CN111154770B

CN111154770B - 水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用

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Publication number: CN111154770B
Application number: CN202010072153.2A
Authority: CN
Inventors: 林菲; 张汉林; 徐汉虹
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111154770A

Abstract

本发明公开了水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用。本发明从水稻品种中花11中分离克隆得到调控水稻对农药的吸收转运的基因OsABCC2，其核苷酸序列、编码的蛋白以及含有基因OsABCC2的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌可提高水稻对农药的吸收转运，使农药到达害虫为害部位，减少水稻田农药的使用量；也可以从遗传上改良水稻品种的对农药的输导性，选育农药高效利用的水稻品种。并且，OsABCC2基因可以参与调节水稻株高，具有改良水稻种质资源的作用。

Description

水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用。

背景技术

民以食为天，食以稻为先。建国以来，我国农业发展最引人瞩目的成就就是以占世界7％的耕地，养活了世界22％的人口。而水稻是我国最主要的粮食作物之一，全国65％以上的人口以稻米为食。因此，如何保障粮食安全，实现粮食稳定增产就成为了我国农业发展最亟待解决的问题。而粮食安全，面临的最主要问题就是病虫害问题。在生产实际中，常用的病虫害防治手段有农业防治、物理防治、化学防治、以及生物防治等，化学防治以其杀虫谱广、快速高效、使用方法简便、不受地域和季节限制以及便于大面积机械化防治等优点成为目前防治病虫害的最主要手段。然而据文献报道，由于漂移、雨水冲刷等因素影响，农药在田间喷雾使用中损失高达70％，真正到达生物作用靶标的药剂只有不足施药量0.1％(Zhao et al.,2018)。因此，如何提高农药的靶向性，继而实现农药利用率的提高，已成为现代农业亟需解决的难题之一。

农药转运基因可实现农药的靶向积累，提高农药的有效利用。因此，利用分离克隆水稻的农药转运基因和蛋白，有望实现内吸输导性农药的靶向积累调控，减少环境释放，同时有利于水稻育种，具有重要的经济价值。本申请发明人分离克隆到一个水稻中的基因OsABCC2，据文献报道，该基因在拟南芥中具有将镉、砷等金属有毒离子隔离在液泡中的作用(Park et al.,2011)，并且可以高效运输菠菜中谷胱甘肽缀合物和叶绿素代谢产物(Luet al.,2007)，但其在水稻中的作用尚未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种水稻基因OsABCC2的分子标记检测引物。

本发明的再一目的在于提供一种水稻基因OsABCC2的分子标记检测试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用，是基于本发明发明人发现过表达OsABCC2基因可以提高水稻对农药的吸收转运，使农药到达害虫为害部位，减少水稻田农药的使用量；也可以从遗传上改良水稻品种的对农药的输导性，选育对农药高效利用的水稻品种。

所述的调节农药的吸收转运为过表达OsABCC2基因，以提高水稻对农药的吸收和转运。

所述的农药优选为内吸性农药；进一步优选为内吸性杀虫剂；更进一步优选为新烟碱类杀虫剂、酰胺类杀虫剂、有机磷类杀虫剂、沙蚕毒素类杀虫剂或氨基甲酸酯类杀虫剂中的一种；最优选为噻虫嗪、氯虫苯甲酰胺、氧乐果、杀虫双或灭多威中的一种。

所述的水稻基因OsABCC2编码的蛋白，其氨基酸序列为下列A)或B)：

A.如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

B.以上A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而获得的仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。

所述的水稻基因OsABCC2，其核苷酸序列为下列C)至G)中的任意一种：

C.如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

D.如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

E.严格条件下与C或D所限定的核苷酸杂交，且编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列；

F.与C所限定的核苷酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，且编码由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列；

G.与D所限定的核苷酸序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性，且编码由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列。

含有所述的水稻基因OsABCC2的重组载体、表达盒、转基因细胞系和重组菌在调节农药的吸收转运中的应用也属于本发明的保护范围。

一种水稻基因OsABCC2的分子标记检测引物，由如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的上游引物和下游引物组成：

F:5'-AAAGTGAGGAGTGCAGAGCC-3'；

R:5'-CAGGATGCCGTAGCGAGATT-3'。

所述的水稻基因OsABCC2的分子标记检测引物在鉴别高效利用农药的水稻品种中的应用，包括如下步骤：利用所述的分子标记检测引物对待检测的水稻品种的种质基因组DNA或者RNA进行扩增，通过基因表达量的变化判断目标品种响应农药处理的敏感性。

一种水稻基因OsABCC2的分子标记检测试剂盒，包括上述分子标记检测引物。

所述的水稻基因OsABCC2的分子标记检测试剂盒，还包括PCR用酶、PCR用水和PCR用缓冲液中的至少一种。

水稻基因OsABCC2在培育高效利用农药的转基因水稻中的应用，包括如下步骤：将所述的水稻基因OsABCC2构建于植物表达载体上，将得到的重组表达载体转入水稻中进行表达，得到高效利用农药的水稻品种。

所述的植物表达载体优选为pCAMBIA2300-35S。

所述的将得到的重组表达载体转入水稻中进行表达可以通过农杆菌介导、植物病毒载体、直接DNA转化、电导转化等常规生物学方法将得到的重组植物表达载体转化到植物细胞或组织中。

上述水稻基因OsABCC2在调节水稻株高中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明利用聚合酶链式反应(PCR)从水稻品种中花11中分离克隆到一个水稻中控制农药吸收转运的基因OsABCC2，应用该基因可以增加水稻对农药的吸收和转运，使农药到达害虫为害部位，减少水稻田农药的使用量。

2.在水稻中提高基因OsABCC2的表达可以从遗传上改良水稻品种的对农药的输导性，选育农药高效利用的品种，实现稻田农药减量增效。

3.本发明证实了基因OsABCC2在农药吸收转运中的作用，为研究水稻对农药的利用机制提供了新的线索。

4.本发明提供的基因OsABCC2的分子标记检测引物和包含该引物的检测试剂盒通过基因表达量的变化，快速判定目标品种响应农药处理的敏感性，选育高效利用具有输导性的新品种。

5.本发明提供的基因OsABCC2可调节水稻株高，具有改良水稻种质资源的作用。

附图说明

图1为OsABCC2过表达水稻株系中OsABCC2基因表达量的实时定量荧光PCR检测结果图。

图2为CRISPR敲除OsABCC2基因的突变体植株与野生型植株的OsABCC2基因序列的比对结果图。

图3为检测OsABCC2基因的突变体水稻根部和根上部中噻虫嗪含量的结果图。

图4为检测OsABCC2基因的突变体水稻根部和根上部中氯虫苯甲酰胺含量的结果图。

图5为检测OsABCC2基因的突变体水稻根部和根上部中氧乐果含量的结果图。

图6为检测OsABCC2基因的突变体水稻根部和根上部中杀虫双含量的结果图。

图7为检测OsABCC2基因的突变体水稻根部和根上部中灭多威含量的结果图。

图8为检测OsABCC2基因的突变体水稻株系中噻虫嗪的转移系数的结果图。

图9为检测OsABCC2基因的突变体水稻株系中氯虫苯甲酰胺的转移系数的结果图。

图10为检测OsABCC2基因的突变体水稻株系中氧乐果的转移系数的结果图。

图11为检测OsABCC2基因的突变体水稻株系中杀虫双的转移系数的结果图。

图12为检测OsABCC2基因的突变体水稻株系中灭多威的转移系数的结果图。

图13为OsABCC2基因在100μmol/L噻虫嗪(THX)处理24小时条件下的实时荧光定量PCR检测结果图。

图14为OsABCC2蛋白-GFP在水稻原生质体中的亚细胞定位结果图；其中，A、B、C和D为蛋白GFP的亚细胞定位结果图；E、F、G和H为融合蛋白OsABCC2-GFP的亚细胞定位结果图；A和E为明视场下的结果；B和F为暗视场下的绿色荧光；C和G为膜定位蛋白mCherry-1008红色荧光；D和H为重叠视野；标尺＝10μm。

图15为OsABCC2基因的突变体水稻株系表型(标尺＝10cm)；其中，A为野生型水稻中花11，B为突变体Crispr-1，C为突变体Crispr-6，D为突变体Crispr-7。

图16为OsABCC2基因的突变体水稻株高统计图。

图17为OsABCC2基因的突变体水稻根长统计图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105为常用的菌株，多数分子生物学实验室均有保存，可商业上购买得到；水稻品种为野生型中花11(公开使用的水稻品种，市售)。

实施例中所使用的化学试剂均为进口或国产分析纯。

实施例中所使用的引物由深圳华大基因公司合成，测序在深圳华大基因公司进行。

实施例1 OsABCC2基因及其编码蛋白的克隆

提取野生型粳稻品种中花11幼苗的RNA(OMEGA R6827-01)，反转录(Takara cat#6210A)得到去gDNA的cDNA(具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸)，将其作为模板，用正向引物F1和反向引物R1进行PCR扩增。得到8940bp的PCR产物。

经过测序，8940bp的PCR产物具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸，编码1386个氨基酸。编码的蛋白命名为OsABCC2，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

F1：5'-ATGGCCAAAAACAAACATCCTACCA-3'；

R1：5'-CTATGATGATCTTCCCACGAATTCC-3'。

实施例2过表达OsABCC2植株的构建

一、过表达OsABCC2基因

1、重组表达载体pCAMBIA1300-35S-OsABCC2的构建

提取野生型中花11幼苗的RNA，反转录得到cDNA作为模板(提取和反转录的方法同实施例1)，用引物1(ACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGAATGGCCAAAAACAAACATCCTACCA)与引物2(ATGATACGAACGAAAGCTCTGCACTATGATGATCTTCCCACGAATTCC)进行PCR扩增(Takara cat#R045)，反应条件为：1个循环：98℃、3min；32个循环：98℃、30s，58℃、30s，72℃、1min；1个循环：72℃、5min；16℃，得到带18个碱基同源重组臂的OsABCC2基因。

将上述PCR产物进行胶回收，与经过Sal I和Pst I双酶切的pCAMBIA1300-35S载体骨架(武汉伯远公司提供)通过In-fusion试剂盒(Takara cat#639648)进行同源重组，得到重组质粒。将重组质粒送样测序，命名为pCAMBIA1300-35S-OsABCC2，为重组表达载体。

2、过表达OsABCC2的转基因水稻的制备

1)将重组表达载体pCAMBIA1300-35S-OsABCC2电击转入农杆菌EHA105中(Olivia等,2019)，得到重组菌AGL1/pCAMBIA1300-35S-OsABCC2(从阳性克隆中提取质粒，测序验证)。

2)将重组菌AGL1/pCAMBIA1300-35S-OsABCC2用农杆菌介导的方法转化中花11水稻愈伤组织，具体如下：

挑取AGL1/pCAMBIA1300-35S-OsABCC2单菌落，接种于10mL的农杆菌培养基中(含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L)，28℃、180rpm摇床培养2-3天。取4mL菌液，4000rpm离心3min，倒去上清液，加入少量AAM培养基重新悬浮细胞，然后加入20mL的AAM培养基(含0.1mM乙酰丁香酮As)，28℃、150rpm摇床避光培养1-2h，培养至OD₆₀₀＝0.4左右。挑选生长状态良好、颗粒状中花11(以下也称为野生型水稻)水稻愈伤组织浸入农杆菌培养液中，28℃、150-200rpm摇20min，将愈伤组织倒出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织平铺在含多层滤纸的无菌平皿中，超净台上吹干(愈伤分散不结块)，然后将愈伤组织转移到共培养培养基上，黑暗条件下培养2-3天。将愈伤转至含有100mg/L的潮霉素和400mg/L头孢霉素的NB基本培养基上筛选3-4周(一筛)。将成活的愈伤组织转入二筛培养基(含100mg/L潮霉素及200mg/L头孢霉素的NB基本培养基)上筛选3周。将抗性愈伤组织转入分化培养基(含100mg/L潮霉素)上进行分化，再生植株在含100mg/L潮霉素的壮苗培养基上生根后(约3-4周)转移至温室中，得到T₀代转OsABCC2水稻。

上述转化中所用的培养基如下：

共培养培养基：诱导愈伤及继代培养基+As(0.1mM/L)+葡萄糖(10g/L)，pH 5.2。(北京华越洋生物科技有限公司)

农杆菌侵染水稻愈伤组织AAM培养基：AA大量元素+AA微量元素+AA氨基酸+MS维生素+水解酪蛋白(500mg/L)+蔗糖(68.5g/L)+葡萄糖(36g/L)+As(0.1mM)，pH 5.2。(北京华越洋生物科技有限公司)

NB基本培养基：N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+铁盐+水解酪蛋白(300mg/L)+脯氨酸(500mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(8g/L)，pH 5.8。(北京华越洋生物科技有限公司)

诱导愈伤及继代培养基：NB基本培养基+2，4-D(2mg/L)。

分化培养基：NB基本培养基+6-BA(3mg/L)+NAA(1mg/L)。

壮苗培养基：1/2MS无机盐+NAA(0.5mg/L)+MET(0.25mg/L)。

农杆菌培养基(YEP)：10g/L胰化蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/L氯化钠+15g/L琼脂。

3、转OsABCC2水稻的分子鉴定

1)PCR初步鉴定

提取T₀代转OsABCC2水稻的基因组DNA(OMEGA cat#D2485-02)，用引物F2和R2(引物序列如下)进行PCR鉴定，反应条件为：1个循环：98℃、3min；32个循环：98℃、30s，60℃、30s，72℃、30s；1个循环：72℃、5min；16℃。筛选出PCR阳性T₀代转OsABCC2水稻植株#1、#2和#3。

F2：5'-GATCCTGGGTTCGACTCCCCATGGA-3'；

R2：5'-TACTGTGACAACCAATATAAAAAAT-3'。

2)转录水平分析

提取PCR阳性T₀代转OsABCC2水稻株系#1、#2和#3的总RNA，反转录(OMEGA公司)，得到的cDNA作为模板，用如下引物进行实时定量荧光PCR，检测各材料中OsABCC2基因在转录水平上的表达量。实验重复3次，结果取平均值。以野生型水稻为对照(WT)。

实时定量荧光PCR使用Bio-Rad CFX96进行。PCR反应体系(20μL)按照产品使用说明书SYBR Green Real-Time PCR Master Mix reagent(Takara)进行，具体体系如下：10μLSYBR Green Real-Time PCR Master Mix、2μL上下游引物混合物(上下游引物浓度均为10μM)、7μL RNase-free water、1μL cDNA模板。具体反应程序如下：酶热激活95℃、30s，1个循环；变性95℃、5s，延伸60℃、30s，共40个循环。

其中，扩增OsABCC2基因的引物序列为：

F：5'-ATGGAAGCGAAGGACTC-3'；

R：5'-CAAATGTGACAACCGACA-3'。

以UBQ2作为内参基因，扩增内参UBQ2的引物序列为：

F：5’-GCATCTCTCAGCACATTCCA-3’；

R：5’-ACCACAGGTAGCAATAGGTA-3’。

数据的处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(OsABCC2)-Ct(ACTIN1)，以2^－△△Ct的值衡量基因转录水平，对各材料中OsABCC2基因的表达进行分析比较。

各实验材料中OsABCC2基因表达量的实时定量荧光PCR检测结果如图1所示，OsABCC2基因的表达均为相对值，可以看出：相比未转基因的野生型水稻粳稻中花11(WT)，PCR阳性T₀代转OsABCC2水稻株系#1、#2和#3中OsABCC2基因的表达量在转录水平上显著提高。PCR阳性T₀代转OsABCC2水稻株系#1、#2和#3为阳性T0代转OsABCC2水稻，命名为OsABCC2-OX-1、OsABCC2-OX-2和OsABCC2-OX-3。

实施例3 CRISPR敲除构建OsABCC2突变体植株

1、利用CRISPR/Cas9系统，根据OsABCC2的外显子序列选择靶标序列

利用简单、高效的CRISPR/Cas9系统，根据OsABCC2外显子序列选择特异的靶标序列，靶标序列：GTCTTGGAGGCC。靶标序列针对OsABCC2基因，特异的使OsABCC2蛋白失活。

2、构建含上述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体

1)根据靶标序列，设计带粘性末端的接头引物

将设计的接头引物添加pCRISPR/Cas9系统的特异粘性末端接头(F：GGCA；R：AAAC)，并合成完整的接头引物。

F3：5’-GGCA-AAAGTGAGGAGTGCAGAGCC-3’；

R3：5’-AAAC-CAGGATGCCGTAGCGAGATT-3’。

2)将带粘性末端的接头引物退火互补形成带粘性末端的双链小片段

将F3引物和R3引物稀释成浓度为10μM的溶液，各取10μL混匀，在PCR仪中进行退火反应，从98℃降至22℃，使F3引物和R3引物互补形成带粘性末端的双链小片段。

3)酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA(TAKARA Cat#632640)

用限制性内切酶BsaⅠ酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA，产生可以和靶标序列粘性末端互补的粘性末端。用BsaⅠ酶切pOs-sgRNA原始载体的体系为：10×buffer BsaⅠ2μL、BsaⅠ酶1μL、pOs-sgRNA载体4μg、ddH₂O补足至20μL，37℃酶切12h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳核查条带大小后，试剂盒(OMEGA Cat#D2500-02)过柱回收纯化酶切产物，得到酶切过的pOs-sgRNA载体，加入灭菌的ddH₂O溶解，测定浓度后待用。

4)将带粘性末端的双链小片段连接到酶切过的pOs-sgRNA载体上，形成包含靶标序列和sg-RNA的重组载体

用T4连接酶将步骤2)中的双链小片段和步骤3)中酶切过的pOs-sgRNA载体连接，形成完整的包含针对OsABCC2蛋白的靶序列和sg-RNA的重组载体。15μL连接体系为：10×T4ligation buffer 1.5μL、双链小片段4μL、酶切过的pOs-sgRNA载体3μL、T4 DNA ligase 1μL、ddH₂O补足至15μL，16℃连接12小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α，卡那抗性LB平板过夜培养，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含靶标序列和sg-RNA的重组载体。

5)用LRmix将包含靶标序列和sg-RNA的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubicas9-7进行LR反应重组，形成包含靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体

用LR mix(上海北诺生物科技有限公司)将步骤4)得到的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubi-cas9-7(武汉伯远公司提供)进行LR反应重组，LR反应体系：包含靶标序列和sg-RNA的重组载体25-50ng、pH-Ubi-cas9-7载体75ng、5×LR Clonase TM buffer 1μL、TEBuffer(pH8.0)补充到4.5μL、LR ClonaseTM 0.5uL。将体系于25℃下温育2h，反应后加2μL2μg/μL的Proteinase K，在37℃下处理10min，再将2μL反应产物转入大肠杆菌DH5α，庆大霉素抗性LB平板37℃过夜培养，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含OsABCC2蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整pCRISPR/Cas9重组载体。

3、将所获得的pCRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因植株

按照实施例2重组载体转OsABCC2水稻的方法将步骤5)所获得的包含OsABCC2蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体导入水稻愈伤组织中制备转基因水稻，在T0代植株中就可以得到OsABCC2蛋白完全失活的转基因植株。

4、筛选转基因植株中的转基因阳性植株

将移栽的转基因植株(T₀代)提取DNA，进行靶序列位点检测，共检测到40株阳性植株。

5、利用转基因阳性植株获得突变体植株

1)突变位点的鉴定

将移栽的阳性植株提取DNA，针对含靶标位点的500bp以内的DNA片段，设计特异性引物F4和R4，扩增含靶标位点的DNA片段，扩增得到的400bp PCR产物经纯化后送公司测序，测序结果与野生型植株序列比对，筛选出突变体植株。部分突变分析结果如图1所示。

F4:5’-AAAGTGAGGAGTGCAGAGCC-3’；

R4:5’-CAGGATGCCGTAGCGAGATT-3’。

2)将突变体植株进行繁种，于T1代转基因分离群体中检测不含潮霉素、Cas9等转基因元件的植株单株收种子，得到不带转基因成分的功能缺失突变体，分别命名为Crispr-1、Crispr-6和Crispr-7。

实施例4 OsABCC2突变体植株对农药的吸收转运的影响

选用以下农药进行实验：新烟碱类杀虫剂噻虫嗪、酰胺类杀虫剂氯虫苯甲酰胺、有机磷类杀虫剂氧乐果、沙蚕毒素类杀虫剂杀虫双、氨基甲酸酯类杀虫剂灭多威。检测实施例3获得的Crispr-1、Crispr-6和Crispr-7水稻株系和野生型水稻中花11的水稻根茎叶中农药的含量。

(1)将噻虫嗪原药用DMSO溶解配制成40mM的母液，储存于4℃备用。将在水稻培养箱生长14天的水稻幼苗挑出，小心冲洗干净根部营养液，10株水稻幼苗为一组。之后将水稻幼苗根放置于0.5mM氯化钙缓冲溶液中预培养2h；用0.5mM氯化钙缓冲溶液将药物母液稀释至100μΜ，调节pH＝5.8后，加入50mL离心管中，每管40mL，将水稻幼苗转入其中，并用定值杯固定，保证水稻茎部部接触液面，静置于人工气候培养箱培养24h。24h后将水稻取出，用0.5mM(pH＝5.8)氯化钙缓冲液清洗根部4遍，确保完全清除根部表面附着的药物。用滤纸擦干表面水分，然后用刀片切断根茎交界处下方1cm及上方1cm，将水稻分为根、茎和叶三部分。分别称重记录后，在研钵中加液氮磨碎，加入10mL色谱级乙腈萃取，超声30min，14000g离心10min，吸取上清液1mL，过0.22μm的针头微孔滤膜以除去杂质，装入液相瓶中，样品置于-80℃低温保存待检测。每个处理3组重复。采用氯虫苯甲酰胺、氧乐果、杀虫双以及灭多威对水稻幼苗做相同处理，每个处理3组重复。

结果表明，Crispr-1、Crispr-6和Crispr-7水稻株系根上部(root)中噻虫嗪(THX)、氯虫苯甲酰胺、氧乐果、杀虫双以及灭多威的含量比野生型低，而根部(shoot)中的含量与野生型相比无明显差异(图3、图4、图5、图6、图7)；Crispr-1、Crispr-6和Crispr-7水稻株系中转移系数(RCF)与野生型相比明显降低(图8、图9、图10、图11、图12)。

实施例5 OsABCC2分子探针的开发

以新烟碱类杀虫剂噻虫嗪为例。

用100umol/L的噻虫嗪对生长14天的野生型品种中花11幼苗进行如实施例4步骤(1)相同的处理，以溶剂水处理作为对照(Control)。处理后提取其RNA，反转录后利用定量PCR技术进行检测OsABCC2基因的表达，方法同实施例2，实验设三次重复。

结果如图13所示，在噻虫嗪处理条件下，水稻根、茎和叶中OsABCC2基因的特异性表达受到强烈诱导。由此，利用该引物作为分子探针，对水稻种质中的OsABCC2基因进行表达分析，可以快速判定目标品种响应噻虫嗪处理能力，可用于选育对噻虫嗪吸收高的新品种。

实施例6 OsABCC2蛋白的亚细胞定位

提取15天大小中花11水稻幼苗的总RNA，反转录得到cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增OsABCC2的全长ORF(去除终止密码子)，所用引物为：

F5：5’-TCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCATGGCCAAAAACAAACATCC-3’；

R5：5’-CCTTGCTCACCATCAGGATCCCTATGATGATCTTCCCACGA-3’。

将扩增得到的目的片段酶切回收，与空载体322-d1-eGFPn(北京华越洋)进行连接，使OsABCC2与GFP融合，测序鉴定正确后分别将融合载体322-d1-eGFPn-OsABCC2和空载体转入水稻原生质体中，室温下正常培养16h，在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白OsABCC2-GFP和蛋白GFP的在水稻原生质体中的亚细胞定位。结果如图14所示，证明了OsABCC2蛋白特异的定位在水稻细胞膜中。

实施例7 OsABCC2基因突变后对株高的影响

将实施例3获得的OsABCC2水稻Crispr-1、Crispr-6和Crispr-7突变体与野生型水稻中花11种植于水稻培养箱中，两周后观察表型。每个株系15株，实验重复3次，结果取平均值。

观察表型，与野生型水稻中花11相比，Crispr-1、Crispr-6和Crispr-7水稻株系的株高减少，而根长无明显变化(图15)。测量水稻各个株高和根长，与野生型水稻中花11相比，Crispr-1、Crispr-6和Crispr-7水稻株系株高均降低(图16)，而根长无变化(图17)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1386

<212> PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<223> OSABCC2氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Lys Asn Lys His Pro Thr Arg Cys Arg Val Pro Gln Ala Leu

1 5 10 15

Ala Gln Gly Thr Leu Glu Ala Arg Thr Trp Lys Trp Asn Leu Lys Asn

20 25 30

His Gly Tyr Val Phe Leu Lys Ile Arg Ala Leu Leu Val Val Asn Glu

35 40 45

Leu Ile Ala Gly Ala Gly Val Val Ser Asn Trp Pro Ser Val Leu Leu

50 55 60

Ser Trp Trp Phe Phe Ser Phe Leu Ser Glu Ser Leu Leu Thr Ser Leu

65 70 75 80

His Leu Leu His Leu Phe Asn Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Thr Ser

85 90 95

Leu Pro Leu Cys Thr Phe Ile Cys Leu Val Ala Val Thr Met Arg Pro

100 105 110

Ser Lys Ala Asn Gln Gln Asp Gln Asn Gln Pro Leu Leu Val Arg Glu

115 120 125

Asp Ser Asp Asp Ser Ser Thr Asp Arg Phe Ser Asn Ser Gly Trp Trp

130 135 140

Ser Cys Leu Thr Phe Gln Trp Leu Asn Pro Ile Phe Glu Lys Gly His

145 150 155 160

Lys Val Arg Leu Glu Leu Asp His Ile Pro Ser Val Pro Gln Ser Asp

165 170 175

Thr Ala Asn Gln Ser Tyr Ala Leu Leu Gln Glu Thr Leu His Lys Gln

180 185 190

Lys Pro Glu Pro Met Pro Met Arg Arg Ala Ile Ile Cys Ala Val Trp

195 200 205

Thr Pro Leu Ile Ala Asn Gly Val Phe Ala Gly Leu Asn Thr Ile Ala

210 215 220

Ser Tyr Met Gly Pro Phe Leu Ile Thr Tyr Leu Val Glu Leu Leu Ser

225 230 235 240

Asp Lys Asn Pro Asp Lys Gly His Gly His Gly Tyr Met Leu Ala Cys

245 250 255

Leu Phe Phe Ala Ser Lys Thr Val Glu Ser Leu Ser Gln Arg Gln Trp

260 265 270

Tyr Phe Gly Ala Arg Arg Ile Gly Phe Arg Val Arg Ala Ala Leu Met

275 280 285

Val Ser Ile Tyr Gln Lys Ser Leu Leu Met Lys Asn Ser Ser Thr Ala

290 295 300

Ser Gly Lys Ile Val Asn Phe Leu Asp Val Asp Val Glu Lys Val Ser

305 310 315 320

Glu Phe Phe Trp Tyr Val His Arg Ile Trp Leu Leu Pro Leu Gln Ile

325 330 335

Ser Leu Ala Leu Ala Ile Leu Tyr Arg Ser Leu Gly Ala Met Ala Ser

340 345 350

Leu Ser Ala Val Leu Ala Thr Val Leu Val Met Val Ser Asn Thr Pro

355 360 365

Leu Ala Lys Ser Gln Glu Asn Leu Asn Met Lys Ile Met Glu Ala Lys

370 375 380

Asp Ser Arg Ile Lys Ala Met Ala Glu Ala Met Lys Ser Met Arg Ile

385 390 395 400

Leu Lys Leu His Ala Trp Glu Thr Ala Tyr Phe Asp Lys Leu Leu Asn

405 410 415

Leu Arg Asp Val Glu Arg Gly Trp Leu Arg Lys Tyr Leu Tyr Thr Cys

420 425 430

Ser Ala Ile Ala Phe Leu Phe Trp Ala Ser Pro Thr Leu Val Ser Val

435 440 445

Val Thr Phe Gly Val Cys Ile Leu Val Glu Met Pro Leu Ser Ala Gly

450 455 460

Thr Val Leu Ser Ala Val Ala Thr Phe Arg Ile Leu Gln Asp Pro Ile

465 470 475 480

Tyr Asn Leu Pro Glu Leu Val Ser Met Val Thr Gln Thr Lys Val Ser

485 490 495

Leu Asp Arg Ile Glu Glu Phe Ile Lys Glu Glu His Gln Gly Lys Pro

500 505 510

Ser Arg Ser Asp Asn Asn Thr Arg Thr Lys Asp Leu Ser Met Thr Gly

515 520 525

Ala Met Glu Ile Glu Pro Gly Val Tyr Gly Trp Glu Ile Asp Asn Ser

530 535 540

Leu Lys Lys Thr Lys Phe Met Leu Lys Ile Asp Arg Lys Leu Ser Ile

545 550 555 560

Ser Lys Gly Gln Lys Val Ala Val Cys Gly Pro Val Gly Ser Gly Lys

565 570 575

Ser Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Met Gly Glu Ile Pro Arg Ile Asn Gly

580 585 590

Ala Glu Thr Thr Val Phe Gly Ser Arg Ala Tyr Val Ala Gln Ser Ala

595 600 605

Trp Ile Gln Thr Gly Thr Ile Gln Asp Asn Val Leu Phe Gly Lys Asp

610 615 620

Met Asp Arg Ser Phe Tyr Glu Glu Val Leu His Gly Cys Ala Leu Asp

625 630 635 640

Arg Asp Leu Glu Leu Trp Ala Asn Gly Asp Met Thr Met Val Gly Glu

645 650 655

Arg Gly Met Asn Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile Gln Leu Ala

660 665 670

Arg Ala Leu Tyr Ser Asp Ser Asp Val Tyr Leu Leu Asp Asp Pro Phe

675 680 685

Ser Ala Val Asp Ala His Thr Gly Ala His Leu Phe Lys Glu Cys Leu

690 695 700

Leu Arg Leu Met Ser Ser Lys Thr Val Ile Tyr Val Thr His Gln Leu

705 710 715 720

Glu Phe Leu Arg Asp Ala Asp Leu Val Leu Val Met Lys Asp Gly Arg

725 730 735

Ile Val Gln Ser Gly Lys Tyr Asp Asp Leu Val Ala Asp Arg Asn Gly

740 745 750

Glu Leu Ser Met Gln Met Ala Ala His Asn Gln Ser Leu Ser Gln Val

755 760 765

Thr Pro Ala Lys Ala His Val Leu Thr Lys Asn Lys Ser His Lys Arg

770 775 780

Arg Gln Thr Glu Leu Thr Glu Ile Glu Leu Asp His Asn Val Ile Gly

785 790 795 800

Arg Glu Cys Glu Glu Glu Arg Glu Ser Gly Arg Val Lys Trp Asp Ile

805 810 815

Tyr Arg Lys Phe Val Asn Ser Ala Tyr Gly Gly Ala Leu Val Pro Val

820 825 830

Ile Leu Ala Cys Gln Val Leu Phe Gln Gly Leu Gln Ile Cys Ser Asn

835 840 845

Tyr Trp Ile Ala Trp Ala Ala Glu Arg Gln Glu Gln Val Ser Arg Glu

850 855 860

Lys Met Ile Gly Ile Phe Val Leu Leu Ser Ala Gly Ser Ser Val Phe

865 870 875 880

Ile Leu Gly Arg Ala Ile Val Leu Ser Thr Ile Ala Ile Glu Thr Ala

885 890 895

His Gln Phe Phe Leu Gly Met Thr Arg Ser Ile Phe Arg Ala Pro Ile

900 905 910

Asn Phe Phe Asp Ser Thr Pro Ser Ser Arg Ile Leu Asn Arg Ala Ser

915 920 925

Thr Asp Gln Ser Thr Val Asp Thr Asp Ile Pro Tyr Arg Leu Ala Gly

930 935 940

Leu Ile Phe Ala Leu Ile Gln Leu Leu Ser Ile Ile Phe Ile Met Ser

945 950 955 960

Gln Ile Ala Trp Pro Ile Phe Ile Leu Phe Ile Ile Ile Ile Ala Ile

965 970 975

Ser Thr Trp Tyr Gln Ser Tyr Tyr Ile Cys Ser Ala Arg Glu Leu Ala

980 985 990

Arg Met Val Gly Ile Arg Lys Ala Pro Val Leu His His Phe Ser Glu

995 1000 1005

Thr Val Ser Gly Ala Ala Thr Ile Arg Cys Phe Asn Gln Gly Glu Lys

1010 1015 1020

Phe Phe Arg Lys Ser Leu Ala Leu Ile Asp Asp Tyr Ser Arg Ile Thr

1025 1030 1035 1040

Phe His Asn Ser Ala Thr Ile Glu Trp Leu Cys Val Arg Ile Asn Phe

1045 1050 1055

Leu Phe Asn Leu Val Phe Phe Val Thr Leu Val Ile Leu Val Ser Met

1060 1065 1070

Pro Arg Asn Thr Ile Asp Pro Ser Leu Ala Gly Leu Ala Ala Thr Tyr

1075 1080 1085

Gly Leu Asn Leu Asn Val Leu Gln Ala Trp Val Ile Trp Asn Leu Cys

1090 1095 1100

Asn Val Glu Asn Lys Met Ile Ser Val Glu Arg Ile Leu Gln Phe Ser

1105 1110 1115 1120

Asn Ile Thr Ser Glu Ala Pro Leu Val Ile Glu Asp Cys Arg Pro Arg

1125 1130 1135

Glu Ser Trp Pro Trp Cys Gly Thr Ile Gln Ile Asp Ser Leu Gln Val

1140 1145 1150

Arg Tyr Asn Pro Asp Met Pro Met Val Leu Lys Gly Ile Ser Cys Thr

1155 1160 1165

Ile Pro Gly Glu Arg Lys Ile Gly Val Val Gly Arg Thr Gly Ser Gly

1170 1175 1180

Lys Ser Thr Leu Ile His Ala Leu Phe Arg Ile Val Glu Pro Ser Glu

1185 1190 1195 1200

Gly Arg Ile Leu Ile Asp Asp Val Asp Ile Ser Leu Leu Gly Val His

1205 1210 1215

Asp Leu Arg Ser Arg Leu Ser Val Ile Pro Gln Glu Pro Thr Leu Phe

1220 1225 1230

Gln Gly Thr Val Arg Thr Asn Leu Asp Pro Leu Gln Gln His Leu Asp

1235 1240 1245

Thr Glu Ile Trp Glu Val Leu His Lys Cys Arg Leu Glu Glu Ile Val

1250 1255 1260

Arg Glu Asp Ser Arg Leu Leu Asp Ala Pro Val Val Glu Asp Gly Gly

1265 1270 1275 1280

Asn Trp Ser Val Gly Gln Arg Gln Leu Val Cys Leu Ala Arg Val Leu

1285 1290 1295

Leu Met Lys Lys Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Val

1300 1305 1310

Asp Thr Ala Thr Asp Asn Ile Ile Gln Lys Thr Ile Arg Gln Glu Thr

1315 1320 1325

Asn Asn Cys Thr Val Ile Thr Ile Ala His Arg Ile Pro Thr Val Ile

1330 1335 1340

Asp Ser Asp Leu Val Leu Val Leu Gly Glu Gly Lys Ile Leu Glu Phe

1345 1350 1355 1360

Asp Ser Pro Glu Asn Leu Leu Arg Asp Glu Ser Ser Ala Phe Ser Lys

1365 1370 1375

Leu Val Met Glu Phe Val Gly Arg Ser Ser

1380 1385

<210> 2

<211> 8940

<212> DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<223> OsABCC2的gDNA序列

<400> 2

gatcctgggt tcgactcccc atggaagtga attttccaga atttaacggc gctgtgcttt 60

cagtggtagg caatgtaccc gtcgacagcg agacgcatgt ggtgacttcg tcaatttatc 120

caggatttgc cggcccagtc ttcgaagatg ctcataaggg tagggtttac gtgcgtgtgt 180

ttataagggt gagtgcgcgt gcgttgtgag tgtctgcgtt gtattgtgta attcttaaaa 240

aaaaaaagag ctgtagccag tagcctgtaa aggctcccag cacgagaaag attcacagct 300

gcaggaaaat gacaagattt ggcaatctga tgatctgatc agaacggcgc cgcgccggca 360

tgtgcagata aaagagcatc gggattcacg ggcactgagt aaaagcagcg tcgggccctt 420

ttctagcacg aatctggatg ctacaggtat accaacagca aaacgactga aaaaaattgg 480

gtccaaacaa tatgcactac cacatatggt gccatggtcc tattctccgc tctttccttg 540

ccaaaaaagg ggcatcgatc gcgacatgca accaaggctc aagtcgtgat taaaaaaaac 600

atatagtcat tccagatcat taatctaaac aagaactact gcttgacggg aggaagtaaa 660

ataaatatca agcatgagac acatttccgg ctgcaacatc gaacaaataa aagaagggaa 720

agaaaagatg ctattgcatg tgttcagtaa ggcacgaaaa taaaatagaa caaaccgtag 780

tcctctcttg gtcaatggca atattgatcg taccgtgctt cctgaatcct tctcccgacc 840

gttttcatgg tcacatgcac ctgaaaaaga gaaactaaat agagaataaa gtgataatta 900

tcatcaaatc aacatgacac gacagtacca tccatccata cagaccacac acacaaaaaa 960

gaagacatta ccacttgcta atacaattga gatgtgcttc tatgctcctc agaaaaaaaa 1020

aagcacgaat gttaaagatg gtgaatggtc tagattaaaa ggtgattaac aggctaaacg 1080

ttattaggaa gggcaatttc gtccttgagg tagttaccca tatcccaaac gttcaatcct 1140

gatgcagcgc cgccccgact gccgccgcat tcgatcgcaa gtacaagaga aaaaaagaag 1200

gcattccatg attccaaaac agcgaatcct cctctgttcc ggctacacat gtgcagcacc 1260

tcaatccacc atttgattgg catccatgtt cttgccaaat caaaaaatga gatgggggta 1320

gagataagaa gcatgacaag aaaaatcaga aatgggcgaa ggcagggagc acgccgcggt 1380

agaccaacgg gacaggcggt gtggcgagag gaggaagaag ggggtggcgc agcaaaagta 1440

tacgggcgat gcacggtgga ggaagcgagc acgatcgctg agagtcatcg atttgtaact 1500

cctcatcggc tgatcgagta tgtgataact tcacaggaca aaattgcccc tccctaatga 1560

cttttactct gttaagcaac ttttaatcta aatcattcat gagctttaat atccgtgcag 1620

gtttttttag tgagaagcat agaagcacat cccaatacaa tttcttttaa gttcacctgc 1680

tactaaaaca tgttctgcga cgtggataat gaacagaaga taagataaaa ccacgaagta 1740

tgaaagttaa gcactcattt tcccattctt tcttcccaag tacatcactt atataaagta 1800

gcggatccag aaaaaaatag caggtatcct atacctatta atagtttact tatcaagtaa 1860

taatattgta attaacatgg ccaaaaacaa acatcctacc aggtgtcgtg tgccccaggc 1920

tctaggttct accttctctt ccacaaccac aaggtcctaa ccaaccaaat tggacgcatg 1980

tatgtgtctt tcgctcacct tctactcaca tgccgtcctc ttttgcattg gccacctcgg 2040

tagttcaatg atcatgcact cgatcgtaca gccgaaggac tcgatgcaag tgcacgcatg 2100

gtggacacat gcatgtctgc acagcacact gttggcagtt tccactgcca ccgagatgcc 2160

gctccaaagt tgccgatccg gcgtcaggat gccgtagcga gatttgatct ctgtgggcaa 2220

cttggattgg tgtcccggtt tgccatactt tctgtctgca tctcataaca tgttgcagat 2280

atagccattg cgtttggata aacacttcag ctgtagttac tacattttct ttatgctgca 2340

gctcaaggta ccttggaggc ccggacatgg aaatggaatc tcaaaaatca tggatatgtc 2400

tttttaaaga tcagagcact tcttgtcgtg aacgagttga ttgcaggtcc gattaaaaag 2460

aggagatccc aagtccagat cctataagtc atatgcaatc aggttctcct tttggtctgc 2520

tcttatcggc tctgcactcc tcactttgtt tgctggctct ctttcaagtt tgccttagcc 2580

ctagactctt gccttgctcc aatgtaacag tgcagttcct gtcatcttgg tgttctgttt 2640

ctctctgcca taagcccatt atccgtctgg tgatttcggc attggatgga gaccttagca 2700

gtattggatt atgtccgcat agcatcgttc gctatcttgc tggtttggat ccttgcagag 2760

cttgccaggc tgaacaagag acatcgccga gaaggacatg gcgacatggt ttcatcacaa 2820

agaaaagggg aagtcctgct accagcttat ataattgtac tttgcaatgc ttcaatctcc 2880

ttgatgcata tttgtttttc tgttcttgtg ttctggaagc gccaaactgt ctccctggat 2940

ttgatcttca aatcagtctc atggcttcta gtgactctct tcttgctcta ctgcaaacat 3000

gaaggtgcag gagttgtatc caactggcct tcagttcttc tctcgtggtg gttcttcagc 3060

ttcttatccg aatcacttct cacttcgttg catttgcttc acctcttcaa ctctgcaact 3120

gttgtcgatt tcacttctct tcccttgtgc acattcatct gcctcgtggc agtaactatg 3180

agaccttcca aagcaaacca gcaagaccag aaccaaccgc tgcttgtgag agaagacagt 3240

gatgacagta gcacagacag gttctccaac tccgggtggt ggagctgcct cacattccag 3300

tggttaaacc caatctttga gaagggacac aaggtgcgtc ttgagctcga ccatatccca 3360

tctgttccac agtctgacac ggcaaaccaa tcttatgcat tgcttcaaga gacacttcac 3420

aagcagaaac ctgagccaat gcctatgcgg agagccatta tttgtgctgt ctggacacct 3480

ttgatcgcca atggagtctt tgcaggttag tgagccattg gaagaacaaa agtggagcta 3540

ccctttgacc tttatattat actaacatga tgctttgcat ttattaccag ggcttaacac 3600

tattgcttcc tatatggggc cattcttgat cacctactta gtggagctac tctctgacaa 3660

gaatcctgac aagggccatg gccatggcta catgctagca tgccttttct ttgcctcaaa 3720

gacagtggag tcactttcac agcggcaatg gtattttggt gcccgcagga ttggtttccg 3780

ggtgcgtgca gcactgatgg tatccatcta tcagaaatcc ctgctgatga agaactcaag 3840

cacagccagc gggaaaattg tgaacttcct cgatgtcgat gttgagaagg ttagcgaatt 3900

cttctggtac gtacatagaa tttggctgct acccttgcaa atatccttgg cacttgccat 3960

tctctaccgt agccttggtg caatggcctc gctgtctgca gtccttgcaa cagttttggt 4020

tatggtgagc aacacaccac ttgcaaagtc acaggagaac ctcaacatga agatcatgga 4080

agcgaaggac tcacggataa aggctatggc tgaagcaatg aagagtatga ggatattgaa 4140

gctgcatgca tgggagacag cttactttga caagctactg aatctaaggg atgtggagag 4200

gggatggctc aggaaatatc tctacacatg ttcagcaatt gccttcctgt tttgggcctc 4260

accgaccttg gtgtcggttg tcacatttgg tgtatgtatt cttgtggaga tgccattatc 4320

agctggaaca gtcttatccg ccgttgccac gttcagaatc ctccaagatc caatctacaa 4380

cctcccagag ctcgtttcaa tggtcacaca aaccaaggtg tccctagata gaattgaaga 4440

gttcatcaaa gaagaacacc aggggaagcc aagtcgttct gacaataaca ctaggactaa 4500

ggacctgtct atgactggtg caatggaaat tgaaccaggg gtatatggtt gggaaattga 4560

caatagcttg aagaagacaa aattcatgct taagattgac agaaagctga gcatcagcaa 4620

gggtcaaaag gttgcagtgt gcgggccagt tggttctggt aaatcaagcc tcctttacag 4680

catcatgggg gagatcccaa ggattaatgg tgcagaaaca acagtttttg ggtcaagggc 4740

atatgttgcg cagagtgcat ggattcagac tgggacaatt caagacaatg tgctctttgg 4800

gaaggatatg gacagaagct tctatgagga ggtgctgcat ggttgtgctt tggatagaga 4860

tttggagtta tgggccaatg gtgatatgac tatggtaggg gagaggggca tgaacctgag 4920

tggaggccag aagcagagga ttcagcttgc cagagcattg tatagtgatt ctgatgttta 4980

cctcttagat gatcccttca gtgccgtgga tgcacacacc ggagcacatc tcttcaaggt 5040

acagtacatg agaaatctgc aacagtttag ctgtaatgag cttcaaatga aatgtacaat 5100

aatgttacag cacaaaggca caaagcaaga accataatca aaacaggaaa acacaaaagt 5160

attccaccca ttagacaatc tgcaaattat ctataagcaa tcaagtacca aatctaatta 5220

gtaaccgcaa atggcttact cactgaatcg tgagatcatc agcacaaata tttcttcaat 5280

ttgtgaaata aactaattca tattttgcat ctgcaggaat gtttactgag gctaatgtcc 5340

tctaagacag tcatatatgt tactcatcag ctagagttct tgagagatgc agatcttgtt 5400

ctggtaaggt atcaactcaa tttcaacatg ttactaattt taacttgtga taaaatggtt 5460

ggtaattgtt agctttaggt caaataaaat ggctatattg ttgtaaatat cttaatttga 5520

gcagctgcta gggatgcaag tgggtcatat tggactttgg tcagcccatt gatgcatcct 5580

agtccctttg cttgaccatt aatgcaagtg ccacacgtgc aaaataaaca tccaactaaa 5640

tgggaagcga accactaagt gggtgggttt tgtatccttc aaacctgtca caagctgtca 5700

tatttcattt ttgcaataat tactaagaac atacatgtag agttatatgg tctaacatat 5760

gattgcaaat gtccaactgt aggtcatgaa agatggaagg attgttcaat ccggaaaata 5820

tgatgatttg gtagcagaca ggaatggaga actctcaatg caaatggctg cacataacca 5880

atcccttagt caggtcacac ctgcaaaagc acatgtcttg actaaaaata agagtcacaa 5940

gagaaggcag actgagctca cagaaataga attagatcac aatgtaatag gcagggaatg 6000

cgaggaggag cgcgaatctg gaagagttaa atgggatatt tatcgcaagt ttgtcaactc 6060

tgcatatggc ggagctctcg ttcctgttat tcttgcatgc caagtccttt tccagggatt 6120

gcagatatgt agcaactatt ggattgcatg ggcagctgag aggcaggaac aagtaagcag 6180

ggagaagatg ataggtatct ttgtgctgtt atcagctgga agttctgtgt ttatattggg 6240

aagagctatt gtcctttcaa cgattgccat tgaaactgct catcagttct tcttaggcat 6300

gaccaggagt atttttcgag caccaatcaa cttctttgac tccactccat caagtagaat 6360

cctcaatagg gtgagccaac tacctcttca tttgaatatc gtaataaaaa cgccccttac 6420

ttccagttct cacggcttag ttttctgctt tgcaggcttc aacagatcaa agcacagttg 6480

acacagacat tccctacagg cttgcagggc ttatcttcgc attaattcag ctcctcagta 6540

ttattttcat catgtctcaa attgcctggc ctatattcat tctattcata attataattg 6600

ccatctctac ttggtatcag gtacaccttc attcattgca atatgttttc ctcaggtttg 6660

aaaatgctag taatttgtaa aaacttcatg cagagctatt acatctgttc agctagagaa 6720

ctagcaagga tggttggcat aagaaaagct ccagtcctcc accatttttc agagactgta 6780

tcaggagcag caactattag atgctttaat cagggagaga agttcttcag gaagagtctt 6840

gcgctaattg atgactactc ccgcatcact ttccacaatt cagcaacaat tgaatggtta 6900

tgtgttcgca tcaacttcct cttcaacctt gtcttctttg tgacgctagt catccttgtc 6960

tcaatgcctc gaaatactat tgatccaagt aagcgttccc atgaaaaaat agtatcgtat 7020

ctaacagcta taattagatc tgcagtcttg cattgcattc ctgcttattc tttttggtaa 7080

aacagtgttt gttgttacaa aaaaaaaaaa ggatttacag agaaaccatg tggttgtatt 7140

ttacgttttt cagaaaccct aaatgtgtaa ctctacagta ctttgataaa tcacaatatt 7200

attacatggc tataaactct aacccatttt ggttttctcc ttgtttaggc ctcgcagggc 7260

tggcagctac ctatggcctt aaccttaatg tgttacaagc atgggtcata tggaatctgt 7320

gcaacgttga gaacaaaatg atttcagtag aaagaatttt gcagttctca aacataacaa 7380

gtgaggcccc tttagtcatt gaggactgta gaccaagaga atcatggccc tggtgtggaa 7440

ccattcagat cgattctctc caagtgaggt acaacccgga catgccaatg gtgctcaaag 7500

gcataagctg cacaattccc ggagaaagga aaattggggt ggtaggacgg acagggagtg 7560

ggaaatcgac tctaattcac gccttgtttc ggattgttga accatctgaa ggacggatac 7620

tcatagatga tgttgatata tcgcttttgg gagtgcatga tctgcggtca agattaagtg 7680

ttataccaca agaaccgact cttttccaag ggacagtcag aacaaacctg gatcctctac 7740

agcagcatct ggacactgaa atatgggagg taaacaatct ataaaatata gtgctgtgaa 7800

gatgctcttc caaatgaaat ttctttaagt gtctatagct gttataggtt ttcaagaaag 7860

cagttaacaa tttaaagaca gcttccttta tcgagtctag tgctgatttt tcccccccat 7920

cttttaggtt ttgcataagt gccgccttga ggagattgtg agagaagaca gtagattgtt 7980

ggatgcacca ggtatgaaga actatctttc cttgcagcag ttttaattct cacgttccaa 8040

attccttgct cgagatggac aagttatatg actaaagttt gatgttgcag ttgttgaaga 8100

tgggggaaac tggagcgtag gacaaaggca acttgtatgc ttggccaggg tattgctaat 8160

gaagaagaaa atacttgttc tggatgaagc cacagcatcg gttgataccg caacagataa 8220

tatcatccaa aagactataa ggcaagagac aaacaattgc acagttatta caattgcaca 8280

taggattcct actgtgattg acagtgacct tgttcttgtc ctaggtgaag gtaaaagata 8340

tccacgaata acccatgttt ttcctttggt tcaacaaaag caattctaat ttataaaaaa 8400

ctatattaag cgatggaagt acctttttta ttgttcgtac tgcaggtaag atactagagt 8460

ttgattctcc agaaaatctc ctcagagatg aatcatcagc tttctcaaag ctggtgatgg 8520

aattcgtggg aagatcatca tagggtagac atcaaccaga gttaacatag agatatcaag 8580

cagccaccaa cctacttaac tccatctaga cttgtattta tcaacattga aactaacagg 8640

gcatgaagaa ggtttacgag tggacagcag gcatcagaag tacagaagga aattttggtt 8700

taagtgaaga ctatgctagc attagatact gatcttttcc tgatctagcc cttaccaatt 8760

ggacagttgc tgaatggtgt tcatattata ttggcaatgc aagtgatctt agatagattc 8820

atattctttt ccaccaacta ctagatcaaa ataaattgta gccttaatta tattcaccaa 8880

atcattcgtt gttgatttgt ttggataacc ggggtatttt ttatattggt tgtcacagta 8940

<210> 3

<211> 4161

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<223> OsABCC2的cDNA序列

<400> 3

atggccaaaa acaaacatcc taccaggtgt cgtgtgcccc aggctctagc tcaaggtacc 60

ttggaggccc ggacatggaa atggaatctc aaaaatcatg gatatgtctt tttaaagatc 120

agagcacttc ttgtcgtgaa cgagttgatt gcaggtgcag gagttgtatc caactggcct 180

tcagttcttc tctcgtggtg gttcttcagc ttcttatccg aatcacttct cacttcgttg 240

catttgcttc acctcttcaa ctctgcaact gttgtcgatt tcacttctct tcccttgtgc 300

acattcatct gcctcgtggc agtaactatg agaccttcca aagcaaacca gcaagaccag 360

aaccaaccgc tgcttgtgag agaagacagt gatgacagta gcacagacag gttctccaac 420

tccgggtggt ggagctgcct cacattccag tggttaaacc caatctttga gaagggacac 480

aaggtgcgtc ttgagctcga ccatatccca tctgttccac agtctgacac ggcaaaccaa 540

tcttatgcat tgcttcaaga gacacttcac aagcagaaac ctgagccaat gcctatgcgg 600

agagccatta tttgtgctgt ctggacacct ttgatcgcca atggagtctt tgcagggctt 660

aacactattg cttcctatat ggggccattc ttgatcacct acttagtgga gctactctct 720

gacaagaatc ctgacaaggg ccatggccat ggctacatgc tagcatgcct tttctttgcc 780

tcaaagacag tggagtcact ttcacagcgg caatggtatt ttggtgcccg caggattggt 840

ttccgggtgc gtgcagcact gatggtatcc atctatcaga aatccctgct gatgaagaac 900

tcaagcacag ccagcgggaa aattgtgaac ttcctcgatg tcgatgttga gaaggttagc 960

gaattcttct ggtacgtaca tagaatttgg ctgctaccct tgcaaatatc cttggcactt 1020

gccattctct accgtagcct tggtgcaatg gcctcgctgt ctgcagtcct tgcaacagtt 1080

ttggttatgg tgagcaacac accacttgca aagtcacagg agaacctcaa catgaagatc 1140

atggaagcga aggactcacg gataaaggct atggctgaag caatgaagag tatgaggata 1200

ttgaagctgc atgcatggga gacagcttac tttgacaagc tactgaatct aagggatgtg 1260

gagaggggat ggctcaggaa atatctctac acatgttcag caattgcctt cctgttttgg 1320

gcctcaccga ccttggtgtc ggttgtcaca tttggtgtat gtattcttgt ggagatgcca 1380

ttatcagctg gaacagtctt atccgccgtt gccacgttca gaatcctcca agatccaatc 1440

tacaacctcc cagagctcgt ttcaatggtc acacaaacca aggtgtccct agatagaatt 1500

gaagagttca tcaaagaaga acaccagggg aagccaagtc gttctgacaa taacactagg 1560

actaaggacc tgtctatgac tggtgcaatg gaaattgaac caggggtata tggttgggaa 1620

attgacaata gcttgaagaa gacaaaattc atgcttaaga ttgacagaaa gctgagcatc 1680

agcaagggtc aaaaggttgc agtgtgcggg ccagttggtt ctggtaaatc aagcctcctt 1740

tacagcatca tgggggagat cccaaggatt aatggtgcag aaacaacagt ttttgggtca 1800

agggcatatg ttgcgcagag tgcatggatt cagactggga caattcaaga caatgtgctc 1860

tttgggaagg atatggacag aagcttctat gaggaggtgc tgcatggttg tgctttggat 1920

agagatttgg agttatgggc caatggtgat atgactatgg taggggagag gggcatgaac 1980

ctgagtggag gccagaagca gaggattcag cttgccagag cattgtatag tgattctgat 2040

gtttacctct tagatgatcc cttcagtgcc gtggatgcac acaccggagc acatctcttc 2100

aaggaatgtt tactgaggct aatgtcctct aagacagtca tatatgttac tcatcagcta 2160

gagttcttga gagatgcaga tcttgttctg gtcatgaaag atggaaggat tgttcaatcc 2220

ggaaaatatg atgatttggt agcagacagg aatggagaac tctcaatgca aatggctgca 2280

cataaccaat cccttagtca ggtcacacct gcaaaagcac atgtcttgac taaaaataag 2340

agtcacaaga gaaggcagac tgagctcaca gaaatagaat tagatcacaa tgtaataggc 2400

agggaatgcg aggaggagcg cgaatctgga agagttaaat gggatattta tcgcaagttt 2460

gtcaactctg catatggcgg agctctcgtt cctgttattc ttgcatgcca agtccttttc 2520

cagggattgc agatatgtag caactattgg attgcatggg cagctgagag gcaggaacaa 2580

gtaagcaggg agaagatgat aggtatcttt gtgctgttat cagctggaag ttctgtgttt 2640

atattgggaa gagctattgt cctttcaacg attgccattg aaactgctca tcagttcttc 2700

ttaggcatga ccaggagtat ttttcgagca ccaatcaact tctttgactc cactccatca 2760

agtagaatcc tcaatagggc ttcaacagat caaagcacag ttgacacaga cattccctac 2820

aggcttgcag ggcttatctt cgcattaatt cagctcctca gtattatttt catcatgtct 2880

caaattgcct ggcctatatt cattctattc ataattataa ttgccatctc tacttggtat 2940

cagagctatt acatctgttc agctagagaa ctagcaagga tggttggcat aagaaaagct 3000

ccagtcctcc accatttttc agagactgta tcaggagcag caactattag atgctttaat 3060

cagggagaga agttcttcag gaagagtctt gcgctaattg atgactactc ccgcatcact 3120

ttccacaatt cagcaacaat tgaatggtta tgtgttcgca tcaacttcct cttcaacctt 3180

gtcttctttg tgacgctagt catccttgtc tcaatgcctc gaaatactat tgatccaagc 3240

ctcgcagggc tggcagctac ctatggcctt aaccttaatg tgttacaagc atgggtcata 3300

tggaatctgt gcaacgttga gaacaaaatg atttcagtag aaagaatttt gcagttctca 3360

aacataacaa gtgaggcccc tttagtcatt gaggactgta gaccaagaga atcatggccc 3420

tggtgtggaa ccattcagat cgattctctc caagtgaggt acaacccgga catgccaatg 3480

gtgctcaaag gcataagctg cacaattccc ggagaaagga aaattggggt ggtaggacgg 3540

acagggagtg ggaaatcgac tctaattcac gccttgtttc ggattgttga accatctgaa 3600

ggacggatac tcatagatga tgttgatata tcgcttttgg gagtgcatga tctgcggtca 3660

agattaagtg ttataccaca agaaccgact cttttccaag ggacagtcag aacaaacctg 3720

gatcctctac agcagcatct ggacactgaa atatgggagg ttttgcataa gtgccgcctt 3780

gaggagattg tgagagaaga cagtagattg ttggatgcac cagttgttga agatggggga 3840

aactggagcg taggacaaag gcaacttgta tgcttggcca gggtattgct aatgaagaag 3900

aaaatacttg ttctggatga agccacagca tcggttgata ccgcaacaga taatatcatc 3960

caaaagacta taaggcaaga gacaaacaat tgcacagtta ttacaattgc acataggatt 4020

cctactgtga ttgacagtga ccttgttctt gtcctaggtg aaggtaagat actagagttt 4080

gattctccag aaaatctcct cagagatgaa tcatcagctt tctcaaagct ggtgatggaa 4140

ttcgtgggaa gatcatcata g 4161

<223> OsABCC2的分子标记检测引物F

<400> 4

aaagtgagga gtgcagagcc 20

<223> OsABCC2的分子标记检测引物R

<400> 5

caggatgccg tagcgagatt 20

<223> F1

<400> 6

atggccaaaa acaaacatcc tacca 25

<223> R1

<400> 7

ctatgatgat cttcccacga attcc 25

<223>引物1

<400> 8

acccggggat cctctagagt cgaatggcca aaaacaaaca tcctacca 48

<223>引物2

<400> 9

atgatacgaa cgaaagctct gcactatgat gatcttccca cgaattcc 48

<223> F2

<400> 10

gatcctgggt tcgactcccc atgga 25

<223> R2

<400> 11

tactgtgaca accaatataa aaaat 25

<223>扩增OsABCC2基因的引物F

<400> 12

atggaagcga aggactc 17

<223>扩增OsABCC2基因的引物R

<400> 13

caaatgtgac aaccgaca 18

<223>扩增内参UBQ2的引物F

<400> 14

gcatctctca gcacattcca 20

<223>扩增内参UBQ2的引物R

<400> 15

accacaggta gcaataggta 20

<223>靶标序列

<400> 16

gtcttggagg cc 12

<223> F3

<400> 17

ggcaaaagtg aggagtgcag agcc 24

<223> R3

<400> 18

aaaccaggat gccgtagcga gatt 24

<223> F4

<400> 19

aaagtgagga gtgcagagcc 20

<223> R4

<400> 20

caggatgccg tagcgagatt 20

<223> F5

<400> 21

tcagatctcg agctcaagct tcatggccaa aaacaaacat cc 42

列(Artificial Sequence)

<223> R5

<400> 22

ccttgctcac catcaggatc cctatgatga tcttcccacg a 41

Claims

1.水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用，其特征在于，所述的水稻基因OsABCC2编码的蛋白，其氨基酸序列为下列A：

A. 如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

所述的农药为内吸性农药；

所述的调节农药的吸收转运为过表达OsABCC2基因，以提高水稻对农药的吸收和转运；

所述的农药为新烟碱类杀虫剂、酰胺类杀虫剂、有机磷类杀虫剂或氨基甲酸酯类杀虫剂中的一种。

2.根据权利要求1所述的水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用，其特征在于，所述的水稻基因OsABCC2，其核苷酸序列为下列C至D中的任意一种：

C. 如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

D. 如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求1或2所述的水稻基因OsABCC2的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节农药的吸收转运中的应用；

4.水稻基因OsABCC2的分子标记检测引物在鉴别高效利用农药的水稻品种中的应用，其特征在于包括如下步骤：利用所述的分子标记检测引物对待检测的水稻品种的种质基因组DNA或者RNA进行扩增，通过基因表达量的变化判断目标品种响应农药处理的敏感性；

所选农药为内吸性农药；

所述的农药为新烟碱类杀虫剂、酰胺类杀虫剂、有机磷类杀虫剂或氨基甲酸酯类杀虫剂中的一种；

所述的水稻基因OsABCC2的分子标记检测引物由如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所述的上游引物和下游引物组成：

F: 5'-AAAGTGAGGAGTGCAGAGCC-3'；

R: 5'-CAGGATGCCGTAGCGAGATT-3'。

5.权利要求1或2所述的水稻基因OsABCC2在培育高效利用农药的转基因水稻中的应用，其特征在于包括如下步骤：将所述的水稻基因OsABCC2构建于植物表达载体上，将得到的重组表达载体转入水稻中进行表达，得到高效利用农药的水稻品种；

6.根据权利要求5所述的水稻基因OsABCC2在培育高效利用农药的转基因水稻中的应用，其特征在于：

所述的植物表达载体为pCAMBIA2300-35S；

所述的将得到的重组表达载体转入水稻中进行表达是通过农杆菌介导、植物病毒载体、直接DNA转化、电导转化的生物学方法将得到的重组植物表达载体转化到植物细胞或组织中。

7.权利要求1或2所述的水稻基因OsABCC2在降低水稻株高中的应用。