CN112626111A - 一种除草剂抗性基因表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种除草剂抗性基因表达载体及其应用，所述表达载体包含启动子、草甘膦抗性基因、草铵膦抗性基因和终止子；所述草甘膦抗性基因采用启动子pUbi，草铵膦抗性基因采用复合启动子；所述复合启动子由玉米Ubi启动子pUbi、花椰菜病毒的35S启动子和水稻Actin基因中内含子组成的复合启动子；本发明利用同一个载体高表达草甘膦抗性基因和草铵膦抗性基因，并且通过该载体可以获得同时高抗草甘膦和草铵膦的转基因植物。

Description

一种除草剂抗性基因表达载体及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种除草剂抗性基因表达载体及其应用。
(二)背景技术
转基因植物的性状由基因本身和控制基因表达的调控元件共同决定。基因表达调控元件包括启动子、终止子、增强子和信号肽等，任何一个表达调控元件对基因的表达都至关重要。我国科学家通过从大量启动子中筛选到了矮牵牛MADS-box基因花结合蛋白7(FBP7)2启动子的驱动IAA在棉花胚珠表皮中过表达，使转基因棉花与对照相比，皮棉产量提高了15％以上，纤维细度也显著提高，而其他启动子都没有这种效果(ZhangM etal.2011.Nature Biotechnology.29(5),453-458.)。
杂草是伴随着人类的生产活动而产生的，它们的存在是长期适应气候、土壤、作物、耕作制度及社会因素与栽培作物竞争的结果。人类从开始从事农业生产就在防治杂草，但是当时的杂草防治仅仅是一种极为粗放的初级劳动。随着科学的发展，特别是近代生命科学的发展进步，人类可以通过基因工程的方法赋予农作物耐受各种除草剂的特性，通过喷施除草剂就可以很好的防治杂草，把人类从初级劳动中解放出来，极大的提高效率。
草甘膦(Glyphosate)是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的竞争类似物，通过植物地上绿色茎叶角质层吸收后，随光合作用产物从韧皮部快速传导至整个植株的各个部位，可防除单子叶和双子叶一年生和多年生草本和灌木等40多科的植物。草铵膦(glufosinateammonium，phosphinothricin)是由原德国艾格福公司(后归属拜耳公司)在20世纪80年代开发成功的一种广谱触杀型灭生性除草剂。草铵膦属于膦酸类除草剂，能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶，从而干扰植物的代谢，使植物死亡。
能赋予农作物草甘膦抗性的基因很多，包括突变的对磷酸烯醇式丙酮酸具有高亲和性，而对草甘膦不敏感的EPSPS基因，例如CP4(Padgette,S.R.et al.1995,CropScience,35(5):1451-1461)、aroA(Comai L.etal.1983,Science,221(4608)：370-371)、G7(中国专利：200910098129.X)、G10(中国专利：201110009329.0)；草甘膦解毒基因，包括可以把草甘膦转化为氨甲基磷酸的草甘膦氧化还原酶基因(glyphosate oxidoreductasegene,GOX)(Kishore,G.M.,&Barry,G.F.1995,Glyphosate tolerant plants)和可以把草甘膦转化为N－乙酰草甘膦的草甘膦乙酰转移酶编码基因(glyphosate N-Acetylation,GAT)(Castle LA etal.2004,Science,304(5674),1151-4；Castle,L.A.et al.2004,WO2002036782 A3；2002,WO 2002036782 A2；Green J M.et al.2008,Pest ManagementScience,64(4):332-9.)。草铵膦是另外一种杀草谱广、生产体系成熟、被广泛应用的灭生性除草剂。目前已经被克隆出来的抗草铵膦基因包括bar(Thompson CJetal.1987,EmboJournal,6(9),2519-23；White,J.etal.1990,Nucleic Acids Research,18(4),1062-1062.)，pat(Wohlleben,W.etal.1988,gene 70:25-37.)。
抗草甘膦转基因作物的大量种植和草甘膦的长期、大规模使用，在美国已经发现了至少21种杂草对草甘膦产生了抗性。草甘膦和草铵膦是目前使用最为广泛的两种灭生性除草剂之一。并且，草甘膦和草铵膦的杀灭机理不同。如果能够研发一种同时对草甘膦和草铵膦的转基因植物，就可以通过草甘膦和草铵膦的混配或者轮换使用防治杂草，这样不但可以拓宽单一除草剂的杀草谱还可以延缓杂草对单一除草剂抗性的产生。因此，研发出一种能赋予植物草甘膦与草铵膦复合抗性的除草剂抗性基因具有巨大的应用价值。
目前，常用的在同一植物内表达两个或多个基因的策略及其优缺如表1所示。杂交策略的育种工作量大，两种性状杂交后代的性状存在不确定性；而基因融合和2A肽表达策略都存在表达量低，表达蛋白存在不确定性和安全评价难度大的缺点。因此，通过多表达框连锁表达是一个较为保守和可靠的多基因聚合表达策略。多基因表达过程中最大的难点是要同时实现两个或多个目的基因的高表达，因此，通过创造性的选择表达调控元件，包括启动子、终止子、增强子等，创造一套可以同时在植物中高表达草甘膦抗性基因和草铵膦抗性基因的植物表达载体非常迫切。
表1：多基因聚合表达策略及其优缺点
Figure BDA0002789614450000021
Figure BDA0002789614450000031
(三)发明内容
本发明目的是提供一种除草剂抗性基因表达载体及其应用，利用两个连锁的读码框实现两种除草剂抗性基因在一个载体中高表达，有效解决了利用一个载体同时高表达两种除草剂抗性蛋白的问题，并且通过该载体可以获得高抗草甘膦和草铵膦的转基因作物。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种除草剂抗性基因表达载体(即同时高表达草甘膦抗性基因和草铵膦抗性基因的双元载体表达框)，所述表达载体(即T-DNA)包含启动子、草甘膦抗性基因、草铵膦抗性基因和终止子；所述草甘膦抗性基因采用启动子pUbi，草铵膦抗性基因采用复合启动子；所述复合启动子由玉米Ubi启动子pUbi、花椰菜病毒的35S启动子和水稻Actin基因中内含子组成的复合启动子，记为复合启动子p35S-OsAct1intron。
进一步，所述复合启动子p35S-OsAct1 intron的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中4069bp-5393bp所示。
进一步，所述草甘膦抗性基因5’端有信号肽，该信号肽是可以介导草甘膦基因在植物叶绿体中表达的核苷酸序列，优选所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中2288bp-2509bp所示。
进一步，所述草甘膦抗性基因包括但不限于CP4、aroA、G7、G10、GOX、GAT(刘健等.2015.草业学报.5:159-166)，优选cp4基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1中2510bp-3877bp所示。
所述草铵膦抗性基因包括但不限于bar、pat(Abdeen,Ashraf,and BrianMiki.2009.Plant Biotechnology Journal 7(3):266–82.)，优选bar基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1中5401bp-5955bp所示。
进一步，所述cp4基因与bar基因的终止子核苷酸序列相同，均为SEQ ID NO：1中3884bp-4068bp所示。
本发明双元载体的骨架序列，包括但不限于pCAMBIA-1300(NCBI ACCESSION:AF234296中的298bp-6582bp)。
进一步，所述高表达草甘膦抗性基因和草铵膦抗性基因的双元载体表达框T-DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
本发明所述高表达草甘膦抗性基因和草铵膦抗性基因的双元载体表达框T-DNA按如下步骤构建：用XhoI和KpnI对pCambia1300进行双酶切，回收获得载体；用XhoI和NcoI酶切含有人工合成bar基因的质粒，获得bar片段；用NcoI和KpnI对含有人工合成的p35S-OsAct1 intron复合启动子的质粒，回收得到p35S-OsAct1 intron片段；然后，将上述酶切后的载体和两个片段(bar片段、p35S-OsAct1 intron片段)进行三段连接，获得过渡载体1300-p35S-OsAct1 intron-bar；用HindII和KpnI分别对含有人工合成pUBi-CP4-ter质粒和过渡载体1300-p35S-OsAct1 intron-bar进行双酶切，分别获得pUBi-CP4-ter片段和载体；将上述酶切后的过渡载体和片段(pUBi-CP4-ter片段)进行连接，获得最载体1300-p35S-OsAct1 intron-bar-pUBi-CP4，简称为CSAB。
本发明还提供一种同时高表达草甘膦抗性基因和草铵膦抗性基因的双元载体表达框在制备转基因抗除草剂农作物中的应用。
进一步，所述农作物包括单子叶作物和双子叶作物；优先玉米、水稻、大豆、小麦和油菜。
本发明通过农杆菌介导法或者基因枪法将含有核苷酸序列为SEQ ID NO：1的T-DNA导入植物中，然后通过喷施除草剂和分子检测的方法筛选出同时高表达cp4和bar的转化体。比如农杆菌介导的转基因水稻制备方法，以水稻成熟胚诱导的愈伤组织为材料，通过侵染、共培育、筛选、预分化、分化、生根后获得转基因水稻材料；农杆菌介导的转基因玉米制备方法，以玉米幼胚为材料，通过侵染、共培育、愈伤诱导、筛选、预分化、分化、生根后获得转基因玉米材料；农杆菌介导的转基因大豆制备方法，具体的，以大豆子叶和上胚轴为材料，通过侵染、共培育、胚芽诱导、筛选、生根后获得转基因大豆材料。
本发明提供了一种转基因植物中cp4基因表达量的检查方法，具体的取0.1g叶片，切块加入1-1.5ml PBS后加入到匀浆器中碾磨碎，接下来严格按CP4 EPSPS转基因检测试剂盒(AP010 EnviroLogix)的说明书操作即可。
本发明提供了一种转基因植物中bar基因表达量的检查方法，具体的取0.1g叶片，切块加入1-1.5ml PBS后加入到匀浆器中碾磨碎，接下来严格按PAT/bar转基因检测试剂盒(AS013LS EnviroLogix)的说明书操作即可。
作为对照，我们还提供了另外两个同时表达草甘膦抗性基因和草铵膦抗性基因的双元载体，两个载体中用于介导bar基因表达的启动子分别为35S启动子中的增强子35SE和水稻Act1基因的启动子组成的复合启动子35SE-pOsAct1和水稻Act1基因的启动子pOsAct1，核苷酸序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：2中第218bp-1586bp所示。pOsAct1中包含了OsAct1基因的启动子序列及其第一个外显子和第一个内含子。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用同一个载体高表达草甘膦抗性基因和草铵膦抗性基因，并且通过该载体可以获得同时高抗草甘膦和草铵膦的转基因植物。
(四)附图说明
图1：同时高表达cp4和bar基因的双元载体CSAB的结构示意图。pUBI为玉米泛素启动子，SP为介导cp4基因在叶绿体中表达的信号肽，p35S-Act1 intron为花椰菜花叶病毒35S启动子与水稻Act1的第一个外显子和第一个内含字组成的复合启动子，cp4为抗草甘膦基因，bar为抗草铵膦基因。
图2：对照载体CEAB的结构示意图。pUBI为玉米泛素启动子，SP为介导cp4基因在叶绿体中表达的信号肽，35SE为35S启动子中的增强子，pOsAct1为水稻Act1基因的启动子及其第一个外显子和第一个内含子，cp4为抗草甘膦基因，bar为抗草铵膦基因。
图3：对照载体CAB的结构示意图。pUBI为玉米泛素启动子，SP为介导cp4基因在叶绿体中表达的信号肽，pOsAct1为水稻Act1基因的启动子及其第一个外显子和第一个内含子，cp4为抗草甘膦基因，bar为抗草铵膦基因。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Labortory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。
实施例1、载体的构建
为了构建本发明中涉及的三个载体，分别人工合成p35S-OsAct1 intron复合启动子(SEQ ID NO：1中4069bp-5393bp所示)、草铵膦抗性基因bar(SEQ ID NO：1中5401bp-5955bp)、pUBi-CP4-ter(SEQ ID NO：1中第274bp-4073bp)、35SE-pOsAct1启动子(SEQ IDNO：2)和水稻Act1基因的启动子pOsAct1(SEQ ID NO：2中第218bp-1586bp)。
(1)CSAB载体的构建：图1，为了获得同时高表达cp4和bar基因表达载体，用XhoI和KpnI对载体pCambia1300(购自VWR公司)进行双酶切，回收获得载体pCambia1300；用XhoI和NcoI酶切含有人工合成bar基因(SEQ ID NO：1中5401bp-5955bp)的质粒，获得bar片段；用NcoI和KpnI对含有人工合成的p35S-OsAct1 intron复合启动子(SEQ ID NO：1中4069bp-5393bp所示)的质粒，回收得到p35S-OsAct1intron片段。然后，把上述酶切后的载体pCambia1300和两个片段(bar片段、p35S-OsAct1 intron片段)进行三段连接，获得过渡载体1300-p35S-OsAct1 intron-bar。然后，用HindII和KpnI分别对含有人工合成pUBi-CP4-ter质粒和过渡载体1300-p35S-OsAct1 intron-bar进行双酶切，分别获得pUBi-CP4-ter片段和过渡载体1300-p35S-OsAct1 intron-bar。然后，把上述酶切后的过渡载体1300-p35S-OsAct1intron-bar和片段(pUBi-CP4-ter片段)进行连接，获得最载体1300-p35S-OsAct1intron-bar-pUBi-CP4，我们把这个载体简称为CSAB，核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
(2)CEAB载体的构建：图2，类似的，用XhoI和KpnI对载体pCambia1300进行双酶切，回收获得载体pCambia1300；用XhoI和NcoI酶切含有人工合成bar基因的质粒，获得bar片段；用NcoI和KpnI酶切含有人工合成的35SE-pOsAct1启动子(SEQ ID NO：2)的质粒，回收得到35SE-pOsAct1片段。然后，把上述酶切后的载体和两个片段(bar片段、35SE-pOsAct1片段)进行三段连接，获得过渡载体1300-35SE-pOsAct1-bar。然后，用HindII和KpnI分别对含有人工合成pUBi-CP4-ter的质粒和过渡载体1300-35SE-pOsAct1-bar进行双酶切，分别获得pUBi-CP4-ter片段和过渡载体。然后，把上述酶切后的过渡载体1300-35SE-pOsAct1-bar和pUBi-CP4-ter片段进行连接，获得最载体1300-35SE-pOsAct1-bar-pUBi-CP4，我们把这个载体简称为CEAB。
(3)CAB载体的构建：图3，类似的，用XhoI和KpnI对pCambia1300进行双酶切，回收获得载体pCambia1300；用XhoI和NcoI酶切含有人工合成bar基因的质粒，获得bar片段；用NcoI和KpnI对含有人工合成的pOsAct1启动子的质粒，回收得到pOsAct1片段。然后，把上述酶切后的载体和两个片段进行三段连接，获得过渡载体1300-pOsAct1-bar。然后，用HindII和KpnI分别对含有人工合成pUBi-CP4-ter的质粒和过渡载体1300-pOsAct1-bar进行双酶切，分别获得pUBi-CP4-ter片段和过渡载体1300-pOsAct1-bar。然后，把上述酶切后的过渡载体1300-pOsAct1-bar和pUBi-CP4-ter片段进行连接，获得最载体1300-pOsAct1-bar-pUBi-CP4，我们把这个载体简称为CAB。
最后，通过电转的方法把上述3个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例2、水稻的转化
转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取实施例1中构建的载体CSAB、CEAB和CAB的农杆菌划板。挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6农杆菌菌液中(农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种至培养基，培养至OD为0.6；培养基组成：3g/L K2HPO4、1g/LNaH2PO4、1g/LNH4Cl、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl2、0.0025g/LFeSO4·7H2O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D(二氯苯氧乙酸)+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+1mg/L NAA+5mg/L6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+2.5g/Lgelrite)上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。分别获得含上述转化载体和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株。
实施例3、转基因水稻中bar和cp4基因表达水平的检查
1、PAT/bar蛋白提取和ELISA分析
转基因植物中bar基因表达量的检查方法：取0.1g叶片，切块加入1-1.5ml 1×PBS后加入到匀浆器中碾磨碎，接下来严格按PAT/bar转基因检测试剂盒(AS013LSEnviroLogix)的说明书操作即可。
具体的，用1×PBS将样本提取物稀释500倍。以含有相同稀释液倍数的非转基因水稻植株相同组织提取物作为对照，用以检测由于测试组织产生的背景信号。含有微生物产生的已知浓度的BAR标准品(李葱葱等.2015.湖北农业科学,000(010),2516-2518)，用于生成标准曲线(曲线方程为Y＝0.228X-1.638)。每个酶标板上含有空白缓冲液，用于检测提取缓冲液的背景信号。Envirologix QualiPlateTM ELISA试剂盒(货号AS013LS)用于检测BAR含量。将样品、对照和标准品分别添加至酶标板上，在室温(25-30℃)下孵育30分钟。然后，清洗酶标板，将抗体共轭溶液添加至每块酶标板，并在室温下孵育30分钟。抗体共轭孵育后，清洗酶标板。将底物液添加至酶标板，在室温下孵育30分钟。孵育后，将反应停止液加入酶标板，在450nm波长下读取OD值，再根据标准曲线方程换算成表达量(表2)。
表2：不同水稻组织中PAT/bar的平均含量(μg/g±SD)
Figure BDA0002789614450000081
Figure BDA0002789614450000091
注：鲜重平均值、标准差和测定值范围是基于对每个组织类型的所有读取值(n＝30个不同品系)。对每组平均值进行student-t检验分析，字母不同表示两组数据之间存在著性差异(p<0.05)。
从表2中可以看出，载体CSAB的水稻转化体的叶片和种子中的bar基因平均表达量显著高于载体CEAB和CAB载体的水稻转化体。由此可见转化载体CSAB在水稻中过表达bar基因的水平显著高于CEAB或CAB载体。
2、CP4蛋白提取和ELISA分析
转基因植物中cp4基因表达量的检查方法：取0.1g叶片，切块加入1-1.5ml PBS后加入到匀浆器中碾磨碎，接下来严格按CP4 EPSPS转基因检测试剂盒(AP010EnviroLogix)的说明书操作即可。
具体的，用1×PBS将样本提取物稀释500倍。以含有相同稀释液倍数的非转基因水稻植物相同组织提取物作为对照，用以检测由于测试组织产生的背景信号。每个酶标板上含有微生物产生的已知浓度的CP4标准品(Liu SP et al.2012.Journal of AgriculturalScience and Technology.14(1):97-103)，用于生成标准曲线(曲线方程为Y＝1.794X+0.605)。每个酶标板上含有空白缓冲液，用于检测提取缓冲液的背景信号。EnvirologixQualiPlateTM ELISA试剂盒(货号AP010)用于检测CP4含量。将样品、对照和标准品添加至酶标板上，在室温下孵育30分钟。然后，清洗酶标板，将抗体共轭溶液添加至每块酶标板，并在室温下孵育30分钟。抗体共轭孵育后，清洗酶标板。将底物液添加至酶标板，在室温下孵育30分钟。孵育后，将反应停止液加入酶标板，在450nm波长下读取OD值，再根据标准曲线方程换算成表达量(表3)。
表3：不同水稻组织中CP4的平均含量(μg/g±SD)
Figure BDA0002789614450000092
注：鲜重平均值、标准差和测定值范围是基于对每个组织类型的所有读取值(n＝30个不同品系)。对每组平均值进行student-t检验分析，字母不同表示两组数据之间存在著性差异(p<0.05)。
从表3中可以看出，载体CSAB的水稻转化体的叶片和种子中的cp4基因平均表达量显著高于载体CEAB和CAB载体的水稻转化体。由此可见转化载体CSAB在水稻中过表达cp4基因的水平显著高于CEAB或CAB载体。
从表2和表3中可以看出，载体CSAB的水稻转化体的叶片和种子中的bar基因和cp4基因平均表达量均显著高于载体CEAB和CAB载体的水稻转化体。由此可见转化载体CSAB在水稻中过表达bar和cp4基因的水平显著高于CEAB或CAB载体。
实施例4、转基因水稻对草甘膦和草铵膦的抗性水平测试
将实施例2制备的转基因水稻植株的T2代植株移栽到温室中，分别对50个CSAB、CEAB和CAB载体的转基因水稻植株进行草铵膦和草甘膦的抗性测定，抗性效果如表4所示：
表4*：
喷施倍数 1x 2x 4x
CSAB抗性转化事件个数 50 49 46
CEAB抗性转化事件个数 45 31 12
CAB抗性转化事件个数 41 10 0
*注：表4为对播种后15天的水稻植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草铵膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为保试达-18％草铵膦(德国拜耳)按1:300稀释，2x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按1:150稀释，3x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按1:75稀释。
表5*：
喷施倍数 1x 2x 4x
CSAB抗性转化事件个数 50 49 45
CEAB抗性转化事件个数 45 29 9
CAB抗性转化事件个数 41 25 7
*注：表5为对播种后15天的水稻植株喷施不同浓度草甘膦进行抗性检测。喷施草甘膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:300稀释，2x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:150稀释，4x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:75稀释。
从表4和表5中可以看出，载体CSAB的水稻转化体对草铵膦和草甘膦的抗性水平显著高于CEAB和CAB载体的水稻转化体。由此可见转化载体CSAB在获得高抗草甘膦和草铵膦转基因水稻中显著优于CEAB或CAB载体。
实施例5、玉米的转化
玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:Vladimir Sidorov&David Duncan(in M.Paul Scott(ed.),Methods in MolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei&Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediatedtransformation of maize.Nature Protocols 2:1614-1622。基本方法如下：取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将实施例1中制备的含有T-DNA载体CSAB、CEAB和CAB的农杆菌与未成熟胚在共培养培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+5mg/L AgNO3+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L kinetin+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。分别获得含转化载体CSAB、CEAB和CAB的转基因玉米植株。
实施例6、转基因玉米中bar和cp4基因表达水平的检查
参考实施例3中的检查方法，分别对通过实施例5获得的转基因玉米品系中的bar和cp4基因表达水平进行检查。
表6：不同玉米组织中PAT/bar的平均含量(μg/g±SD)
Figure BDA0002789614450000111
Figure BDA0002789614450000121
注：鲜重平均值、标准差和测定值范围是基于对每个组织类型的所有读取值(n＝30个不同品系)。对每组平均值进行student-t检验分析，字母不同表示两组数据之间存在著性差异(p<0.05)。
从表6中可以看出，载体CSAB的玉米转化体的叶片中的bar基因平均表达量显著高于载体CEAB和CAB载体的玉米转化体。由此可见转化载体CSAB在玉米中过表达bar基因的水平显著高于CEAB或CAB载体。
表7：不同玉米组织中CP4的平均含量(μg/g±SD)
Figure BDA0002789614450000122
注：鲜重平均值、标准差和测定值范围是基于对每个组织类型的所有读取值(n＝30个不同品系)。对每组平均值进行student-t检验分析，字母不同表示两组数据之间存在著性差异(p<0.05)。
从表7中可以看出，载体CSAB的玉米转化体的叶片中的cp4基因平均表达量显著高于载体CEAB和CAB载体的玉米转化体。由此可见转化载体CSAB在玉米中过表达cp4基因的水平显著高于利用CEAB或CAB载体。
从表6和表7中可以看出，载体CSAB的玉米转化体的叶片中的bar基因和cp4基因平均表达量均显著高于载体CEAB和CAB载体的玉米转化体。由此可见转化载体CSAB在玉米中过表达bar和cp4基因的水平显著高于CEAB或CAB载体。
实施例7、转基因玉米对草铵膦和草甘膦的抗性水平测试
实施例5制备的转基因玉米植株的T2代植株移栽到温室中，分别对50个CSAB、CEAB和CAB载体的转基因玉米植株进行草铵膦和草甘膦的抗性测定，抗性效果分别如表8和表9所示：
表8*：
喷施倍数 1x 2x 4x
CSAB抗性转化事件个数 50 49 46
CEAB抗性转化事件个数 40 16 5
CAB抗性转化事件个数 36 8 0
*注：表8为对4叶期的玉米植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草铵膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为保试达-18％草铵膦(德国拜耳)按1:300稀释，2x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按1:150稀释，3x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按1:75稀释。
表9*：
喷施倍数 1x 2x 4x
CSAB抗性转化事件个数 50 48 44
CEAB抗性转化事件个数 46 45 40
CAB抗性转化事件个数 45 44 39
*注：表9为对4叶期的玉米植株喷施不同浓度草甘膦进行抗性检测。喷施草甘膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:300稀释，2x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:150稀释，4x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:75稀释。
从表8和表9中可以看出，载体CSAB的玉米转化体对草甘膦和草铵膦的抗性水平显著高于CEAB和CAB载体的玉米转化体。由此可见转化载体CSAB在获得高抗草甘膦和草铵膦转基因玉米中显著优于CEAB或CAB载体。
实施例8.大豆转化
这里使用的获得转基因大豆的步骤来自于已有的技术(Deng et al.,1998,PlantPhysiology Communications 34:381-387；Ma et al.,2008,Scientia AgriculturaSinica 41:661-668；Zhou et al.,2001,Journal of Northeast AgriculturalUniversity 32:313-319)。选取健康、饱满、成熟的大豆，用80％乙醇消毒2分钟，再用无菌水清洗，然后放置在充满氯气(由50ml NaClO与2ml浓HCl反应生成)的干燥器中灭菌4-6个小时。灭菌后的大豆在超净工作台里被播撒到B5培养基中，25℃条件下培养5天，同时光密度在90-150μmol光子/m2·s水平。当子叶变绿并顶破种皮，无菌的豆芽就会长出。去掉了下胚轴的豆芽在长度上被切成五五开，使得两片外植体都具有子叶和上胚轴。在子叶和上胚轴的节点处切外植体大约7-8处，即可用作被侵染的目标组织。
分别含有载体CSAB、CEAB和CAB的单克隆农杆菌被分开培养待用。准备好的外植体浸没在农杆菌悬浮液中共培养30分钟左右。然后，将侵染的组织上多余的细胞悬浮液用吸水纸吸收干净，再转移到1/10B5共培养培养基里25℃暗培养3-5天。
共培养的植物组织用B5液体培养基清洗，以除去多余的农杆菌，然后放置到B5固体培养基中25℃下培养5天，待其发芽。诱导发生的胚芽组织转移到含有0.1-0.5mM草甘膦的B5筛选培养基中，25℃光照培养4周，期间每两周更换一次培养基。筛选出来的胚芽组织再转移到固体培养基中，25℃培养，待其长成小苗。随后，将转基因植株苗转移到1/2B5培养基中进行生根诱导。最后，长成的小植株经清洗去除琼脂后栽种在温室中。
实施例9、转基因大豆中bar和cp4基因表达水平的检查
参考实施例3中的检查方法，分别对通过实施例8获得的转基因大豆品系中的bar和cp4基因表达水平进行检查。
表10：不同玉米组织中PAT/bar的平均含量(μg/g±SD)
Figure BDA0002789614450000141
注：鲜重平均值、标准差和测定值范围是基于对每个组织类型的所有读取值(n＝30个不同品系)。对每组平均值进行student-t检验分析，字母不同表示两组数据之间存在著性差异(p<0.05)。
从表10中可以看出，载体CSAB的玉米转化体的叶片中的bar基因平均表达量显著高于载体CEAB和CAB载体的玉米转化体。由此可见转化载体CSAB在玉米中过表达bar基因的水平显著高于CEAB或CAB载体。
表11：不同玉米组织中CP4的平均含量(μg/g±SD)
Figure BDA0002789614450000142
Figure BDA0002789614450000151
注：鲜重平均值、标准差和测定值范围是基于对每个组织类型的所有读取值(n＝30个不同品系)。对每组平均值进行student-t检验分析，字母不同表示两组数据之间存在著性差异(p<0.05)。
从表11中可以看出，载体CSAB的玉米转化体的叶片中的cp4基因平均表达量显著高于载体CEAB和CAB载体的玉米转化体。由此可见转化载体CSAB在玉米中过表达cp4基因的水平显著高于CEAB或CAB载体。
从表10和表11中可以看出，载体CSAB的玉米转化体的叶片中的bar基因和cp4基因平均表达量均显著高于载体CEAB和CAB载体的玉米转化体。由此可见转化载体CSAB在玉米中过表达bar和cp4基因的水平显著高于CEAB或CAB载体。
实施例10、转基因大豆对草甘膦和草铵膦的抗性水平测试
将实施例8制备的转基因大豆植株的T2代植株移栽到温室中，采用实施例4方法分别对50个CSAB、CEAB和CAB载体的转基因大豆植株进行草甘膦和草铵膦的抗性测定，抗性效果如表12所示：
表12*：
Figure BDA0002789614450000152
*注：表12为对V2期大豆植株喷施不同浓度草甘膦进行抗性检测。喷施草甘膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:300稀释，2x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:150稀释，4x为农达-41％草甘膦(美国孟山都)按1:75稀释。
表13*：
Figure BDA0002789614450000153
Figure BDA0002789614450000161
*注：表13为对V2期大豆植株喷施不同浓度草铵膦进行抗性检测。喷施草铵膦10天后株高、叶片数目和生长势与喷施空白对照的植株没有显著差异的株系为抗性转化事件。1x为保试达-18％草铵膦(德国拜耳)按1:300稀释，2x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按1:150稀释，3x为保试达18％草铵膦(德国拜耳)按1:75稀释。
从表12和表13中可以看出，载体CSAB的大豆转化体对草甘膦和草铵膦的抗性水平显著高于CEAB和CAB载体的大豆转化体。由此可见转化载体CSAB在获得高抗草甘膦和草铵膦转基因大豆中显著优于CEAB或CAB载体。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种除草剂抗性基因表达载体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6238
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta 60
aactgaaggc gggaaacgac aatctgatcc aagctcaagc tgctctagca ttcgccattc 120
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 180
gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 240
cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag cttgcatgcc tacagtgcag cgtgacccgg 300
tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa gttataaaaa attaccacat 360
attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat ctttatacat atatttaaac 420
tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat atcagtgttt tagagaatca 480
tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag tattttgaca acaggactct 540
acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta 600
tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg tttagggtta atggttttta 660
tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta gcctctaaat taagaaaact 720
aaaactctat tttagttttt ttatttaata atttagatat aaaatagaat aaaataaagt 780
gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa actaaggaaa catttttctt 840
gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac gagtctaacg gacaccaacc 900
agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac ggcacggcat ctctgtcgct 960
gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga cttgctccgc tgtcggcatc 1020
cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg gcaggcggcc tcctcctcct 1080
ctcacggcac ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc 1140
gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg 1200
gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa 1260
ggtacgccgc tcgtcctccc cccccccccc tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt 1320
ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg 1380
ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga 1440
ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga tggctctagc cgttccgcag 1500
acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc 1560
tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt 1620
cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt 1680
tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat 1740
agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg 1800
cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt 1860
gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg 1920
gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt 1980
aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg 2040
catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta 2100
ttataataaa caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat 2160
atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg 2220
tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt tacttctgca ggtcgactct 2280
agaaacaatg gcggcgacca tggcgtccaa cgctgcggct gcggctgcgg tgtccctgga 2340
ccaggccgtg gctgcgtcgg cagcgttctc gtcgcggaag cagctgcggc tgcctgccgc 2400
agcgcgcgga gggatgcggg tgcgggtgcg ggcgcggggt cggcgggagg cggtggtggt 2460
ggcgtccgcg tcgtcgtcgt cggtggcagc gccggcggcg aaggctgaga tgctacacgg 2520
tgcaagcagc cggccggcaa ccgctcgcaa atcttccggc ctttcgggaa cggtcaggat 2580
tccgggcgat aagtccatat cccaccggtc gttcatgttc ggcggtcttg ccagcggtga 2640
gacgcgcatc acgggcctgc ttgaaggtga ggacgtgatc aataccggga aggccatgca 2700
ggctatggga gcgcgtatcc gcaaggaagg tgacacatgg atcattgacg gcgttgggaa 2760
tggcggtctg ctcgcccctg aggcccctct cgacttcggc aatgcggcga cgggctgcag 2820
gctcactatg ggactggtcg gggtgtacga cttcgatagc acgttcatcg gagacgcctc 2880
gctcacaaag cgcccaatgg gccgcgttct gaacccgttg cgcgagatgg gcgtacaggt 2940
caaatccgag gatggtgacc gtttgcccgt tacgctgcgc gggccgaaga cgcctacccc 3000
gattacctac cgcgtgccaa tggcatccgc ccaggtcaag tcagccgtgc tcctcgccgg 3060
actgaacact ccgggcatca ccacggtgat cgagcccatc atgaccaggg atcataccga 3120
aaagatgctt caggggtttg gcgccaacct gacggtcgag acggacgctg acggcgtcag 3180
gaccatccgc cttgagggca ggggtaaact gactggccaa gtcatcgatg ttccgggaga 3240
cccgtcgtcc acggccttcc cgttggttgc ggcgctgctc gtgccgggga gtgacgtgac 3300
catcctgaac gtcctcatga acccgaccag gaccggcctg atcctcacgc ttcaggagat 3360
gggagccgac atcgaggtga tcaacccgcg cctggcaggc ggtgaagacg ttgcggatct 3420
gcgcgtgcgc tcctctaccc tgaagggcgt gacggtcccg gaagatcgcg cgccgtccat 3480
gatagacgag tatcctattc tggccgtcgc cgctgcgttc gccgaagggg ccacggtcat 3540
gaacggtctt gaggaactcc gcgtgaagga atcggatcgc ctgtcggcgg tggccaatgg 3600
cctgaagctc aacggtgttg actgcgacga gggtgagacc tcactcgtgg tccgtggccg 3660
gcctgatggc aagggcctcg gcaacgccag tggagcggcc gtcgccacgc acctcgatca 3720
tcgcatcgcg atgtccttct tggtgatggg tctcgtctca gagaacccgg tgaccgtcga 3780
tgacgccacg atgatagcga cgagcttccc agagttcatg gatctgatgg cgggcctcgg 3840
ggccaagatc gaactgtctg acacgaaggc cgcttgactc gagtttctcc ataataatgt 3900
gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg ttcctatagg gtttcgctca tgtgttgagc 3960
atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct 4020
aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa tccagatccc ccgaattagg tacctggtgg 4080
agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg 4140
ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat cgggaaacct cctcggattc cattgcccag 4200
ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag aaaaggaagg tggcacctac aaatgccatc 4260
attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg 4320
gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc 4380
aagtggattg atgtgataac atggtggagc acgacactct cgtctactcc aagaatatca 4440
aagatacagt ctcagaagac caaagggcta ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg 4500
gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt catcaaaagg acagtagaaa 4560
aggaaggtgg cacctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg 4620
cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 4680
aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 4740
gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagaccttcc tctatataag gaagttcatt 4800
tcatttggag aggacacgct gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctcccggg 4860
accaccacca ccaccaccac ctcctccccc ctcgctgccg gacgacgagc tcctcccccc 4920
tccccctccg ccgccgccgg taaccacccc gcccctctcc tctttctttc tccgtttttt 4980
ttttcgtctc ggtctcgatc tttggccttg gtagtttggg tgggcgagag cggcttcgtc 5040
gcccagatcg gtgcgcggga ggggcgggat ctcgcggctg gcgtctccgg gcgtgagtcg 5100
gcccggatcc tcgcggggaa tggggctctc ggatgtagat ctgcgatccg ccgttgttgg 5160
gggagatgat ggggggttta aaatttccgc catgctaaac aagatcagga agaggggaaa 5220
agggcactat ggtttatatt tttatatatt tctgctgctt cgtcaggctt agatgtgcta 5280
gatctttctt tcttcttttt gtggtagaat ttgaatccct cagcattgtt catcggtagt 5340
ttttcttttc atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc 5400
atgggtagcc cagaacgacg cccggccgac atccgccgtg ccaccgaggc ggacatgccg 5460
gcggtctgca ccatcgtcaa ccactacatc gagacaagca cggtcaactt ccgtaccgag 5520
ccgcaggaac cgcaggagtg gacggacgac ctcgtccgtc tgcgggagcg ctatccctgg 5580
ctcgtcgccg aggtggacgg cgaggtcgcc ggcatcgcct acgcgggccc ctggaaggca 5640
cgcaacgcct acgactggac ggccgagtcg accgtgtacg tctccccccg ccaccagcgg 5700
acgggactgg gctccacgct ctacacccac ctgctgaagt ccctggaggc acagggcttc 5760
aagagcgtgg tcgctgtcat cgggctgccc aacgacccga gcgtgcgcat gcacgaggcg 5820
ctcggatatg ccccccgcgg catgctgcgg gcggccggct tcaagcacgg gaactggcat 5880
gacgtgggtt tctggcagct ggacttcagc ctgcctgtac cgccccgtcc ggtcctgccc 5940
gtcaccgaga tttgactcga gtttctccat aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg 6000
aattagggtt cctatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt 6060
atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag 6120
tactaaaatc cagatccccc gaattaattc ggcgttaatt cagtacatta aaaacgtccg 6180
caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata tcctgcca 6238
<210> 2
<211> 1586
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ggtaccaagg tggcacctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 60
atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 120
aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 180
taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgtaccgagg tcattcatat gcttgagaag 240
agagtcggga tagtccaaaa taaaacaaag gtaagattac ctggtcaaaa gtgaaaacat 300
cagttaaaag gtggtataaa gtaaaatatc ggtaataaaa ggtggcccaa agtgaaattt 360
actcttttct actattataa aaattgagga tgttttgtcg gtactttgat acgtcatttt 420
tgtatgaatt ggtttttaag tttattcgcg atttggaaat gcatatctgt atttgagtcg 480
gtttttaagt tcgttgcttt tgtaaataca gagggatttg tataagaaat atctttaaaa 540
aacccatatg ctaatttgac ataatttttg agaaaaatat atattcaggc gaattccaca 600
atgaacaata ataagattaa aatagcttgc ccccgttgca gcgatgggta ttttttctag 660
taaaataaaa gataaactta gactcaaaac atttacaaaa acaaccccta aagtcctaaa 720
gcccaaagtg ctatgcacga tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca 780
ccccagtgca gccaactggc aaatagtctc cacccccggc actatcaccg tgagttgtcc 840
gcaccaccgc acgtctcgca gccaaaaaaa aaaaaagaaa gaaaaaaaag aaaaagaaaa 900
acagcaggtg ggtccgggtc gtgggggccg gaaaagcgag gaggatcgcg agcagcgacg 960
aggcccggcc ctccctccgc ttccaaagaa acgcccccca tcgccactat atacataccc 1020
ccccctctcc tcccatcccc ccaaccctac caccaccacc accaccacct cctcccccct 1080
cgctgccgga cgacgagctc ctcccccctc cccctccgcc gccgccggta accaccccgc 1140
ccctctcctc tttctttctc cgtttttttt ttcgtctcgg tctcgatctt tggccttggt 1200
agtttgggtg ggcgagagcg gcttcgtcgc ccagatcggt gcgcgggagg ggcgggatct 1260
cgcggctggc gtctccgggc gtgagtcggc ccggatcctc gcggggaatg gggctctcgg 1320
atgtagatct gcgatccgcc gttgttgggg gagatgatgg ggggtttaaa atttccgcca 1380
tgctaaacaa gatcaggaag aggggaaaag ggcactatgg tttatatttt tatatatttc 1440
tgctgcttcg tcaggcttag atgtgctaga tctttctttc ttctttttgt ggtagaattt 1500
gaatccctca gcattgttca tcggtagttt ttcttttcat gatttgtgac aaatgcagcc 1560
tcgtgcggag cttttttgta ggtaga 1586

Claims (10)

1.一种除草剂抗性基因表达载体，其特征在于所述表达载体包含启动子、草甘膦抗性基因、草铵膦抗性基因和终止子；所述草甘膦抗性基因采用启动子pUbi，草铵膦抗性基因采用复合启动子；所述复合启动子由玉米Ubi启动子pUbi、花椰菜病毒的35S启动子和水稻Actin基因中内含子组成的复合启动子，记为复合启动子p35S-OsAct1 intron。
2.如权利要求1所述除草剂抗性基因表达载体，其特征在于所述复合启动子p35S-OsAct1 intron的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中4069bp-5393bp所示。
3.如权利要求1所述除草剂抗性基因表达载体，其特征在于所述草甘膦抗性基因5’端有信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中2288bp-2509bp。
4.如权利要求1所述除草剂抗性基因表达载体，其特征在于所述草甘膦抗性基因为cp4基因，核苷酸序列为SEQ ID NO：1中2510bp-3877bp所示。
5.如权利要求1所述除草剂抗性基因表达载体，其特征在于所述草铵膦抗性基因为bar基因，核苷酸序列为SEQ ID NO：1中5401bp-5955bp。
6.如权利要求1所述除草剂抗性基因表达载体，其特征在于所述cp4基因与bar基因的终止子核苷酸序列均为SEQ ID NO：1中3884bp-4068bp所示。
7.如权利要求1所述除草剂抗性基因表达载体，其特征在于所述除草剂抗性基因表达载体的骨架为载体pCAMBIA-1300。
8.如权利要求1所述除草剂抗性基因表达载体，其特征在于所述除草剂抗性基因表达载体按如下步骤构建：用XhoI和KpnI对pCambia1300进行双酶切，回收获得载体；用XhoI和NcoI酶切含有人工合成bar基因的质粒，获得bar片段；用NcoI和KpnI对含有人工合成的p35S-OsAct1 intron复合启动子的质粒，回收得到p35S-OsAct1 intron片段；然后，将上述酶切后的载体和bar片段、p35S-OsAct1 intron片段进行三段连接，获得过渡载体1300-p35S-OsAct1 intron-bar；用HindII和KpnI分别对含有人工合成pUBi-CP4-ter质粒和过渡载体1300-p35S-OsAct1 intron-bar进行双酶切后连接，获得除草剂抗性基因表达载体1300-p35S-OsAct1 intron-bar-pUBi-CP4。
9.一种权利要求1所述除草剂抗性基因表达载体在制备转基因抗除草剂农作物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述农作物包括玉米、水稻、大豆、小麦或油菜。
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