测定浓度后待用。

4)将带粘性末端的双链小片段连接到酶切过的pOs-sgRNA载体上，形成包含靶标序列和sg-RNA的重组载体

用T4连接酶将步骤2)中的双链小片段和步骤3)中酶切过的pOs-sgRNA载体连接，形成完整的包含针对OsLAT5蛋白的靶序列和sg-RNA的重组载体。15μL连接体系为：10×T4ligation buffer 1.5μL、双链小片段4μL、酶切过的pOs-sgRNA载体3μL、T4 DNA ligase 1μL、ddH₂O补足至15μL，16℃连接12小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α，卡那抗性LB平板过夜培养(含卡那霉素10mg/L)，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含靶标序列和sg-RNA的重组载体。

5)用LRmix将包含靶标序列和sg-RNA的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubicas9-7进行LR反应重组，形成包含靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体

用LR mix(上海北诺生物科技有限公司)将步骤4)得到的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubi-cas9-7(百格基因科技有限公司提供)进行LR反应重组。LR反应体系：包含靶标序列和sg-RNA的重组载体25-50ng、pH-Ubi-cas9-7载体75ng、5×LR Clonase TM buffer 1μL、TE Buffer(pH8.0)补充到4.5μL、LR ClonaseTM 0.5uL。将体系于25℃下温育2h，反应后加2μL 2μg/μL的Proteinase K，在37℃下处理10min。再将2μL反应产物转入大肠杆菌DH5α，庆大霉素抗性LB平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌株进行测序，得到包含OsLAT5蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整pCRISPR/Cas9-OsLAT5重组表达载体。

3、将所获得的包含OsLAT5蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因植株

1)将步骤2获得的重组表达载体pCRISPR/Cas9-OsLAT5电击转入农杆菌EHA105(Olivia C.D,2019)中，得到重组菌AGL1/pCRISPR/Cas9-OsLAT5。

2)将重组菌AGL1/pCRISPR/Cas9-OsLAT5用农杆菌介导的方法转化中花11水稻愈伤组织，具体如下：

挑取AGL1/pCRISPR/Cas9-OsLAT5单菌落，接种于10mL的农杆菌培养基中(含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L)，28℃、180rpm摇床培养2-3天。取4mL菌液，4000rpm离心3min，倒去上清液，加入少量AAM培养基重新悬浮细胞，然后加入20mL的AAM培养基(含0.1mM乙酰丁香酮As)，28℃、150rpm摇床避光培养1-2h，培养至OD₆₀₀＝0.4左右。挑选生长状态良好、颗粒状中花11(以下也称为野生型水稻)水稻愈伤组织浸入农杆菌培养液(不含琼脂的YEP)中，28℃、150-200rpm摇20min，将愈伤组织倒出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织平铺在含多层滤纸的无菌平皿中，超净台上吹干(愈伤分散不结块)，然后将愈伤组织转移到共培养培养基上，黑暗条件下培养2-3天。将愈伤转至含有100mg/L的潮霉素和400mg/L头孢霉素的NB基本培养基上筛选3-4周(一筛)。将成活的愈伤组织转入二筛培养基(含100mg/L潮霉素及200mg/L头孢霉素的NB基本培养基)上筛选3周。将抗性愈伤组织转入分化培养基(含100mg/L潮霉素)上进行分化，再生植株在含100mg/L潮霉素的壮苗培养基上生根后(约3-4周)转移至温室中，在T0代植株中就可以得到OsLAT5蛋白完全失活的转基因植株。

上述转化中所用的培养基如下：

共培养培养基(北京华越洋生物科技有限公司)：诱导愈伤及继代培养基+As(0.1mM/L)+葡萄糖(10g/L)，pH 5.2。

农杆菌侵染水稻愈伤组织培养基(AAM培养基，北京华越洋生物科技有限公司)：AA大量元素+AA微量元素+AA氨基酸+MS维生素+水解酪蛋白(500mg/L)+蔗糖(68.5g/L)+葡萄糖(36g/L)+As(0.1mM)，pH 5.2。

NB基本培养基(北京华越洋生物科技有限公司)：N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+铁盐+水解酪蛋白(300mg/L)+脯氨酸(500mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(8g/L)，pH 5.8。

诱导愈伤及继代培养基：NB基本培养基+2，4-D(2mg/L)。

分化培养基：NB基本培养基+6-BA(3mg/L)+NAA(1mg/L)。

壮苗培养基：1/2MS培养基+NAA(0.5mg/L)+MET(0.25mg/L)。

农杆菌培养基(YEP)：10g/L胰化蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/L氯化钠+15g/L琼脂。

4、筛选转基因植株中的转基因阳性植株

将步骤3移栽的转基因植株(T₀代)提取DNA(OMEGACat#D3485-02)，进行靶序列位点检测，共检测到13株阳性植株。

5、利用转基因阳性植株获得突变体植株

1)突变位点的鉴定

将移栽的步骤4的阳性植株提取DNA(OMEGA Cat#D3485-02)，针对含靶标位点的500bp以内的DNA片段，设计特异性引物F2和R2，扩增含靶标位点的DNA片段，扩增得到的417bp PCR产物，经纯化后送公司测序，测序结果与野生型植株序列比对，筛选出突变体植株。

F2:5’-GTGTTGCATGGTGAAACAAGGA-3’；

R2:5’-CAAGGGCTGAAGAGACCCAG-3’。

2)将突变体植株进行繁种，于T1代转基因分离群体中检测不含潮霉素、Cas9等转基因元件的植株单株，收种子，得到功能缺失突变体，分别命名为Crispr-1、Crispr-2和Crispr-3。功能缺失突变体与野生型植株的突变分析结果如图1所示。

实施例2：水稻对敌草快抗性试验

为了检测实施例1得到的功能缺失突变体水稻对敌草快的抗性，挑选在水稻培养箱生长30天的植株，剪取同等长度的叶片浸泡于20mL 0.1％(v/v)Silwet L-77(北京博奥拓达科技有限公司)溶液中(含5mmol/L敌草快)，静置于人工气候培养箱培养36h。36h后将水稻取出，用纯水清洗叶片4遍，确保完全清除叶片表面附着的药物，用滤纸擦干表面水分，观察表型并拍照后，用于后续试验。

测叶绿素含量的实验条件和方法按照文献(周勇，范晓磊，林拥军，陈浩.(2018).水稻叶绿素含量的测定.Bio-101e1010147.)。

测敌草快含量：称重记录，随后放入研钵中加液氮磨碎，加入5mL提取液(甲醇和1mol/L甲酸溶液按照体积比1:9配比)提取，涡旋5min，超声10min，4000rpm离心10min，吸取上清液过0.22μm的针头微孔滤膜除去杂质后，取500μL浓缩，定容(用100μL体积比为1:9的甲醇和1mol/L甲酸溶液的混合液)，装入进样瓶中，采用Waters ACQUITY TQD串联四极杆液质联用仪检测。

结果表明，浸泡敌草快后突变体植株叶片正常而野生型叶片逐渐失绿发黄(图2)，突变体叶片的叶绿素含量比野生型中花11高(图3)，而敌草快含量比野生型中花11明显降低(图4)。

实施例3敌草快处理水稻后的实时荧光定量试验

配制0.1％(v/v)Silwet L-77(北京博奥拓达科技有限公司)溶液(含5mmol/L敌草快)，对生长25天的野生型品种中花11植株进行喷雾处理，以0.1％(v/v)Silwet L-77溶液(不含药)处理作为对照。处理后分别提取喷雾处理后0h、2h、4h、9h的地上部分(茎和叶)RNA(OMEGA Cat#R6827-02)，反转录(Takara,PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser)后进行实时荧光定量PCR以检测OsLAT5基因的表达。实验设三次重复，结果取平均值。

实时荧光定量PCR使用Bio-Rad CFX96进行。PCR反应体系(20μL)按照产品使用说明书SYBR Green Real-Time PCR Master Mix reagent(Takara)进行，具体体系如下：10μLSYBR Green Real-Time PCR Master Mix、2μL上下游引物混合物(上下游引物浓度均为10μM)、7μL RNase-free water、1μL cDNA模板。具体反应程序如下：酶热激活95℃、30s，1个循环；变性95℃、5s，延伸60℃、30s，共40个循环。

扩增OsLAT5基因的引物序列为：

F3：5’-CGCCTCCCGACCTTACAA-3’；

R3：5’-GCACGAACCCAACCAGCA-3’。

以UBQ2作为内参基因，扩增内参UBQ2的引物序列为：

F4：5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’；

R4：5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’。

数据的处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(OsLAT5)-Ct(ACTIN1)，以2^－△△Ct的值衡量基因转录水平，对样品中OsLAT5基因的表达进行分析比较。

结果如图5所示，在敌草快处理条件下，水稻地上部分(茎和叶)中OsLAT5基因的特异性表达受到诱导，且随着时间的推移上调愈发强烈。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120>水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收转运中的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 550

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Asn Ala Trp Ile Ser Pro Ser Val Val Ala Leu Cys Pro Ser

1 5 10 15

Pro Leu Pro Ser Ser Arg Leu Pro Gly Ser Val Leu Ser Cys Trp Pro

20 25 30

Asp Ser Arg Gly Ile Arg Arg Gly Ala Gly Glu Gly Thr Ala Gly Gln

35 40 45

Thr Leu Arg Pro Ala Arg Gly Phe Thr Val Glu Lys Leu Arg Asn Thr

50 55 60

Ala Ile Thr Arg Ala Asn Ser Ala Cys Leu Pro Met Glu Asp Cys Val

65 70 75 80

Gly Ile Lys Tyr Ser Ser Val Asn Glu Gly Glu Glu Arg Lys Gly Gly

85 90 95

His Gly Val Pro Lys Val Ser Ile Ile Pro Leu Ile Phe Leu Ile Phe

100 105 110

Tyr Glu Val Ser Gly Gly Pro Phe Gly Ile Glu Asp Ser Val Lys Ala

115 120 125

Ala Gly Pro Leu Leu Ala Ile Ala Gly Phe Leu Leu Phe Ala Leu Ile

130 135 140

Trp Ser Val Pro Glu Ala Leu Ile Thr Ala Glu Met Gly Thr Met Phe

145 150 155 160

Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Val Val Trp Val Ser Ser Ala Leu Gly Pro

165 170 175

Phe Trp Gly Phe Gln Gln Gly Trp Ala Lys Trp Leu Ser Gly Val Ile

180 185 190

Asp Asn Ala Leu Tyr Pro Val Leu Phe Leu Asp Tyr Val Lys Ser Ser

195 200 205

Ile Pro Ala Leu Gly Gly Gly Leu Pro Arg Thr Leu Ala Val Leu Ile

210 215 220

Leu Thr Val Ala Leu Thr Tyr Met Asn Tyr Arg Gly Leu Thr Ile Val

225 230 235 240

Gly Trp Val Ala Val Phe Leu Gly Val Phe Ser Leu Leu Pro Phe Phe

245 250 255

Val Met Gly Leu Ile Ala Ile Pro Arg Ile Glu Pro Ser Arg Trp Leu

260 265 270

Glu Met Asp Leu Gly Asn Val Asn Trp Gly Leu Tyr Leu Asn Thr Leu

275 280 285

Phe Trp Asn Leu Asn Tyr Trp Asp Ser Ile Ser Thr Leu Ala Gly Glu

290 295 300

Val Glu Asn Pro Lys Arg Thr Leu Pro Arg Ala Leu Ser Tyr Ala Leu

305 310 315 320

Val Leu Val Val Gly Gly Tyr Leu Tyr Pro Leu Ile Thr Cys Thr Ala

325 330 335

Ala Val Pro Val Val Arg Glu Phe Trp Thr Asp Gly Tyr Phe Ser Asp

340 345 350

Val Ala Arg Ile Leu Gly Gly Phe Trp Leu His Ser Trp Leu Gln Ala

355 360 365

Ala Ala Ala Leu Ser Asn Met Gly Asn Phe Val Thr Glu Met Ser Ser

370 375 380

Asp Ser Tyr Gln Leu Leu Gly Met Ala Glu Arg Gly Met Leu Pro Glu

385 390 395 400

Phe Phe Ala Lys Arg Ser Arg Tyr Gly Thr Pro Leu Ile Gly Ile Met

405 410 415

Phe Ser Ala Phe Gly Val Val Leu Leu Ser Trp Met Ser Phe Gln Glu

420 425 430

Ile Ile Ala Ala Glu Asn Tyr Leu Tyr Cys Phe Gly Met Ile Leu Glu

435 440 445

Phe Ile Ala Phe Ile Lys Leu Arg Val Val His Pro Asn Ala Ser Arg

450 455 460

Pro Tyr Lys Ile Pro Leu Gly Thr Ile Gly Ala Val Leu Met Ile Ile

465 470 475 480

Pro Pro Thr Ile Leu Ile Val Val Val Met Met Leu Ala Ser Phe Lys

485 490 495

Val Met Val Val Ser Ile Met Ala Met Leu Val Gly Phe Val Leu Gln

500 505 510

Pro Ala Leu Val Tyr Val Glu Lys Arg Arg Trp Leu Lys Phe Ser Ile

515 520 525

Ser Ala Glu Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Ser Asn Val Glu Glu Asp Ser

530 535 540

Thr Ile Pro Leu Val Cys

545 550

<210> 2

<211> 492

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Leu Arg Asn Thr Ala Ile Thr Arg Ala Asn Ser Ala Cys Leu

1 5 10 15

Pro Met Glu Asp Cys Val Gly Ile Lys Tyr Ser Ser Val Asn Glu Gly

20 25 30

Glu Glu Arg Lys Gly Gly His Gly Val Pro Lys Val Ser Ile Ile Pro

35 40 45

Leu Ile Phe Leu Ile Phe Tyr Glu Val Ser Gly Gly Pro Phe Gly Ile

50 55 60

Glu Asp Ser Val Lys Ala Ala Gly Pro Leu Leu Ala Ile Ala Gly Phe

65 70 75 80

Leu Leu Phe Ala Leu Ile Trp Ser Val Pro Glu Ala Leu Ile Thr Ala

85 90 95

Glu Met Gly Thr Met Phe Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Val Val Trp Val

100 105 110

Ser Ser Ala Leu Gly Pro Phe Trp Gly Phe Gln Gln Gly Trp Ala Lys

115 120 125

Trp Leu Ser Gly Val Ile Asp Asn Ala Leu Tyr Pro Val Leu Phe Leu

130 135 140

Asp Tyr Val Lys Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly Gly Gly Leu Pro Arg

145 150 155 160

Thr Leu Ala Val Leu Ile Leu Thr Val Ala Leu Thr Tyr Met Asn Tyr

165 170 175

Arg Gly Leu Thr Ile Val Gly Trp Val Ala Val Phe Leu Gly Val Phe

180 185 190

Ser Leu Leu Pro Phe Phe Val Met Gly Leu Ile Ala Ile Pro Arg Ile

195 200 205

Glu Pro Ser Arg Trp Leu Glu Met Asp Leu Gly Asn Val Asn Trp Gly

210 215 220

Leu Tyr Leu Asn Thr Leu Phe Trp Asn Leu Asn Tyr Trp Asp Ser Ile

225 230 235 240

Ser Thr Leu Ala Gly Glu Val Glu Asn Pro Lys Arg Thr Leu Pro Arg

245 250 255

Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Val Leu Val Val Gly Gly Tyr Leu Tyr Pro

260 265 270

Leu Ile Thr Cys Thr Ala Ala Val Pro Val Val Arg Glu Phe Trp Thr

275 280 285

Asp Gly Tyr Phe Ser Asp Val Ala Arg Ile Leu Gly Gly Phe Trp Leu

290 295 300

His Ser Trp Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Ser Asn Met Gly Asn Phe

305 310 315 320

Val Thr Glu Met Ser Ser Asp Ser Tyr Gln Leu Leu Gly Met Ala Glu

325 330 335

Arg Gly Met Leu Pro Glu Phe Phe Ala Lys Arg Ser Arg Tyr Gly Thr

340 345 350

Pro Leu Ile Gly Ile Met Phe Ser Ala Phe Gly Val Val Leu Leu Ser

355 360 365

Trp Met Ser Phe Gln Glu Ile Ile Ala Ala Glu Asn Tyr Leu Tyr Cys

370 375 380

Phe Gly Met Ile Leu Glu Phe Ile Ala Phe Ile Lys Leu Arg Val Val

385 390 395 400

His Pro Asn Ala Ser Arg Pro Tyr Lys Ile Pro Leu Gly Thr Ile Gly

405 410 415

Ala Val Leu Met Ile Ile Pro Pro Thr Ile Leu Ile Val Val Val Met

420 425 430

Met Leu Ala Ser Phe Lys Val Met Val Val Ser Ile Met Ala Met Leu

435 440 445

Val Gly Phe Val Leu Gln Pro Ala Leu Val Tyr Val Glu Lys Arg Arg

450 455 460

Trp Leu Lys Phe Ser Ile Ser Ala Glu Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Ser

465 470 475 480

Asn Val Glu Glu Asp Ser Thr Ile Pro Leu Val Cys

485 490

<210> 3

<211> 475

<212> PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Asp Cys Val Gly Ile Lys Tyr Ser Ser Val Asn Glu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Arg Lys Gly Gly His Gly Val Pro Lys Val Ser Ile Ile Pro Leu

20 25 30

Ile Phe Leu Ile Phe Tyr Glu Val Ser Gly Gly Pro Phe Gly Ile Glu

35 40 45

Asp Ser Val Lys Ala Ala Gly Pro Leu Leu Ala Ile Ala Gly Phe Leu

50 55 60

Leu Phe Ala Leu Ile Trp Ser Val Pro Glu Ala Leu Ile Thr Ala Glu

65 70 75 80

Met Gly Thr Met Phe Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Val Val Trp Val Ser

85 90 95

Ser Ala Leu Gly Pro Phe Trp Gly Phe Gln Gln Gly Trp Ala Lys Trp

100 105 110

Leu Ser Gly Val Ile Asp Asn Ala Leu Tyr Pro Val Leu Phe Leu Asp

115 120 125

Tyr Val Lys Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly Gly Gly Leu Pro Arg Thr

130 135 140

Leu Ala Val Leu Ile Leu Thr Val Ala Leu Thr Tyr Met Asn Tyr Arg

145 150 155 160

Gly Leu Thr Ile Val Gly Trp Val Ala Val Phe Leu Gly Val Phe Ser

165 170 175

Leu Leu Pro Phe Phe Val Met Gly Leu Ile Ala Ile Pro Arg Ile Glu

180 185 190

Pro Ser Arg Trp Leu Glu Met Asp Leu Gly Asn Val Asn Trp Gly Leu

195 200 205

Tyr Leu Asn Thr Leu Phe Trp Asn Leu Asn Tyr Trp Asp Ser Ile Ser

210 215 220

Thr Leu Ala Gly Glu Val Glu Asn Pro Lys Arg Thr Leu Pro Arg Ala

225 230 235 240

Leu Ser Tyr Ala Leu Val Leu Val Val Gly Gly Tyr Leu Tyr Pro Leu

245 250 255

Ile Thr Cys Thr Ala Ala Val Pro Val Val Arg Glu Phe Trp Thr Asp

260 265 270

Gly Tyr Phe Ser Asp Val Ala Arg Ile Leu Gly Gly Phe Trp Leu His

275 280 285

Ser Trp Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Ser Asn Met Gly Asn Phe Val

290 295 300

Thr Glu Met Ser Ser Asp Ser Tyr Gln Leu Leu Gly Met Ala Glu Arg

305 310 315 320

Gly Met Leu Pro Glu Phe Phe Ala Lys Arg Ser Arg Tyr Gly Thr Pro

325 330 335

Leu Ile Gly Ile Met Phe Ser Ala Phe Gly Val Val Leu Leu Ser Trp

340 345 350

Met Ser Phe Gln Glu Ile Ile Ala Ala Glu Asn Tyr Leu Tyr Cys Phe

355 360 365

Gly Met Ile Leu Glu Phe Ile Ala Phe Ile Lys Leu Arg Val Val His

370 375 380

Pro Asn Ala Ser Arg Pro Tyr Lys Ile Pro Leu Gly Thr Ile Gly Ala

385 390 395 400

Val Leu Met Ile Ile Pro Pro Thr Ile Leu Ile Val Val Val Met Met

405 410 415

Leu Ala Ser Phe Lys Val Met Val Val Ser Ile Met Ala Met Leu Val

420 425 430

Gly Phe Val Leu Gln Pro Ala Leu Val Tyr Val Glu Lys Arg Arg Trp

435 440 445

Leu Lys Phe Ser Ile Ser Ala Glu Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Ser Asn

450 455 460

Val Glu Glu Asp Ser Thr Ile Pro Leu Val Cys

465 470 475

<210> 4

<211> 1653

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgacgaacg catggatctc gccgtcggtg gtcgccctct gcccctctcc cctcccctca 60

tctcgcctcc cgggttctgt cctctcctgc tggccggaca gccgcggcat ccggcgcggg 120

gctggcgagg ggacagccgg acagacgctg cggccggcga ggggattcac tgtagagaaa 180

ttaaggaaca cagcaataac acgagctaac tcagcctgtc ttccaatgga ggattgtgtt 240

ggtatcaagt acagcagtgt caatgagggc gaagagcgta agggaggcca tggcgtccca 300

aaggtttcca tcatcccact cattttcctc atattctatg aagtttctgg gggtccgttt 360

gggattgagg atagtgtcaa ggctgctggc ccactcctag caattgctgg atttctgctg 420

tttgcactca tatggagtgt cccggaagcc ctgattactg cagagatggg cactatgttt 480

cctgagaatg gtggttacgt cgtctgggtc tcttcagccc ttgggccatt ctggggtttt 540

cagcaaggct gggcaaagtg gctgagtggt gtcatagata atgctctcta tccagtcctc 600

ttcctcgact atgttaagtc cagcattcca gctcttggag gtggtctccc aaggaccttg 660

gcggtgctta tcctcacagt tgcacttact tacatgaact acagagggtt gacaatagtt 720

ggctgggtgg cagtctttct tggcgtgttc tctctactcc cgttttttgt tatgggatta 780

atagctattc cccgaatcga accctcaaga tggcttgaaa tggacttggg gaatgtgaat 840

tggggtttat atctaaacac actgttttgg aacctcaatt attgggactc aatcagtacc 900

cttgctggag aggttgagaa tccaaagaga acactcccaa gggcactttc ttatgctcta 960

gttttagtgg tggggggata cctctaccct ctgatcacct gtacagcagc agttccagtt 1020

gttcgggagt tctggacgga tggatatttc tcagacgttg cgagaattct tggtggtttc 1080

tggttgcact cgtggcttca agcagctgct gcactgtcca acatgggcaa tttcgtaact 1140

gaaatgagca gtgattctta ccagcttctc gggatggctg agcgtggaat gcttccagag 1200

tttttcgcca agagatctcg ctatggaacc ccacttattg gcatcatgtt ctccgcgttt 1260

ggtgtggtcc tgctgtcctg gatgagcttc caggagatca tcgctgcgga gaactacctg 1320

tactgcttcg gtatgatcct ggaattcatc gccttcatca agctgagggt ggtccaccca 1380

aacgcctccc gaccttacaa gatcccactg ggcaccatcg gcgctgtcct gatgatcatc 1440

ccacctacca ttctgatcgt cgtggtgatg atgctcgcgt ccttcaaggt gatggtggtc 1500

agcatcatgg caatgctggt tgggttcgtg ctgcagccgg ctctggtgta cgtggagaag 1560

agacggtggc tgaagttctc cataagcgca gaactgccag atttgccgta ctcgaacgtt 1620

gaggaagaca gcacaatccc acttgtgtgc tga 1653

<210> 5

<211> 1479

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaaattaa ggaacacagc aataacacga gctaactcag cctgtcttcc aatggaggat 60

tgtgttggta tcaagtacag cagtgtcaat gagggcgaag agcgtaaggg aggccatggc 120

gtcccaaagg tttccatcat cccactcatt ttcctcatat tctatgaagt ttctgggggt 180

ccgtttggga ttgaggatag tgtcaaggct gctggcccac tcctagcaat tgctggattt 240

ctgctgtttg cactcatatg gagtgtcccg gaagccctga ttactgcaga gatgggcact 300

atgtttcctg agaatggtgg ttacgtcgtc tgggtctctt cagcccttgg gccattctgg 360

ggttttcagc aaggctgggc aaagtggctg agtggtgtca tagataatgc tctctatcca 420

gtcctcttcc tcgactatgt taagtccagc attccagctc ttggaggtgg tctcccaagg 480

accttggcgg tgcttatcct cacagttgca cttacttaca tgaactacag agggttgaca 540

atagttggct gggtggcagt ctttcttggc gtgttctctc tactcccgtt ttttgttatg 600

ggattaatag ctattccccg aatcgaaccc tcaagatggc ttgaaatgga cttggggaat 660

gtgaattggg gtttatatct aaacacactg ttttggaacc tcaattattg ggactcaatc 720

agtacccttg ctggagaggt tgagaatcca aagagaacac tcccaagggc actttcttat 780

gctctagttt tagtggtggg gggatacctc taccctctga tcacctgtac agcagcagtt 840

ccagttgttc gggagttctg gacggatgga tatttctcag acgttgcgag aattcttggt 900

ggtttctggt tgcactcgtg gcttcaagca gctgctgcac tgtccaacat gggcaatttc 960

gtaactgaaa tgagcagtga ttcttaccag cttctcggga tggctgagcg tggaatgctt 1020

ccagagtttt tcgccaagag atctcgctat ggaaccccac ttattggcat catgttctcc 1080

gcgtttggtg tggtcctgct gtcctggatg agcttccagg agatcatcgc tgcggagaac 1140

tacctgtact gcttcggtat gatcctggaa ttcatcgcct tcatcaagct gagggtggtc 1200

cacccaaacg cctcccgacc ttacaagatc ccactgggca ccatcggcgc tgtcctgatg 1260

atcatcccac ctaccattct gatcgtcgtg gtgatgatgc tcgcgtcctt caaggtgatg 1320

gtggtcagca tcatggcaat gctggttggg ttcgtgctgc agccggctct ggtgtacgtg 1380

gagaagagac ggtggctgaa gttctccata agcgcagaac tgccagattt gccgtactcg 1440

aacgttgagg aagacagcac aatcccactt gtgtgctga 1479

<210> 6

<211> 1428

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggaggatt gtgttggtat caagtacagc agtgtcaatg agggcgaaga gcgtaaggga 60

ggccatggcg tcccaaaggt ttccatcatc ccactcattt tcctcatatt ctatgaagtt 120

tctgggggtc cgtttgggat tgaggatagt gtcaaggctg ctggcccact cctagcaatt 180

gctggatttc tgctgtttgc actcatatgg agtgtcccgg aagccctgat tactgcagag 240

atgggcacta tgtttcctga gaatggtggt tacgtcgtct gggtctcttc agcccttggg 300

ccattctggg gttttcagca aggctgggca aagtggctga gtggtgtcat agataatgct 360

ctctatccag tcctcttcct cgactatgtt aagtccagca ttccagctct tggaggtggt 420

ctcccaagga ccttggcggt gcttatcctc acagttgcac ttacttacat gaactacaga 480

gggttgacaa tagttggctg ggtggcagtc tttcttggcg tgttctctct actcccgttt 540

tttgttatgg gattaatagc tattccccga atcgaaccct caagatggct tgaaatggac 600

ttggggaatg tgaattgggg tttatatcta aacacactgt tttggaacct caattattgg 660

gactcaatca gtacccttgc tggagaggtt gagaatccaa agagaacact cccaagggca 720

ctttcttatg ctctagtttt agtggtgggg ggatacctct accctctgat cacctgtaca 780

gcagcagttc cagttgttcg ggagttctgg acggatggat atttctcaga cgttgcgaga 840

attcttggtg gtttctggtt gcactcgtgg cttcaagcag ctgctgcact gtccaacatg 900

ggcaatttcg taactgaaat gagcagtgat tcttaccagc ttctcgggat ggctgagcgt 960

ggaatgcttc cagagttttt cgccaagaga tctcgctatg gaaccccact tattggcatc 1020

atgttctccg cgtttggtgt ggtcctgctg tcctggatga gcttccagga gatcatcgct 1080

gcggagaact acctgtactg cttcggtatg atcctggaat tcatcgcctt catcaagctg 1140

agggtggtcc acccaaacgc ctcccgacct tacaagatcc cactgggcac catcggcgct 1200

gtcctgatga tcatcccacc taccattctg atcgtcgtgg tgatgatgct cgcgtccttc 1260

aaggtgatgg tggtcagcat catggcaatg ctggttgggt tcgtgctgca gccggctctg 1320

gtgtacgtgg agaagagacg gtggctgaag ttctccataa gcgcagaact gccagatttg 1380

ccgtactcga acgttgagga agacagcaca atcccacttg tgtgctga 1428

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶标序列

<400> 7

ggcccactcc tagcaattgc 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F1

<400> 8

tgtgtggccc actcctagca attgc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R1

<400> 9

aaacgcaatt gctaggagtg ggcca 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F2

<400> 10

gtgttgcatg gtgaaacaag ga 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R2

<400> 11

caagggctga agagacccag 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F3

<400> 12

cgcctcccga ccttacaa 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R3

<400> 13

gcacgaaccc aaccagca 18

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F4

<400> 14

tgctatgtac gtcgccatcc ag 22

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R4

<400> 15

aatgagtaac cacgctccgt ca 22

Claims

1.水稻基因OsLAT5在调节敌草快的吸收累积中的应用，其特征在于，所述的水稻基因OsLAT5编码的蛋白质，其氨基酸序列为下列A；所述的水稻基因OsLAT5，其核苷酸序列为下列B；

A. 如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

B. 如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

2.水稻基因OsLAT5在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，所述的水稻基因OsLAT5编码的蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如权利要求1所述。

3.根据权利要求2所述的水稻基因OsLAT5在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，具体通过抑制出发植物水稻中蛋白质OsLAT5的表达量和/或活性，得到抗敌草快水稻品种。

4.根据权利要求3所述的水稻基因OsLAT5在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，所述的抑制出发植物水稻中蛋白质OsLAT5的表达量和/或活性的方法为基因定点编辑、RNA干扰、同源重组、基因敲除。

5.根据权利要求4所述的水稻基因OsLAT5在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，所述的基因敲除具体为使出发植物含有CRISPR-Cas9系统，系统中含有识别靶标为出发植物的OsLAT5基因的sgRNA。

6.根据权利要求5所述的水稻基因OsLAT5在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，所述的靶标的序列如SEQ ID NO：7所示。