CN106318958A - 一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因、编码蛋白及其应用 - Google Patents

一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因、编码蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因、编码蛋白及其应用，所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因和抗草铵膦蛋白编码基因构成；所述抗草甘膦编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7、G10、GOX或GAT；所述抗草丁膦编码基因为bar或pat。本发明融合蛋白可以赋予植物草甘膦与草铵膦复合抗性；可以用于制备具有草甘膦与草铵膦复合抗性的转基因植物。本发明提供的具有草甘膦与草铵膦复合抗性的融合蛋白可以应用于单子叶植物和双子叶植物的抗除草剂方面，主要应用于抗除草剂抗虫玉米、水稻、大豆、小麦和油菜。

Description

一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因、编码蛋白及 其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因、编码蛋白，及该融合蛋白的应用。
(二)背景技术
杂草和病虫害是农业生产中影响产量的最重要的生物因素。如何降低杂草和病虫害的防治成本、提高防治效率、减少防治过程中给环境造成污染是农业科学研究最关键的问题。
杂草时伴随着人类的生产活动而产生的，它们的存在是长期适应气候、土壤、作物、耕作制度及社会因素与栽培作物竞争的结果。人类从开始从事农业生产就在防治杂草，但是当时的杂草防治仅仅是一种极为粗放的初级劳动。随着科学的发展，特别是近代生命科学的发展进步，人类可以通过基因工程的方法赋予农作物耐受各种除草剂的特性，通过喷施除草剂就可以很好的防治杂草，把人类从初级劳动中解放出来，极大的提高效率。
草甘膦(Glyphosate)是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的竞争类似物，通过植物地上绿色茎叶角质层吸收后，随光合作用产物从韧皮部快速传导至整个植株的各个部位，可防除单子叶和双子叶一年生和多年生草本和灌木等40多科的植物。因其本身广谱、内吸传导式、低毒、低残留、可混性强、价格合理、独特的靶标和作用机理等自身优点，自1971年问世以来，在全世界的销售额已多次位居农药品种的首位。随着转基因作物时代的到来，抗除草剂转基因作物也成为一种普遍的种植需求。1996年美国首先开发了抗草甘膦的转基因大豆，近年来抗草甘膦作物的品种和种植面积还在不断迅速增加。
草铵膦是德国赫斯特公司创制的有机磷类非传导灭生性除草剂，其有效成分为phosphinothricin(PPT)。谷氨酰胺合成酶是植物的一个重要的解毒酶，其在植物氮代谢过程中起着至关重要的作用，它能够解除由氨基酸降解、硝酸盐还原以及光呼吸等过程中释放出的铵的毒性。谷氨酰胺合成酶(GS)是草铵膦的靶标酶，草铵膦能够对植物GS起到抑制作用，使植物氮代谢出现失调，进而使所必需的氨基酸出现缺乏，增大细胞中氨含量，促使植物出现中毒，致使叶绿素解体，最终造成植物的死亡。草铵膦具有的特点包括低毒、高活性、良好的环境兼容性等。早期，在全世界范围内草铵膦的用量并不大，近来，转基因抗草铵膦作用的种植不断扩大带动了对草铵膦的需求，草铵膦也逐渐成为了一种极为畅销的除草剂。
能赋予农作物草甘膦抗性的基因很多，包括突变的对磷酸烯醇式丙酮酸具有高亲和性，而对草甘膦不敏感的EPSPS基因，例如CP4(Padgette,S.R,Kolacz,K.H,Delannay,X,et al.1995,Crop Science,35(5):1451-1461)、aroA(Comai L,Sen LC,Stalker DM.1983,Science,221(4608)：370-371)、G7(中国专利：200910098129.X)、G10(中国专利：201110009329.0)；草甘膦解毒基因，包括可以把草甘膦转化为氨甲基磷酸的草甘膦氧化还原酶基因(glyphosate oxidoreductase gene,GOX)(Kishore,G.M.,&Barry,G.F.1995,Glyphosate tolerant plants)和可以把草甘膦转化为N－乙酰草甘膦的草甘膦乙酰转移酶编码基因(glyphosate N-Acetylation,GAT)(Castle LA；Siehl DL；Gorton R；PattenPA；Chen YH；Bertain S；Cho HJ；Duck N；Wong J；Liu D；Lassner MW.2004,Science,304(5674),1151-4；Castle,L.A.,Hong,C.Y.,Duck,N.B.,Giver,L.J.,Christina,I.,&Jeremy,M.,et al.2004,WO 2002036782A3；2002,WO 2002036782A2；Green J M,Hazel CB,Raymond F D,et al.2008,Pest Management Science,64(4):332-9.)。草铵膦是另外一种杀草谱广、生产体系成熟、被广泛应用的灭生性除草剂。目前已经被克隆出来的抗草铵膦基因包括bar(Thompson CJ；Movva NR；Tizard R；Crameri R；Davies JE；Lauwereys M；Botterman J.1987,Embo Journal,6(9),2519-23；White,J.,Chang,S.Y.P.,Bibb,M.J.,&Bibb,M.J.1990,Nucleic Acids Research,18(4),1062-1062.)，pat(Wohlleben,W.,Arnold,W.,Broer,I.,Hillemann,D.,Strauch,E.,&Pühler,A.1988,gene 70:25-37.Gene,70(1),25-37)。
抗草甘膦转基因作物的大量种植和草甘膦的长期、大规模使用，在美国已经发现了至少21种杂草对草甘膦产生了抗性。据报道，美国堪萨斯州的大豆田中的杂草产生了抗草甘膦能力，以往利用草甘膦可以轻易控制的杂草变得不能被杀灭了，农民一筹莫展。尽管目前抗草甘膦的杂草种类比较少，发生的地点比较孤立，但是为了防止更多草甘膦抗性杂草产生，延长草甘膦在防治杂草方面的有效使用寿命，目前迫切需要研发新的抗其它除草剂的农作物，从而可以通过其它除草剂控制草甘膦抗性杂草和杂草对草甘膦的抗性发展。
草甘膦和草铵膦是目前使用最为广泛的两种灭生性除草剂之一。并且，草甘膦和草铵膦的杀灭机理不同。如果能够研发一种同时对草甘膦和草铵膦的转基因植物，就可以通过草甘膦和草铵膦的混配或者轮换使用防治杂草，这样不但可以拓宽单一除草剂的杀草谱还可以延缓杂草对单一除草剂抗性的产生。因此，研发出一种能赋予植物草甘膦与草铵膦复合抗性的基因具有巨大的应用价值。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种基因，这种基因能够赋予植物草甘膦与草铵膦复合抗性，可以用来生产抗除草剂植物。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，该基因包括编码抗草甘膦蛋白的核苷酸序列和编码抗草铵膦蛋白的核苷酸序列；上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内；抗草甘膦蛋白和抗草铵膦蛋白可以为全长或者截断后的活性多肽片段。具体所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因和抗草铵膦蛋白编码基因构成；所述抗草甘膦编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7、G10、GOX或GAT；所述抗草铵膦编码基因为bar或pat。
进一步，所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因GAT和抗草铵膦蛋白编码基因Bar构成，所述融合基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因CP4和抗草铵膦蛋白编码基因pat构成，所述融合基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因编码蛋白。当所述抗除草剂基因为bar，所述的抗虫基因为GAT时，融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.3；当所述抗除草剂基因为pat，所述的抗虫基因为CP4时，融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
本发明还提供一种所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因编码蛋白在制备抗除草剂转基因作物中的应用，所述作物包括单子叶作物和双子叶作物，更优选所述作物为玉米、水稻、大豆、小麦或油菜。
本发明设计的用抗草甘膦蛋白质多肽和抗草铵膦蛋白质多肽融合成的人工蛋白质分子，与现有的抗除草剂蛋白相比具有如下优点：可以赋予植物草甘膦与草铵膦复合抗性；可以用于制备具有草甘膦与草铵膦复合抗性的转基因植物。
本发明提供的具有草甘膦与草铵膦复合抗性的融合蛋白可以应用于单子叶植物和双子叶植物的抗除草剂方面，主要应用于抗除草剂抗虫玉米、水稻、大豆、小麦和油菜。
(四)附图说明
图1：草甘膦和草铵膦复合抗性融合蛋白的结构示意图。融合蛋白中的抗草甘膦白质多肽和抗草铵膦蛋白质多肽可以分别在N端和C端或者分别在C端和N端。
图2：融合蛋白表达载体T-DNA的结构示意图。pUBI为玉米泛素启动子，融合蛋白为草甘膦和草铵膦复合抗性融合蛋白编码基因，p35S为花椰菜花叶病毒35S启动子，G10EPSPS为抗草甘膦基因。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Labortory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。
实施例1草甘膦和草铵膦复合抗性融合蛋白表达载体的构建
抗草铵膦基因bar和抗草甘膦基因GAT融合构成的融合基因被命名为bar-GAT基因，编码的蛋白质多肽序列如SEQ ID NO：3所示。抗草甘膦基因CP4和抗草铵膦基因pat融合构成的融合基因被命名为CP4-pat基因，编码的蛋白质多肽序列如SEQ ID NO：4所示。
bar-GAT基因(核苷酸序列如：SEQ ID NO：1中第11-1021个碱基所示)，人工合成在5’端设置了BamHI酶切位点，在3’端连接了人工合成的终止子，且设置了KpnI酶切位点，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。CP4-pat基因(核苷酸序列如：SEQ ID NO：2中第224-2164个碱基所示)及其基因5’端的叶绿体转运肽CTP(核苷酸序列如：SEQ ID NO：2中第11-223个碱基所示)和3’端的终止子序列(SEQ ID NO：2中第2165-2371个碱基所示)，该基因通过人工合成，在5’端设置了BamHI酶切位点，在3’端设置了KpnI酶切位点，序列如SEQ ID NO：2所示。
pUBI为玉米泛素蛋白启动子，通过PCR获得。设计PCR引物pUBI-F
(5’GAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCC)和pUBI-R
(5’GGGTGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAAC)，以商业玉米品种郑单958的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得pUBI。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，68℃15秒，72℃2分钟，重复32个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2.0Kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，用HindIII和BamHI双酶切得到pUBI，并且DNA序列测定表明核苷酸序列正确(SEQID NO：5)。
G10EPSPS为抗草甘膦基因(中国专利：201110009329.0)。通过人工合成G10EPSPS基因(SEQ ID NO：6)。合成的基因5’端连接有玉米乙酰乳酸合成酶AHAS叶绿体转运信号肽且设置有XhoI酶切位点，3’端连接有终止子且设置有XhoI酶切位点。
农杆菌T-DNA载体的构建：双元载体pCambia1300-p35S-G10由载体pCambia1300修改而来，简单的说就是把pCambia1300载体中的抗潮霉素基因置换为抗草甘膦基因G10EPSPS。具体把pCambia1300载体经过XhoI酶切以后，去磷酸化处理，然后与经过XhoI酶切后的获得的人工合成的含有叶绿体转运信号肽和终止子的G10EPSPS基因片段进行两端连接，转化，获得的载体即为pCambia1300-p35S-G10。
为了获得bar-GAT基因表达载体，用HindIII和KpnI对之前构建好的pCambia1300-p35S-G10进行双酶切，回收获得载体；用HindIII和BamHI酶切含有pUBI启动子的质粒，获得pUBI片段；用BamHI和KpnI对含有人工合成的bar-GAT基因及其终止子的质粒，回收得到bar-GAT片段。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-融合基因-终止子-启动子-G10EPSPS-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174(图2)。
为了获得CP4-pat基因表达载体，用HindIII和KpnI对之前构建好的pCambia1300-p35S-G10进行双酶切，回收获得载体；用HindIII和BamHI酶切含有pUBI启动子的质粒，获得pUBI片段；用BamHI和KpnI对含有人工合成的CP4-pat基因及其终止子的质粒，回收得到CP4-pat片段。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为：“启动子-融合基因-终止子-启动子-G10EPSPS-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174(图2)。
最后，通过电转的方法把上述2个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例2、水稻的转化
转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取实施例1中构建的载体pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-PAT–p35S-1174的农杆菌划板。挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6左右的农杆菌菌液中(农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种至培养基，28℃培养至OD为0.6左右；培养基组成：3g/L K2HPO4、1g/LNaH2PO4、1g/LNH4Cl、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl2、0.0025g/L FeSO4·7H2O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，28℃共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，28℃筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+1mg/L NAA+5mg/L 6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上，28℃培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。分别获得含上述转化载体和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株。
实施例3、融合蛋白转基因水稻可以抗草铵膦
将实施例2方法制备的转基因水稻植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因水稻植株和非转基因受体对照植株“秀水-134”的抗除草剂性能进行比较分析。我们对获得的128个转pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为BG)和155个转pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174载体的转基因株系(命名为GC)进行不同浓度草铵膦抗性测定，抗性效果如表1所示：
表1*：
*注：表一为对播种后15天的水稻植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草铵膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为保试达-18％草铵膦(德国拜耳)按体积比1:150稀释，2x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按体积比1:75稀释，3x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按体积比1:50稀释。
实施例4、融合蛋白转基因水稻可以抗草甘膦
将实施例2方法制备的转基因水稻植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因水稻植株和非转基因受体对照植株“秀水-134”的抗除草剂性能进行比较分析。我们对获得的128个转pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为BG)和155个转pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174载体的转基因株系(命名为GC)进行不同浓度草甘膦抗性测定，抗性效果如表2所示：
表2*：
*注：表一为对播种后15天的水稻植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草甘膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:300稀释，2x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:150稀释，3x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:100稀释。
实施例5、融合蛋白转基因水稻可以抗草甘膦草铵膦复配除草剂
将实施例2方法制备的转基因水稻植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因水稻植株和非转基因受体对照植株的抗除草剂性能进行比较分析。我们对获得的128个转pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为BG)和155个转pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174载体的转基因株系(命名为GC)进行不同浓度草甘膦草铵膦混配除草剂抗性测定，抗性效果如表3所示：
表3*：
*注：表一为对播种后15天的水稻植株喷施不同浓度草甘膦草铵膦复配除草剂进行抗性检测。喷施草甘膦草铵膦复配除草剂10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株“秀水-134”没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为35％草铵膦.草甘膦铵盐水剂(新安化工)按体积比1:300稀释，2x为35％草铵膦.草甘膦铵盐水剂(新安化工)按体积比1:150稀释，3x为35％草铵膦.草甘膦铵盐水剂(新安化工)按体积比1:100稀释。
实施例6、玉米的转化
玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:Vladimir Sidorov&David Duncan(in M.Paul Scott(ed.),Methods in MolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei&Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediatedtransformation of maize.Nature Protocols 2:1614-1622。基本方法如下：取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将实施例1中制备的含有T-DNA载pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174的农杆菌与未成熟胚在共培养培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+5mg/L AgNO3+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L kinetin+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。分别获得含转化载体pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174的转基因玉米植株。
实施例7、融合蛋白转基因玉米可以抗草铵膦
将实施例6制备的转基因玉米植株的T0代植株移栽到温室中，用商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)的花粉进行授粉，收获T0代种子。然后将这些品系与商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)进行回交转育，获得Z58近等位基因系。再对这些近等位基因系的除草剂抗性进行比较分析。
我们对获得的66个转pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为BG)和49个转pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174载体的转基因株系(命名为GC)进行不同浓度草甘膦抗性测定，抗性效果如表4所示：
表4*：
*注：表一为对3叶1心期的玉米植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草铵膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株“Z58”没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为保试达-18％草铵膦(德国拜耳)按体积比1:150稀释，2x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按体积比1:75稀释，3x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按体积比1:50稀释。
实施例8、融合蛋白转基因玉米可以抗草甘膦
将实施例6制备的转基因玉米植株的T0代植株移栽到温室中，用商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)的花粉进行授粉，收获T0代种子。然后将这些品系与商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)进行回交转育，获得Z58近等位基因系。再对这些近等位基因系的除草剂抗性进行比较分析。
我们对获得的66个转pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为BG)和49个转pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174载体的转基因株系(命名为GC)进行不同浓度草甘膦抗性测定，抗性效果如表5所示：
表5*：
*注：表一为对3叶1心期的玉米植株喷施不同浓度草甘膦进行抗性检测。。喷施草甘膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株“Z58”没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:300稀释，2x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:150稀释，3x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:100稀释。
实施例9、融合蛋白转基因水稻可以抗草甘膦草铵膦复配除草剂
将实施例6制备的转基因玉米植株的T0代植株移栽到温室中，用商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)的花粉进行授粉，收获T0代种子。然后将这些品系与商业化品种“郑丹958”的母本，“郑58”(Z58)进行回交转育，获得Z58近等位基因系。再对这些近等位基因系的除草剂抗性进行比较分析。
我们对获得的66个转pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为BG)和49个转pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174载体的转基因株系(命名为GC)进行不同浓度草甘膦草铵膦混配除草剂抗性测定，抗性效果如表6所示：
表6*：
*注：表一为对3叶1心期的玉米植株喷施不同浓度草甘膦草铵膦复配除草剂进行抗性检测。喷施草甘膦草铵膦复配除草剂10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株“Z58”没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为35％草铵膦.草甘膦铵盐水剂(新安化工)按体积比1:300稀释，2x为35％草铵膦.草甘膦铵盐水剂(新安化工)按体积比1:150稀释，3x35％草铵膦.草甘膦铵盐水剂(新安化工)按体积比1:100稀释。
实施例10.大豆转化
这里使用的获得转基因大豆的步骤来自于已有的技术(Deng et al.,1998,PlantPhysiology Communications 34:381-387；Ma et al.,2008,ScientiaAgriculturaSinica 41:661-668；Zhou et al.,2001,Journal of NortheastAgricultural University 32:313-319)。选取健康、饱满、成熟的“天隆1号”大豆，用80％乙醇消毒2分钟，再用无菌水清洗，然后放置在充满氯气(由50mlNaClO与2ml浓HCl反应生成)的干燥器中灭菌4-6个小时。灭菌后的大豆在超净工作台里被播撒到B5培养基中，25℃条件下培养5天，同时光密度在90-150μmol光子/m2·s水平。当子叶变绿并顶破种皮，无菌的豆芽就会长出。去掉了下胚轴的豆芽在长度上被切成五五开，使得两片外植体都具有子叶和上胚轴。在子叶和上胚轴的节点处切外植体大约7-8处，即可用作被侵染的目标组织。
分别含有载体pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174和pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174的单克隆农杆菌被分开培养待用。准备好的外植体浸没在农杆菌悬浮液中共培养30分钟左右。然后，将侵染的组织上多余的细胞悬浮液用吸水纸吸收干净，再转移到1/10B5共培养培养基里25℃暗培养3-5天。
共培养的植物组织用B5液体培养基清洗，以除去多余的农杆菌，然后放置到B5固体培养基中25℃下培养5天，待其发芽。诱导发生的胚芽组织转移到含有0.1-0.5mM草甘膦的B5筛选培养基中，25℃光照培养4周，期间每两周更换一次培养基。筛选出来的胚芽组织再转移到固体培养基中，25℃培养，待其长成小苗。随后，将转基因植株苗转移到1/2B5培养基中进行生根诱导。最后，长成的小植株经清洗去除琼脂后栽种在温室中。
实施例11、融合蛋白转基因大豆可以抗草铵膦
将实施例10方法制备的转基因大豆植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因大豆植株和非转基因受体对照植株的抗除草剂性能进行比较分析。我们对获得的55个转pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为BG)和42个转pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174载体的转基因株系(命名为GC)进行不同浓度草铵膦抗性测定，抗性效果如表7所示：
表7*：
*注：表一为对播种后20天的大豆植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草铵膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株“天隆1号”没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为保试达-18％草铵膦(德国拜耳)按体积比1:150稀释，2x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按体积比1:75稀释，3x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按体积比1:50稀释。
实施例12、融合蛋白转基因大豆可以抗草甘膦
将实施例10方法制备的转基因大豆植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因大豆植株和非转基因受体对照植株的抗除草剂性能进行比较分析。我们对获得的128个转pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为BG)和155个转pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174载体的转基因株系(命名为GC)进行不同浓度草甘膦抗性测定，抗性效果如表8所示：
表8*：
*注：表一为对播种后20天的大豆植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草甘膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株“天隆1号”没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:300稀释，2x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:150稀释，3x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按体积比1:100稀释。
实施例13、融合蛋白转基因大豆可以抗草甘膦草铵膦复配除草剂
将实施例10方法制备的转基因大豆植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因大豆植株和非转基因受体对照植株的抗除草剂性能进行比较分析。我们对获得的128个转pCambia1300-pUBI-bar-GAT–p35S-1174载体的转基因株系(命名为BG)和155个转pCambia1300-pUBI-CP4-pat–p35S-1174载体的转基因株系(命名为GC)进行不同浓度草甘膦草铵膦混配除草剂抗性测定，抗性效果如表9所示：
表9*：
*注：表一为对播种后20天的大豆植株喷施不同浓度草甘膦草铵膦复配除草剂进行抗性检测。喷施草甘膦草铵膦复配除草剂10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株“天隆1号”没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为35％草铵膦.草甘膦铵盐水剂(新安化工)按体积比1:300稀释，2x为35％草铵膦.草甘膦铵盐水剂(新安化工)按体积比1:150稀释，3x为35％草铵膦.草甘膦铵盐水剂(新安化工)按体积比1:100稀释。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因和抗草铵膦蛋白编码基因构成；所述抗草甘膦编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7、G10、GOX或GAT；所述抗草铵膦编码基因为bar或pat。
2.如权利要求1所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因GAT和抗草铵膦蛋白编码基因Bar构成。
3.如权利要求2所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因CP4和抗草铵膦蛋白编码基因pat构成。
5.如权利要求4所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
6.一种权利要求1所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因编码蛋白。
7.如权利要求6所述编码蛋白，其特征在于所述编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
8.一种权利要求6所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因编码蛋白在制备抗除草剂转基因作物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述作物包括单子叶作物和双子叶作物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述作物为玉米、水稻、大豆、小麦或油菜。
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