CN110699374B - 一种抗草甘膦油菜的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域。涉及一种抗草甘膦油菜的培育方法。构建包含目标基因I.variabilis‑EPSPS*的表达载体pTGH‑1，利用农杆菌介导的遗传转化将转化载体导入甘蓝型油菜受体细胞中，在含有草甘膦的愈伤组织诱导培养基上筛选得到抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基上诱导分化，当分化的外植体上再生出完整的芽时，置于生根培养基上得到再生苗。提取T₀代转基因植株叶片总DNA，通过Southern杂交鉴定基因的拷贝数，发展单拷贝植株为株系，挑选转基因纯合株系进行抗草甘膦试验，利用侧翼序列进行反向PCR和Tail‑PCR，筛选出对抗草甘膦抗性好、农艺性状与原品种没有差别的甘蓝型油菜。

Description

一种抗草甘膦油菜的培育方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种抗草甘膦油菜新品种的培育方法。

背景技术

草甘膦具有除草性能高效，成本低廉、生态风险较小等优点，是应用最为广泛的广谱性除草剂之一。 对该除草剂抗性基因的研究证明，对草甘膦的抗性主要由EPSPS突变基因控制。加拿大等西方国家有关 公司已培育了一系列的抗草甘膦转基因油菜品种，已在多国取得了商业生产证书。这些品种的推广将会 极大的冲击我国在国际油菜市场地位。

草甘膦通过抑制5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3磷酸合酶(EPSPS)的活性阻断莽草酸路径，使植物芳香族 氨酸合成受阻(Duke SO,Powles SB.Glyphosate:a once-in-a-century herbicide.Pest Manag Sci,2008, 64:319-325；Gruys KJ,Marzabadi MR,Pansegrau PD,Sikorski JA.Steady-state kinetic evaluation of the reversereaction for Escherichia coli 5-enolpyruvoylshikimate-3-phosphatesynthase.Arch Biochem Biophys,1993, 304:345-351)，从而导致植物死亡。在实际应用中,植物草甘磷抗性一般都是通过异源表达外源的非敏感EPSP 合成酶(Zelaya IA,OwenMD.Differential response of Amaranthus tubercμLatus(Moq ex DC)JD Sauer toglyphosate.Pest Manag Sci,2005,61:936-950)实现的。本研究所用外源非敏感EPSP合成酶I.variabilis-EPSPS ^*基因是华中农业大学从Isoptericola variabilis中克隆到抗草甘膦基因。I.variabilis-EPSPS^*基因编码的蛋白 不具有CP4-EPSPS专利保护的4条保守序列，具有类似I型EPSPS的保守序列但是与专利保护的抗草甘膦I型 EPSPS不冲突，是具有自主知识产权的抗草甘膦基因(Cui Y,Huang SQ,Liu ZD,Yi SY,Zhou F,Chen H,LinYJ.Development of Novel Glyphosate-Tolerant Japonica Rice Lines:A Step TowardCommercial Release. Frontiers in Plant Science,2016,7)

草害是是制约我国油菜(Brassica napus)生产发展的主要因素之一。去除油菜田间杂草的方法主要有人 工除草和施用化学除草剂。人工除草耗时长，用工量大，明显增加了田间作业成本，导致农民效益降低， 也制约了油菜的机械化规模化种植。化学除杂草成本低，快速高效，已成为机械化直播的重要配套栽培措 施。

油菜是我国重要的经济作物，故发展转I.variabilis-EPSPS^*油菜对于我国油菜产业产业化发展具有重 要意义。第一，中国常年杂草发生面积接近0.97亿公顷，相当于作物种植面积的80％，草害是影响油菜高 产、优质的障碍之一，草害可造成油菜每年减产达15-20％。第二，我国油莱主产区长江流域冬油菜区(占 全国油莱面积85％以上)以双子叶杂草为主，由于油菜对防除双子叶杂草的除草剂极为敏感，目前还没有 对双子叶类的阔叶杂草理想的除草剂可用。第三，草甘膦及其代谢物对土壤中动物和微生物无害，同时在 土壤中易降解，不影响土壤结构，不残留在土壤中影响后茬作物。第四，通过大规模的筛选，目前尚未在 油菜中找到有效控制草害的抗性基因资源。因此，通过转基因培育抗草甘膦油菜是解决上述问题的最有效 途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种抗草甘膦油菜的培育方法。

在本发明中，基因转化的受体品种为甘蓝型油菜甲A177(甘蓝型油菜甲A177系一种小粒纯系，申请 人将该品种命名为甘蓝型油菜甲A177，于2009年11月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中 心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：P200908；在先发明专利申请的申请号为201010169042X， 公开号为：CN101962640A，公开日为：2011年02月02日)。所使用的抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS^* (该基因的原始序列由华中农业大学生命科技学院刘子铎教授课题组克隆并提供(来源于微生物材料)(Yi SY,Wu GB,LinYJ,Hu N,Liu ZD.Characterization of a new type of glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Isoptericolavariabilis.Journal of MolecμLar Catalysis B Enzymatic,2015, 111:1-8)，对原始序列进行密码子优化并合成的工作由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室林拥军 教授课题组完成(Cui Y,Huang SQ,Liu ZD,Yi SY,Zhou F,Chen H,Lin YJ.Development ofNovel Glyphosate-Tolerant Japonica Rice Lines:A Step Toward CommercialRelease.Frontiers in Plant Science, 2016,7)。采用农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化法，将所述的抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS^*导入受体 油菜甲A177。通过PCR方法检测转化植株阳性率，利用Southern杂交确定其拷贝数，通过反向PCR方法分 离得到侧翼序列，利用RT-PCR确定的表达，草甘膦抗性鉴定试验确定转基因油菜对草甘膦的抗性等过程，最终获得单拷贝整合在基因间区且I.variabilis-EPSPS^*基因表达正常的高抗且其农艺性状与原品种没有显 著差别的草甘膦油菜株系EPSPSP-X6。

本发明公开了油菜遗传转化程序、转化植物的分子鉴定、插入位点的序列分析、草甘膦抗性鉴定等 过程。

本发明的具体步骤是：

以pCAMBIA1300质粒为起始质粒，构建包含目标基因I.variabilis-EPSPS^*的表达载体pTGH-1。与此 同时，将甘蓝型低芥酸油菜甲A177种子消毒后步骤在播种培养基上进行暗光培养；然后将含有目标基因 I.variabilis-EPSPS^*的表达载体pTGH-1的农杆菌与组培后的甘蓝型油菜下胚轴经农杆菌制备的工程菌菌 液(侵染液)侵染后在共培养培养基上进行共掊养，在含有草甘膦(glyphosate)的愈伤组织诱导培养基 上筛选得到抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基上诱导分化，当分化的外植体上再生出完 整的芽时，切掉外植体上的原生根，将其置于生根培养基上进行生根培养；当新生根长到3cm左右时，转移到温室进行壮苗后在大田栽种。这些再生苗即为T₀代转基因植株。

在T₀代植株生长期间，采用CTAB法提取叶片基因组DNA，通过Southern杂交鉴定基因的拷贝数；随 后，将单拷贝的植株种成株系，通过田间抗性调查和PCR确定其后代的遗传方式。种子成熟后，收获单拷 贝株系上的种子；次年，将挑选出的转基因纯合株系进行室内和田间抗草甘膦试验，调查其农艺性状； 最后，采用反向PCR技术和Tail-PCR方法对抗草甘膦抗性好、农艺性状与原品种没有差别的单株作侧翼序 列分析(侧翼序列分析方法请参见《具体实施方式》)。

更详细的技术方案和发明效果，参见《具体实施方式》。

本发明的优点在于：

(1)本发明将抗草甘膦基因I.variabilis-EPSPS^*导入受体甘蓝型油菜基因组中，外源基因能在后代中稳 定遗传并保持相应的抗草甘膦除草剂特性，可节省劳动力资源，提高油菜种植效益，同时对环境友好。

(2)本发明草甘膦基因I.variabilis-EPSPS^*在油菜基因组中的位置不同于任何其他任何含有类似基因的 抗草甘膦油菜。

(3)本发明中转基因在油菜中的插入位点不影响油菜其他基因的功能的发挥。

(4)本发明中的抗草甘膦基因转基因材料可以通过杂交、回交等常规方式，将外源基因和抗草甘膦的 特性传递给其它油菜品种，进一步培育转基因抗草甘膦除草剂新品系或新品种。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是人工合成的I.variabilis-EPSPS^*基因的全长DNA序列。

序列表SEQIDNO：2是表达载体pTGH-1+I.variabilis-EPSPS^*的全长DNA序列。

序列表SEQIDNO：3是转基因植株EPSPS-X6插入位点相邻的5’基因组DNA序列。

序列表SEQIDNO：4是转基因植株EPSPS-6插入位点相邻的3’基因组DNA序列。

序列表SEQIDNO：5是扩增I.variabilis-EPSPS^*基因用的左引物序列。

序列表SEQIDNO：6是扩增I.variabilis-EPSPS^*基因用的右引物序列。

序列表SEQIDNO：7是反式PCR进行侧翼序列分析的第一轮扩增用的左引物序列。

序列表SEQIDNO：8是反式PCR进行侧翼序列分析的第一轮扩增用的右引物序列。

序列表SEQIDNO：9是反式PCR进行侧翼序列分析的第二轮扩增用的左引物序列。

序列表SEQIDNO：10是反式PCR进行侧翼序列分析的第二轮扩增用的右引物序列。

序列表SEQIDNO：11是EPSPS-X6材料转化事件插入位置验证用的右引物序列。

序列表SEQIDNO：12是EPSPS-X6材料转化事件插入位置验证用的左引物序列(EPSPS-X6R： -5’-CTCGAAGCTATCGAAACTCCG-3’-)。

图1：是本发明的起始质粒pCAMBIA1300的图谱。利用该质粒作为本干发明的骨架构建得到转化载 体。

图2：转化载体pTGH-1的T-DNA区示意图。该载体是在pCAMBIA1300(图1)衍生而来，即将外源 基因I.variabilis-EPSPS^*插入到克隆位点并删除了hpt基因，将目的基因同时作为选择用的标记基因。

图3：pTGH-1载体的转化过程。附图标记说明：图3中的A图：播种；图3中的B图：下胚轴培育；图3 中的C图：共培养；图3中的D图：抗性愈伤诱导；图3中的E图和F图：分化诱导不定芽；图3中的G图:不 定芽生根培养；图3中的H图：温室移栽。

图4：转I.variabilis-EPSPS^*基因植株的PCR扩增结果。附图标记说明：泳道M：3kbDNA ladder，泳 道N：非转基因(野生型)对照。泳道P：质粒。

图5：转基因甘蓝型油菜T0植株的Southern杂交结果。附图标记说明：泳道M:DNAMarker，泳道NT： 非转基因对照(野生型)。

图6：EPSPS-x6材料采用反向PCR(Inverse PCR)侧翼序列分离测序结果。

图7：EPSPS-x6侧翼序列分离测序结果分析插入位置结合软件IGV的结果。

图8：转基因和非转基因的甘蓝型油菜对喷施41％草甘膦异丙铵盐的抗性比较试验结果。

附图标记说明：对照品种为甘蓝型油菜甲A177(处理方法为喷施41％草甘膦异丙铵盐，肉眼可见植 株全部死亡)。而转基因植株EPSPS-X6则不被危害，表现出高度的抗性。图8中的A图是喷施100倍41％ 草甘膦异丙铵盐(生产上推荐用量为稀释150倍-200倍)处理条件下T1代转基因植株第1天的生长表型； 图8中的B图是喷施100倍41％草甘膦异丙铵盐(生产上推荐用量为稀释150倍-200倍)处理条件下T1代转 基因植株第1天的生长表型；图8中的C图是T1代喷施100倍41％草甘膦异丙铵盐(生产上推荐用量为稀释 150倍-200倍)处理第10天的生长表型；图8中的D图是T1代喷施100倍41％草甘膦异丙铵盐(生产上推 荐用量为稀释150倍-200倍)处理第15天的生长表型；图8中的E图是喷施100倍41％草甘膦异丙铵盐(生产 上推荐用量为稀释150倍-200倍)处理条件下T1代转基因植株第18天的生长表型；图8中的A1、B1、C1、 D1、E1是EPSPS-x6材料，图8中的A2、B2、C2、D2、E2是对照甘蓝型油菜品种甲A177。

图9：转基因材料EPSPS-X6转化T1代12株阳性插入位置验证的胶图。

图10：是本发明实施例7中引物P5的核苷酸序列。

图11：是本发明实施例7中引物EPSPS-X6R的核苷酸序列。

具体实施方式

实施例1：外源基因I.variabilis-EPSPS^*的获得和表达载体的构建

在本发明中，所使用的外源基因为I.variabilis-EPSPS^*(其核苷酸序列见SEQ IDNO：1)，由华中农 业大学刘子铎和林拥军教授合成并取得(专利申请号：201610317483.7；林拥军,崔莹,刘子铎：一种修饰的 抗草甘膦基因及抗草甘膦水稻的培育方法:公开号为CN107129993A[P].2017-09-05)。I.variabilis-EPSPS^*基 因是通过序列比对从新发现的放射线菌(Isoptericolavariabilis)中发现有一段序列中编码的蛋白与I型 EPSPSs相似，在大肠杆菌(E.coli)中表达发现草甘膦具有极高的抗性，其酶学特性与I型EPSPSs相似，这可能是一种新型的抗草甘膦类型。I.variabilis-EPSPS*基因序列与I型的EPSPSs代表基因来源于E.coli相似性 为35％，与II型EPSPSs典型的根癌农杆菌(A.tumefaciens)CP4和金黄色葡萄球菌(S.aureus)序列相似性分别 为29％和26％，通过两类EPSPS基因氨基酸多序列比对和进化分析，申请人将I.variabilis-EPSPS^*归类为I型 的EPSPS基因，但属于一个新分支。I.variabilis-EPSPS^*基因的原始长度为1374bp，编码458个氨基酸。通 过利用密码子优化软件。并根据密码子偏好性进行了优化。其完整的基因序列见相关的发明专利。本发明 的转化载体的构建过程如下：本发明载体是通过对pCAMBIA1300改造得到：用XhoⅠ切除hpt基因，用两 端带XhoⅠ粘性末端的UTR-CTP-epsps片段与载体进行连接，得到改造后的重组载体 PCAMBIA1300-EPSPS。epsps基因长1.3kb，5’端连有228bp的叶绿体定位信号肽(CTP)和100bp的UTR序列。 形成I.variabilis-EPSPS^*基因植物表达载体pTGH-1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1和图2)，随后，本发明通 过热激方式导入到大肠杆菌DH5α中验证后，再导入到农杆菌菌株GV3101中制成转化工程菌，在-80℃冰箱 冷冻保存，待用。

实施例2：农杆菌介导的遗传转化

农杆菌介导的遗传转化方法参照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室周永明教授实验室的常 用方法。转化受体为甘蓝型油菜品种甲A177(来源信息见《发明内容》部分)的成熟种子播种暗光培养 的下胚轴。

将甘蓝型油菜品种甲A177成熟种子消毒后接种在播种培养基(即，M₀培养基)上并在黑暗条件下培 养7d后，由种子萌发出下胚轴，将下胚轴剪切成0.8cm-1.2cm的片段，用含有转化载体pTGH-1的农杆菌的 工程菌菌液侵染(侵染液，即，DM液)下胚轴外植体，侵染时间为10-15min，在28℃黑暗条件下进行共 培养(共培养培养基，即，M₁培养基)2d后在愈伤组织诱导培养基(即，M₂培养基，该培养基中附加有 25mg/L草甘膦)上培养，大约20d后，可以看到外植体两端切口膨大，将外植体转入诱导芽再生的分化培 养基(即，M₃培养基)上，30d左右可出现绿色小芽；剪去外植体上的原生根，将分化的再生芽在生根培 养基(即，M₄培养基)上培养15d左右，就长出大量的根系(形成大量根系的小苗具有独立生长能力)， 移栽到温室能成活并正常生长(图3)。

在转化试验中，本发明共有1400块下胚轴外植体与pTGH-1转化载体的工程菌菌液进行了共培养，最 终成苗为128株，分化效率为9.14％(表1)。

表1农杆菌介导的遗传转化结果

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基配制过程中所涉及到得的主要试剂的名称及缩写表示如下：Sucrose(蔗糖)；Glucose (葡萄糖)；Mannitol(甘露醇)；Agar(琼脂粉)；xylose(木糖)；MES(2-(N-吗啉)乙磺酸；KT(Kinetin， 激动素)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-D ichlorophenoxyaceticacid，2,4-二氯苯氧乙 酸)；AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；TMT(Timentin，特美汀)；DMSO(Dimethyl sulfoxide，二 甲基亚砜)；MS(MS培养基)；ZT(玉米素)；NaCl(氯化钠)；Tryptone(胰蛋白胨)；Yeast(酵 母粉)，Glyphosate(草甘膦)

(2)主要溶液和培养基的配制方法

1)M₀培养基(播种培养基)

M₀(500mL):1/2MS 1.1g，蔗糖15g，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88，加蔗糖3.5g。

2)M₁培养基(共培养培养基)

M1(500mL):MS2.2g，蔗糖15g，甘露醇l9g，2,4-D 500μL，KT 500μL，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88， 加琼脂粉3.5g；使用时快冷状态下加入500u的乙酰丁香酮；

3)DM液(侵染液)

DM(100mL)：MS 0.44g，蔗糖3g，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88,灭菌后使用时加100u的乙酰丁香 酮；

4)M₂培养基(愈伤组织诱导培养基)

M₂(500mL):MS 2.2g，蔗糖15g，甘露醇l 9g，2,4-D 500μL，激动素500μL，用蒸馏水定容至500mL， pH5.84-5.88，加琼脂粉3.5g；灭菌后使用时加STS 75μL，特美汀500μL，草甘膦(Glyphosate)400μL。

5)M₃培养基(分化培养基)

M₃(500mL):MS 2.2g，葡萄糖5g，木糖0.125g，MES 0.3g，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88，琼脂 粉3.5g；灭菌后使用时加入：玉米素(ZT)500μL，吲哚乙酸(IAA)100μL，TMT 500μL，AgNO₃75μL， 草甘膦(Glyphosate)400μL。

6)M₄培养基(生根培养基)

M₄(500mL):1/2MS 1.1g，蔗糖15g，用蒸馏水定容至500mL，调p5.84-5.88，琼脂粉3.5g，灭菌使用时加 入TMT 500μL。

说明：上述MS为常用的MS培养基(1962年报道的配方)。

7)LB培养基(接菌培养基)

液体LB(500mL)培养基：NaCl 5g，胰蛋白胨(Tryptone)5g，酵母粉(Yeast)2.5g，用蒸馏水定容至500mL， 在121℃高压蒸汽灭菌30min。

固体LB(500mL)培养基：NaCl 5g，Tryptone 5g，Yeast 2.5g，Agar5g；用蒸馏水定容至500mL，常规121℃ 高压蒸汽灭菌30min。

将上述培养基试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容。

相关抗生素和组培试剂配制方法如下：

1)生长素类似物(2,4-D)贮存液(1mg/mL)的配制：

称取2,4-D250mg，用1mL1M氢氧化钾溶解5分钟，然后加10mL蒸馏水溶解完全后定容至250mL，4℃ 保存备用。

2)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/mL)的配制：

称取IAA100mg，用1mL1M氢氧化钾溶解5分钟，然后加10mL蒸馏水溶解完全后定容至100mL，4℃保 存备用。

3)细胞激动素(KT)贮存液(0.3mg/mL)的配制：

称取KT30mg，用1mL1M盐酸溶解5分钟，然后加10mL蒸馏水溶解完全后用蒸馏水定容至100mL，4 ℃保存，备用。

4)乙酰丁香酮(AS)贮存液(100mM)的配制：

称取0.392gAS，先溶于少量甲醇中，再加DMSO定容至20mL，无菌工作台抽滤分装到EP管中，-20℃保 存，备用。

5)玉米素(ZT)贮存液(2mg/mL)的配制：

称取0.04gZT，溶于1mL1M氢氧化钾，加蒸馏水定容至20mL，然后无菌环境下抽滤分装至2mL EP管中， -20℃保存，备用。

6)特美汀(TMT)贮存液(300mg/mL)的配制:

TMT规格为3.2g/瓶，一次使用9瓶，全部倒入烧杯中，少量水冲洗干净，加水溶解，待全部溶解后加蒸 馏水定容至96mL，在无菌环境下抽滤灭菌并分装到2mL EP管中，-20℃保存，备用。

7)1N氢氧化钾贮存液配制：

称量氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，室温下保存，备用。

(3)农杆菌介导的遗传转化步骤：

1)用电转法将质粒导入农杆菌

a.实验前用75％酒精清洗电转杯一次，看其是否破损，再用无水乙醇润洗一次，待其挥发干即可(在超净 工作台上操作)；

b.移液器吸取0.5μL质粒加入约50μL农杆菌GV3101感受态中(冰上操作)，1.5mL无菌离心管混匀后加入 到电转杯中；

c.将电转杯盖好后放入电转仪中进行电转，电压为1800V,按下“pluse”按钮两次，有响声即可，电转完后每 个电转杯中加入400μL液体LB培养基，移液器吸打混匀后转入到1.5mL无菌离心管中；

d.将离心管置于水平摇床上，温度28℃，转速180rpm条件下培养活化1h

e.将每个离心管中农杆菌接种到LB固体培养基上，涂皿试剂量为30μL-80μL，放入培养箱中28℃培养48h；

f.挑选LB培养基上的单克隆，做菌液PCR,引物同阳性检测引物；

g.挑选得到的单克隆菌液划线培养后进行摇菌保菌，保菌用50％甘油，菌液：50％甘油＝1：1，-80℃保存， 备用。

2)下胚轴获得

a.从成熟的甘蓝型油菜甲A177种子中挑选浑圆饱满的种子，然后依次用75％的乙醇处理1分钟、50％的84消 毒液对种子表面消毒4分钟；

b.用灭菌水冲洗种子3-5次；

c.将种子放在发芽培养基上(培养基同上)；

d.将接种后的播种培养基置于黑暗处培养1周，培养温度为25±1℃。

3)农杆菌培养

在带有对应抗性选择的液体LB培养基上预培养农杆菌GV3101，在水平摇床上于28℃，180rpm条件下培 养12h左右；

4)农杆菌侵染

a.准备好共培养培养基M₁，当培养基快冷时(约50℃)加入AS(终浓度至100μm)，DM液也对应添加AS(终 浓度至100μm)备用；

b.用分光光度计测试LB中农杆菌菌液为OD₆₀₀＝0.4左右较好。

c.准备菌液，取2mL培养好的菌液至无菌离心管中，6000rpm3min离心，弃上清；加入2mL DM(AS⁺)悬浮， 在6000rpm，离心3min，弃上清；再加入2mL DM(AS⁺)悬浮，置于4℃下备用。

d.在无菌平皿中加入18mL DM(AS⁺)，用无菌剪刀剪取幼苗下胚轴到该平皿中，每一个外植体长度为 8mm-12mm。切取外植体时尽量一刀垂直切下，每皿大概培养150-200个外植体(约2-3个播种方盒。)

e.在切好的外植体皿中加入准备好的2mL DM液(菌液)，这时总体积为20mL，侵染时间为10-15min。

f.当侵染8min时开始用移液器吸掉DM液(菌液)，用无菌镊子夹取外植体到无菌干燥滤纸上，放置片刻， 目的是吸走外植体上多余的菌液，然后将外植体转移到M1共培养培养基中，于暗光下24℃进行共培养。

g.共培养36-48h后，将外植体转移到到愈伤组织诱导培养基M2上继代培养，培养时间为20d左右。

6)分化：将抗性愈伤组织转移至分化培养基上；每三周左右用新鲜分化培养基继代一次。再生芽生长需 30d左右。

7)生根：剪掉分化时原生外植体，将再生芽继代到生根培养基中，生根需15d。

8)移栽：清洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天内保持水分湿 润。

实施例3：利用PCR方法检测转基因阳性植株

采用小量基因组DNA抽提法提取T₀代转基因叶片基因组DNA进行PCR分析，扩增I.variabilis-EPSPS^*基因的引物分别为F:5’-attagcgctagggacgtgag-3’(序列见SEQ IDNO：6)，R:5’-atacgctcccacatcctgtc-3’(序列见 SEQ ID NO：7),扩增的产物大小为576bp。

PCR反应体系：反应总体系为20μL，其中：DNA模板30-50ng，10×buffer3 2.0μL，10mM dNTP0.4μL， 10μM引物(即左引物EPSPS-F/右引物EPSPS-R)各0.5μL，Taq酶1U，加灭菌ddH₂O至20μL。

PCR反应程序：94℃，变性4min；94℃，变性30s，56℃退火30s,72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸 10min。

PCR产物检测：扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外凝胶成像分析仪观察并照相。

小量叶片基因组DNA的提取方法：取适量幼嫩叶片转入2mL离心管中，加800μL2×CTAB研磨，转入 2mL离心管；65℃水浴30min；加入800μL氯仿/异戊醇(体积比为24:1)上下颠倒数次(约15min)，直到 下层液相呈深绿色为止。于室温下12000r/min，离心10min。取500μL上清于一个新的1.5mL离心管中，加 入预冷的95％乙醇1mL，混匀后置-20℃，处理30min；然后在室温下于12000r/min，离心10min，去上清， 用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥。加入100μL ddH₂O溶解，备用。

由抗性愈伤组织分化出的小苗并非全部为阳性转化子。为此，本发明提取转基因T₀植株的基因组DNA 进行了PCR分析。共计检测128株，其中阳性株为125株，阳性率为97.6％(图4)。这说明由抗性愈伤组织 经预分化(预分化培养基附加有40mg/L的草甘膦)后所生长的小苗绝大多数为阳性苗。

实施例4：T₀代转基因植株的Southern杂交检测

(1)酶切、电泳和转膜：利用常规CTAB法提取甘蓝型油菜叶片总DNA(即基因组DNA)，测定浓 度后用双蒸水调成1μg/μL待用。杂交时，选取油菜基因组DNA30μg,10×Mbuffer4μL,HindⅢ30U,补ddH₂O 至40μL；37℃酶切16h。同时以未转基因甘蓝型油菜叶片DNA作对照。酶切完全后用TAE配制0.8％琼脂糖 凝胶，酶切产物在30V电压下电泳16h。利用毛细管法将电泳后的酶切产物印迹到尼龙膜，然后以相应的质 粒制作的探针进行杂交。详细过程见Liu等报道的方法(LiuKD,WangJ,LiHB,XuCG,ZhangQF.Agenome-wideanalysisofwide-compatibilyinriceandthepreciselocationoftheS5locusinthemolecμLarmap.TheorApplGenet,19 97,95:809-814)。

(2)探针的制备：提取含I.variabilis-EPSPS^*基因的质粒用BamHI/SacI酶切，回收目标基因片段，采 用随机引物法标记为探针。

(3)杂交：将尼龙膜放入杂交袋中，加入20mL的杂交液，排除气泡后封口，置于65℃的摇床中振荡， 预杂交16h。具体的步骤如下：

1)在一个离心管中加入12μLddH₂O，1μL探针DNA(约100ng)，1μLλDNA(约6ng)和2μL随机引物。

2)将上述体系在95℃中干浴变性5min后，立即置于冰上冷却5min；在3.8000r/min下离心1min，加入 2.5μLbuffer，2.5μLdNTP和1μLKlenow Fragment酶。

3)在同位素操作台上加入3μLα-32P-dCTP，37℃水浴中处理30min。

4)向上述反应体系中补加500μL杂交液，打开管盖，在100℃干浴变性10min。

5)将变性的探针加到杂交袋中，封口后置于65℃的摇床中杂交。杂交16h后取出尼龙膜，先用1×SSC 和0.1％SDS冷洗10min，再用1×SSC和0.1％SDS在65℃中热洗，直至膜信号强度降到500-1000cpm。将尼龙 膜用保鲜膜包好，放入磷屏中显影。

将PCR阳性的T₀代植株在苗期提取总DNA用于Southern blot分析，结果表明：目标基因已经整合到受 体材料的基因组中。EPSPS-X6材料southern blot结果见图5。

实施例5：侧翼序列的分析

转基因插入位点的侧翼序列采用反向PCR技术和Tail-PCR技术。反向PCR的原理是将DNA用限制性内 切酶消化，然后用连接酶将其自连成环，最后以自连产物为模板，用根据已知序列设计的反向引物进行扩 增，得到侧翼的未知序列(见图6)。通过BrassicaDatabase等相关生物信息网站分析比对分离得到侧翼序 列，结果表明外源基因插入位置为C02号染色体上的9519946处，具体的位置见图7。

反向PCR加样程序

根据Southern杂交结果选择合适的限制性内切酶。取10μg总DNA，在50μL的反应体系中用30-40U的限 制性内切酶消化16h，检测酶切安全后进行纯化。纯化具体步骤如下：

(1)向酶切反应体系中补加150μLddH₂O，再加入200μL氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，振荡5min。

(2)在12000r/min，离心5min，吸取180μL上清液转移至新的离心管中。

(3)加入20μL的3M NaAc和400μL的冰冻无水乙醇，混匀后在-20℃中放置30min。

(4)在12000r/min，冷冻离心20min，倒掉上清液。

(5)加入500μL75％乙醇洗涤，然后在12000r/min，离心5min，倒掉上清液。

(6)自然晾干后加入50μLddH₂O溶解。

将所有的纯化产物用10U的T4DNALigase(购自Promega公司，美国)自连，若电泳检测发现纯化产物 浓度较高，可以取走部分用于自连。反应体系为100μL，在16℃中连接16h。然后以自连产物为模板，进行 反向PCR第一轮扩增，引物为P1和SP2；第二轮扩增以第一轮的产物为模板，引物为P3和SP3。引物在T-DNA 区的位置和序列见表6。

表6反向PCR的引物

第一轮PCR反应体系：总体积为40μL，其中包括4μL的10×buffer，3μL的25mMMgCl₂，3μL的2mM dNTP，0.5μL的10uM左、右引物，2个单位Taq DNA聚合酶和2μL的模板。PCR反应程序：94℃预变性5min， 94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，32个循环后72℃延伸5min。第二轮PCR反应体系与第一轮 相同，反应程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸 5min。

扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中用0.5×TBE电泳检测，切下目标片段，回收后克隆到T-vector上进行测 序。将测序结果与互联网的NCBI、Genoscope等生物信息学网站上的序列进行比对，确定转基因的整合位 置，然后在上述网站上查询该区段的基因注释信息。

以株系EPSPS-x6的总DNA酶切后的自连产物为模板，进行的第一轮反向PCR得到了两个片段，其中较 小的片段约为0.7kb，较大的片段超过1kb，如Southern杂交结果所预测的大小相符合。第二轮的反向PCR 扩增使大片段的浓度得到富集，测序结果表明该片段为928bp，其中的146bp来源于T-DNA区。目标片段剩 余的579bp通过序列比对定位在油菜基因组的C02号染色体上，处于非编码区中，结果如图7。

实施例6：转基因植物的表型鉴定

根据美国孟山都公司生产的41％草甘膦异丙胺盐农达(Roundup)使用说明书，该除草剂每亩用药量 为150-250mL，每亩兑水30-40L，即为每平方米用除草剂0.225mL-0.375mL，兑水45-60mL。以上制剂相当 于稀释160-200倍使用。本实施例中的单个穴盘面积为0.2m²，草甘膦异丙胺盐稀释100倍使用，即,0.09mL 草甘膦异丙胺盐兑水9mL,全部均匀喷施于甘蓝型油菜3-4叶期。喷施时定期拍照记录表型变化，得到如图8 所述的结果。

实施例7：外源基因插入位置验证

结合侧翼序列分离结果确定的插入位置和外源基因T区序列，设计特异性引物进行验证，引物设计原则： 根据T区插入位置和方向在T区上设计引物P5(序列见图10)，结合位置根据基因组序列设计引物EPSPS-X6R (序列见图11)，进行特异性扩增，扩增产物的大小为1354bp。

PCR反应体系：反应总体系为20μL，包括DNA模板30-50ng，10×buffer3 2.0μL，10mM dNTP 0.4μL， 10μM引物(左引物F/右引物R)各0.5μL，Taq酶1U，加灭菌ddH₂O至20μL。

PCR反应程序：94℃，变性4min；94℃，变性30s，58℃退火30s,72℃延伸80s，32个循环；72℃延伸10min。

PCR产物检测：扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外凝胶成像仪观察并照相。结果见图9。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种抗草甘膦油菜的培育方法

<141> 2018-05-14

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1377

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1377)

<400> 1

atgaccccgg ccccagcttc cccagacgcc accagcccgg ctccagcgtc cgaggctccg 60

tgggaggccc cggtggcgcc aggagagctg gacgctaccg tggagatccc aggcagcaag 120

tccctcacca acaggctcct ggtgcttgcc gctctcgcag acggcccagg tgtgctgagg 180

ggagccctca ggtccaggga cgccgatctg atgatcgccg ccctcagggc tcttggcgct 240

gagatcaccg agggcactga gccaagcacc ctgcacgtta ctccgggtcc agtgaggggc 300

gatgtcgacg tgttcactgg ccttgccgga accgtgatga ggttcctccc accagtggct 360

gccctcgctg acggtccggt taggttcgac ggcgatccag aggccagggt gaggccgatg 420

ctcccggtgc tcgccgcgct gcgcgccctc ggcgtgaagg tcaccggcga cggaccagac 480

ttcccgtccc accttccatt caccgttcac ggcaagggtt ccctgcgcgg cggagctgtg 540

gatgtggacg cctctgctag ctcgcagttc gtgtccggcc tgctgctcgc cgccccaagg 600

ttcgacgacg gcctcgccct ccgccacatc ggagccaccc tcccatccct cccgcacatc 660

gagatgacag tggctaccct cagggaagtg ggcgtcgctg tggacgatag cagggacggc 720

atctggcacg tttcaccggg cgcgattagc gctagggacg tgagggtcga gccagacctc 780

tccaacgccg ctccgttcct tgctgccgcc ctcgctgccg gtggaaccgt gagggtgccg 840

ggatggcctg ccagcaccac ccagccggga gctatggtgc cagagctgct tgagcgcatg 900

ggtggcaggg ttaccgtgga acacactgct gacgatggca caagcgtgct cgctgtcacc 960

ggcactggag agattcacgg catcgacgtt gacctgcacg ccgctggcga actggctcca 1020

acgttcgccg ctctcgccgc tctggcggat tccccgagca ggctccgcgg catcgctcac 1080

cttcgcggcc atgagaccga caggctcgcc gctcttgcta cagagatcac aaggctcgga 1140

ggcaggtgcg aggagaccag ggatggactc gttatcaccc cgaggccatt gcacggcgcc 1200

accttccgta cctacgccga ccatcgcatg gctacatccg ccgctgtgct cggtcttagg 1260

gtgccgggtg tgcaggtgga gaacgtcggt acgactgcga agaccctccc aggcttcgac 1320

aggatgtggg agcgtatgct cgctgccggc aggaccgtgg gagccggtgc ttgataa 1377

<210> 2

<211> 3348

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3348)

<400> 2

tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60

gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact 120

ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 180

atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa ccctaattcc 240

cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagttatcaa gcaccggctc 300

ccacggtcct gccggcagcg agcatacgct cccacatcct gtcgaagcct gggagggtct 360

tcgcagtcgt accgacgttc tccacctgca cacccggcac cctaagaccg agcacagcgg 420

cggatgtagc catgcgatgg tcggcgtagg tacggaaggt ggcgccgtgc aatggcctcg 480

gggtgataac gagtccatcc ctggtctcct cgcacctgcc tccgagcctt gtgatctctg 540

tagcaagagc ggcgagcctg tcggtctcat ggccgcgaag gtgagcgatg ccgcggagcc 600

tgctcgggga atccgccaga gcggcgagag cggcgaacgt tggagccagt tcgccagcgg 660

cgtgcaggtc aacgtcgatg ccgtgaatct ctccagtgcc ggtgacagcg agcacgcttg 720

tgccatcgtc agcagtgtgt tccacggtaa ccctgccacc catgcgctca agcagctctg 780

gcaccatagc tcccggctgg gtggtgctgg caggccatcc cggcaccctc acggttccac 840

cggcagcgag ggcggcagca aggaacggag cggcgttgga gaggtctggc tcgaccctca 900

cgtccctagc gctaatcgcg cccggtgaaa cgtgccagat gccgtccctg ctatcgtcca 960

cagcgacgcc cacttccctg agggtagcca ctgtcatctc gatgtgcggg agggatggga 1020

gggtggctcc gatgtggcgg agggcgaggc cgtcgtcgaa ccttggggcg gcgagcagca 1080

ggccggacac gaactgcgag ctagcagagg cgtccacatc cacagctccg ccgcgcaggg 1140

aacccttgcc gtgaacggtg aatggaaggt gggacgggaa gtctggtccg tcgccggtga 1200

ccttcacgcc gagggcgcgc agcgcggcga gcaccgggag catcggcctc accctggcct 1260

ctggatcgcc gtcgaaccta accggaccgt cagcgagggc agccactggt gggaggaacc 1320

tcatcacggt tccggcaagg ccagtgaaca cgtcgacatc gcccctcact ggacccggag 1380

taacgtgcag ggtgcttggc tcagtgccct cggtgatctc agcgccaaga gccctgaggg 1440

cggcgatcat cagatcggcg tccctggacc tgagggctcc cctcagcaca cctgggccgt 1500

ctgcgagagc ggcaagcacc aggagcctgt tggtgaggga cttgctgcct gggatctcca 1560

cggtagcgtc cagctctcct ggcgccaccg gggcctccca cggagcctcg gacgctggag 1620

ccgggctggt ggcgtctggg gaagctgggg ccggggtcat gcatgcggtg gacacgctgg 1680

acatcacctt gagcggcctc agctcggagc cgatgagggt catgccgctc ttcttgaggc 1740

cccaggagct ggagatcggg taggccctcg ggtgctgctg ggtcttgagg gacacggaga 1800

gcggggactt cctctggctg gacttggaga ggttgctgat gaggctcggg ttctgcacgc 1860

cgttgcagat cctggacacc tgggccatgg taccagcctt acctttgggt gggggggttt 1920

tcgctttaag gaaaccggtt acaggcaaat gatatcccgc acaagctgcg tgtgacgacg 1980

ctcagagtga gtctctcgag agagatagat ttgtagagag agactggtga tttcagcgtg 2040

tcctctccaa atgaaatgaa cttccttata tagaggaagg tcttgcgaag gatagtggga 2100

ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt 2160

ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc 2220

actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta 2280

ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa 2340

tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc 2400

tgagactgta tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttatc 2460

acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct 2520

cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt 2580

tcctttatcg caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat 2640

gaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg 2700

aaaagtctca atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac 2760

gagagtgtcg tgctccacca tgttggcaag ctgctctagc caatacgcaa accgcctctc 2820

cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 2880

ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 2940

cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 3000

ggaaacagct atgaccatga ttacgaattc gagctcggta cccggggatc ctctagagtc 3060

gacctgcagg catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 3120

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 3180

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 3240

ctagagcagc ttgagcttgg atcagattgt cgtttcccgc cttcagttta aactatcagt 3300

gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgttta 3348

<210> 3

<211> 501

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(501)

<400> 3

atagtactaa tgaaaagaac aagacattat taccctgttg aagaaacatg taagggatga 60

gtctactgtc ttttttccac tattgtatga atcatataag ttcgattata tcaattcatt 120

ttcttattgc taagtagacc tgcgagtttg gtttatacct ttagtttggt ttggtttggc 180

aattaatttg gtttgatttt aaacttctac caaaatgaat tgaaattctc aatttttgat 240

ttgattctac tttaatttgg ttaaccattc gggtaatttt ggttaaattc ggttagtttg 300

atgcgaaatt tggatatggt ttcggtttgg tataaattgg tatgatttat ttacaatttt 360

tctaccaaac taaaccaaac tcttaaccga acctgaacct aatttccaca ggcttattct 420

aagtttagac tttagagtag ctgaaaaaca gaagcaccct ttttgtgtga tcatcaaagt 480

tgaaaacatc tcaatcaaca c 501

<210> 4

<211> 501

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(501)

<400> 4

caaaaagaga aaaccaaaca tacgatcaca aagagactag caacacattg attattggtt 60

cgtagtagtt tcaacaagaa tcattaaacg gacaagagaa gtctaggacc aaacaacagt 120

aactgtattt tttttttgca aatacagaga gaaatcataa agagttatcc agtggcaagc 180

aaaaaatgca aaagcctctg tttctactct ttcttggtat attgacggac aacaagagcg 240

agacccaaga tcaagattgg gacgaggaac tgcagaatct tgatgatgaa ttctggtgtc 300

ttgtcttggt tgtacgcggg ttgagcaggt gcaacgtatg tccttgtttt tggaacacta 360

gacgaatcga tctcgccgat gtagtacttc tccatcatgt cccttgcggt gtcgctgtgt 420

ccaacgtctt caaagtcatt cgtagcatct ttccctgtaa caacaacaga aacatatcat 480

tggagggatt caactggatc a 501

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 5

attagcgcta gggacgtgag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 6

atacgctccc acatcctgtc 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<400> 7

caggtggaga acgtcggtac gact 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(23)

<400> 8

ctctagccaa tacgcaaacc gcc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(23)

<400> 9

gggtttcgct catgtgttga gca 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(23)

<400> 10

tgttgtgtgg aattgtgagc gga 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(21)

<400> 11

ctcgaagcta tcgaaactcc g 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 12

atgtgtgagt agttcccaga taagg 25

Claims (1)

1.一种抗草甘膦油菜的培育方法，其特征包括下列步骤：

A、以pCAMBIA1300质粒为起始质粒，构建包含如SEQ ID NO:1所示序列的目标基因I.variabilis-EPSPS*的表达载体pTGH-1；将甘蓝型低芥酸油菜甲A177种子消毒后接种在播种培养基上进行暗培养；然后将含有目标基因的表达载体pTGH-1的农杆菌工程菌与甘蓝型油菜下胚轴用侵染液侵染后在共培养培养基上进行共掊养，在含有草甘膦的愈伤组织培养基上筛选得到抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基上诱导分化；当分化的外植体上再生出完整的芽时，切掉原生根，并置于生根培养基上进行生根培养；当新生根长到3cm时，转移至温室，将壮苗后的再生苗移植到大田栽种，即为T0代转基因植株；

B、在T0代植株生长期间，用CTAB法提取T0代植株叶片基因组DNA，通过Southern杂交鉴定基因的拷贝数；将单拷贝的植株种成株系；通过田间抗性调查和PCR检测，种子成熟后，收获T0代植株上的种子，即为T1代种子；

C、在收获T1代种子的第二年，挑选转基因纯合株系进行室内和田间抗草甘膦试验，调查其农艺性状；

D、采用反向PCR和Tail-PCR方法，对抗草甘膦抗性有差别的单株作侧翼序列分析，获得高抗除草剂草甘膦的转基因油菜株系；步骤D中所述的侧翼序列分析的方法包括采用一种复合转基因结构，该复合转基因结构由以下几个序列沿5’到3’方向顺序连接而成：(i)SEQID NO：3所示的插入位点5’端侧翼序列；(ii)SEQ ID NO：1所示的插入的外源基因序列；以及(iii)SEQ ID NO：5所示的插入位点3’端侧翼序列；所述侧翼序列分析的定性PCR反应中的引物组合序列如下所述：SP2：CAGGTGGAGAACGTCGGTACGACT，P1：CTCTAGCCAATACGCAAACCGCC；反向PCR反应中第二轮扩增的引物组合序列如下所述：SP3：GGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCA，P3：GTTGTGTGGAATTGTGAGCGGA；特异性验证PCR反应中的引物组合序列如下所述：

P5：ATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGG，EPSPS-X6R：CTCGAAGCTATCGAAACTCCG

其中：上述步骤中所用的培养基成分及其配制如下所述：

1)播种培养基：

以配制500mL培养基计:1/2MS 1.1g，蔗糖15g，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88，加琼脂粉3.5g；

2)共培养培养基：

以配制500mL培养基计:MS2.2g，蔗糖15g，甘露醇l9g，2,4-D 500μL，激动素500μL，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88，加琼脂粉3.5g；使用时快冷时加入500u的乙酰丁香酮；

3)侵染液：

以配制100mL培养基计：MS 0.44g，蔗糖3g，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88，灭菌后使用时加入100μL的乙酰丁香酮；

4)愈伤组织诱导培养基：

以配制500mL培养基计:MS 2.2g，蔗糖15g，甘露醇l 9g，2,4-D 500μL，激动素500μL，用蒸馏水定容至500mL，调pH值5.84-5.88，加琼脂粉3.5g；灭菌后使用时加STS 75μL，特美汀500μL，草甘膦400μL；

5)分化培养基

以配制500mL培养基计:MS 2.2g，葡萄糖5g，木糖0.125g，2-(N-吗啉)乙磺酸0.3g，用蒸馏水定容至500mL，pH5.84-5.88，加琼脂3.5g；灭菌后使用时加入：激动素500μL，吲哚乙酸100μL，特美汀500μL，AgNO₃75μL，草甘膦400μL；

6)生根培养基

以配制500mL培养基计:1/2MS 1.1g，蔗糖15g，用蒸馏水定容至500mL，p5.84-5.88，加琼脂粉3.5g，灭菌使用时加入特美汀500μL。

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