CN106434744B - 一种赤霉素生物合成酶在提早植物成熟中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种赤霉素生物合成酶在提早植物成熟中的应用，所述的应用是将赤霉素生物合成酶基因与表达元件连接构建表达框，然后将表达框导入植物中，促进植物灌浆,实现植物成熟的提早；本发明提供GA生物合成酶基因的一种新应用，通过在玉米中过表达GA生物合成酶基因，能有效缩短植物生长周期，提高作物的灌浆效率，提早植物成熟，成熟期至少提早1天，优选提早1‑30天。该技术能有效提高作物轮作效率，降低成本，提高整体生产率。
Description
(一)技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及一类植物启动子和利用这类启动子控制植物赤霉素(GA)新陈代谢酶基因，在植物中表达而获得成熟提早的转基因植物的方法。本发明可以运用在作物育种领域。
(二)背景技术
植物的生长周期即从种子发芽、发育成成熟植株、开花、再形成种子的整个过程。农作物的生长周期主要由品种和气候决定，而不同的品种适合种在不同气候的区域。比如，中国东北就适合种生长周期短的玉米品种。同时，在产量相当的情况下，作物的生长周期越短，同一块地里播种和收获的次数可以越多，回报也就越大。另外，作物的生长周期短，相应管理成本也会大幅降低。因此，理论上来说植物特别是农作物的生长周期越短越好。但是，植物的生物量几乎全部来源于光合作用，需要时间的积累，生长周期的缩短势必会导致产量的下降。事实上，短生长周期的作物要想获得长生长周期作物同样的产量，只能通过培育光合效率增强、营养物质向种子中的转化效率加快的品种，或者同时通过合理密植来实现。因此，培育高产、生长周期缩短的玉米品种非常重要。
赤霉素(GA)是一类广泛存在于高等植物和真菌中的二萜类羧酸，其影响着高等植物生长周期的各个阶段，包括种子萌发、茎干生长、花形成、花药发育以及种子和果皮生长等。同时，GA对植物的整体发育和对环境的适应都非常重要(Derkx et al.,(1994)PlantGrowth Regul 15,223-234；Hedden and Kamiya,(1997)Annu Rev Plant Phys 48,431-460；Xu et al.,(1997)Plant Physiol 114,1471-1476；Mauriat et al.,(2014)Plant J78,372-384)。
高等植物特别是水稻和拟南芥中的GA合成途径已经比较清楚。根据反应类型和酶的种类，可以把GA的生物合成途径大致分为3个阶段(图1)(Phillips,(1998)PlantPhysiol Bioch 36,115-124；Hedden and Proebsting,(1999)Plant Physiol 119,365-370)。这三个阶段分别为从牛儿焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate)到贝壳杉烯(ent-kaurene)；贝壳杉烯氧化为GA12醛(GA12-aldehyde)；GA12醛进一步氧化为不同的GA。具有生物活性的GAs通常为含有19-10内酯、C-7羧酸和3β-羟基的C19化合物。它们生物合成的后期阶段包括氧化去除C-20以及C-3上的羟基化。上述氧化过程需要两种关键酶的参与，即赤霉素20-氧化酶(GA20-Oxidase)和赤霉素3β-羟化酶(GA3-Oxidase)。其中，GA20-氧化酶以GA12/GA53为底物，连续氧化GAs的C-20位点，直至形成GA9/GA20；GA3-氧化酶则以GA9/GA20为底物，经过一步氧化，最终形成有生物活性的GAl/4(Kaneko et al.,(2003)Plant J 35,104-115；Yamauchi et al.,(2004)Plant Cell 16,367-378)。
水稻中分别有两个GA20-氧化酶基因和GA3-氧化酶基因，且都有不同的表达模式。其中，GA20ox-2基因表达的区域比较广泛，包括叶片、茎干、茎尖、幼穗等；而另一个GA20-氧化酶基因GA20ox-1，则具有非常特异的表达模式，主要在生殖器官(幼穗)中表达(Ashikariet al.,(2002)Breeding Sci 52,143-150；Sasaki et al.,(2002)Nature 416,701-702)。对粮食产量增长有巨大贡献的矮杆水稻品种就是因为植株中的GA20ox-2基因发生了缺失突变导致其营养器官缺少生长所必须的活性GAs，从而使得植株矮化。同时，由于水稻中的另一个GA20-氧化酶基因GA20ox-1正常，能给其生殖器官提供足够的活性GAs，才能保证在植株矮化、所有营养器官都变小的情况下，种子大小不变，不影响产量。类似的，水稻中的GA3ox-1基因特异的在生殖器官中表达；而GA3ox-2基因则主要在营养器官中表达(Itoh etal.,(2001)P Natl Acad Sci USA 98,8909-8914)。
目前，除了通过筛选GA生物合成或信号通路基因突变的矮化作物品种用于提高产量之外，还有很多研究试图通过调控GA的生物合成来优化作物性状，提高产量等。例如，Maria Eriksson等用CaMV的35S启动子介导拟南芥的GA20-氧化酶基因AtGA20ox1在欧美杂种山杨(Populus tremula L.x P tremuloides Michx.)中过表达后，和对照相比，转基因植株生长速率加快、生物量增加、木质纤维变长(Eriksson M,Moritz T,Israelsson M,etal.(2010).U.S.Patent No.7,807,878.Washington,DC:U.S.Patent and TrademarkOffice.)。Andrew Leonard Phillips等通过用在种子中特异表达的启动子介导拟南芥的GA20-氧化酶基因AtGA20ox1在面包小麦(Trilicum aeslivum cv Cadenza)中过表达后，转基因小麦种子和对照相比，体积和重量都显著增加(Phillips A L,Hedden P,Lenton J R,et al.(2011).U.S.Patent No.7,985,888.Washington,DC:U.S.Patent and TrademarkOffice.)。另外，还有报道表明，在玉米中过表达GA20-氧化酶基因，使得玉米植株变高，叶片变宽(http://www.seedquest.com/news.php？type＝news&id_article＝32301.2012.VIB corn field trial in Wetteren,Belgium-Genetically modified cornalso larger in the field)。
上述通过调控GA生物合成途径的关键酶的方法很可能会改良作物，提高作物产量。但是，目前还没有任何有关通过特异性的调控GA生物合成途径的关键酶来缩短植物生长周期，提早植物成熟的相关报道或专利。本发明利用能够在花(Flower)器官中特异表达的启动子控制GA生物合成酶基因在转基因植物中表达，促进植物提早成熟。
(三)发明内容
本发明提供一种赤霉素合成酶在提早植物成熟中的应用，促进植物提早成熟，有效提高作物轮作效率，降低成本，提高整体生产率。
本发明采用的技术方案是：
一种赤霉素合成酶在提早植物成熟中的应用，所述的应用是将赤霉素生物合成酶基因与表达元件连接构建表达框，然后将表达框导入植物中，促进植物灌浆,实现植物成熟的提早；所述表达元件包括启动子、增强子和终止子；具体优选方法为：将赤霉素(GA)生物合成酶基因、启动子和增强子进行功能性连接，获得一个能够在植物中表达的GA生物合成酶基因表达框，然后通过植物转化的方法将GA生物合成酶基因表达框导入植物的基因组中使之表达，从而实现植物成熟的提早，获得成熟期提早了的改良转基因植物。改良的转基因植物是指与非转基因的亲本植物相比，至少提早1天成熟，优选提早1-30天。
本发明提供的GA生物合成酶基因可以是来自任何植物，优选自禾本科植物(单子叶植物或双子叶植物)，比如来自玉米、水稻、高粱、小麦、大麦、高粱、黑麦、小米、大豆、油菜或向日葵，特别优选来自水稻、玉米或大豆。一般可以预见这些来自不同植物的同源蛋白具有相同或者相似的功能，因此同样可以利用这些基因改良植物的农艺性状。进一步，即使不能预见这些蛋白的功能，本领域的一般技术人员可以根据本发明提供的方法和现有技术测定它们是否具有促进植物提早成熟的功能。本发明所述的GA生物合成酶为赤霉素(GA)20-氧化酶(GA20ox)或赤霉素3β-羟化酶(GA3ox)，优选GA20-氧化酶。本发明最优选GA生物合成酶基因为下列来源之一的基因或下列任一序列的同源序列(核苷酸同源性达85％以上)，编码的GA生物合成酶为下列氨基酸序列之一或具有下列任一序列70％以上同源性的序列：玉米(Zea maize)的ZmGA20ox-1(氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示)和ZmGA20ox-2(氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示)；水稻(Oryza sativa)的OsGA20ox-1(氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示，核苷酸序列为SEQ IDNO:12所示)、OsGA20ox-2(氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示)、OsGA3ox-1(氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:14所示)和OsGA3ox-2(氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:15所示)；大豆(Glymax)的GmGA20ox-2(氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示)。
编码本发明GA生物合成酶基因的多核苷酸序列可以有多种不同的变异，多核苷酸序列的变异包括但不限于：1)由于编码同一个氨基酸的密码子不同而获得不同的多核苷酸序列，这些序列编码具有相同活性的蛋白质多肽；2)来源于生物的遗传多态性(GeneticPolymorphism)，即同一种植物的不同个体或者群体之间的多样性；3)通过人工操作导入多核苷酸序列的变异。人工导入的这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的定向变异。本领域的一般技术人员就能通过分子生物学的方法产生点突变，插入或者缺失变异等。通过人工操作导入多核苷酸序列的变异也包括通过Gene Shuffling等方法获得仍然具有正常功能的杂合基因。例如U.S.Pat.No.2002/0058249；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature,370:389-391；Crameriet al.(1997)Nature Biotech.,15:436-438；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.,272:336-347；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4504-4509；Crameri et al.(1998)Nature,391:288-291；and U.S.Pat.NOs.5,605,793and 5,837,458。
本发明所述GA生物合成酶基因的多核苷酸序列，本领域的一般技术人员通常可以利用PCR方法、DNA杂交方法等从一种植物中克隆到相应的同源基因。根据本发明提供的多核苷酸序列设计引物，可以通过PCR方法获得同源基因的部分或者全部序列。而一旦获得该基因的部分序列，就可以通过不同的方法克隆得到全长基因。另一方面，利用本发明提供的多核苷酸制备探针，可以通过DNA杂交方法从一种植物的DNA文库中克隆获得其同源基因。
本发明所述GA生物合成酶基因编码的多肽可以用于调控植物的成熟时间，优选的GA生物合成酶基因编码的多肽为下列之一或具有75％以上同源性的氨基酸：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，最优选GA生物合成酶基因编码的多肽为下列之一：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5。本发明所述GA生物合成酶提早植物成熟的应用方法包括提高玉米中GA生物合成酶基因的表达或活性，具体方法包括：1)构建包含本发明提供的多核苷酸序列的GA生物合成酶基因表达框；表达框可以通过一个或者几个控制表达的多核苷酸序列(即表达元件，包括启动子、增强子和终止子)与GA生物合成酶基因功能性连接而获得；本发明特别提供了利用GA生物合成酶基因本身的表达框，即包含这些基因本身的启动子和终止子的整个DNA片段，如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11；2)将表达框导入到植物中，并获得表达，获得GA生物合成酶基因过表达植株；特别是通过利用基因表达调控序列(启动子和增强子的选择)，使导入的基因在时间和空间上的表达特点与其内生基因相同或者类似，以减少非组织特异性过量表达GA生物合成酶基因可能对植物产生的不利影响。
本发明提供的多核苷酸(GA生物合成酶基因)可以被克隆到质粒载体中，在细胞中获得大量复制。利用这种DNA重组技术，本发明获得的多核苷酸可以和控制基因表达的启动子和终止子功能性地连接而构成表达框。所谓功能性地连接指启动子和终止子能够发挥控制与它连接的多核苷酸的表达。通常启动子连接在5’端，终止子连接在3’端。
控制基因表达的启动子是本领域的技术人员都已经知道的技术。Potenza等的综述详细介绍和总结了有关启动子的研究(Potenza et al(2004)In Vitro Cell Dev Biol-Plant,40:1-22)。启动子包括组成型表达的启动子、组织特异表达的启动子、可以诱导表达的启动子等。
本发明特别提供了在植物幼穗中特异性表达的启动子。提供的启动子来源于水稻GA20ox-1基因、水稻GA3ox-1基因、水稻ARGOS基因、玉米TE1基因(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069)或其同源基因的启动子。启动子的区域可以通过试验得到确定。一般启动子可以是编码蛋白质的阅读框5’端外面至少0.25kb、0.5kb、1.0kb、2.0kb或3.0kb的DNA片段。CYP78A1或其同源基因以及ZmTE1或其同源基因的天然启动子除了可以用来控制其本身基因的表达以外，也可以与其他植物的同源基因功能性地连接，在其他植物中控制这些基因的表达，以获得改良的转基因植物。例如水稻OsGA20ox-1的启动子可以用来控制玉米ZmGA20ox-1基因在玉米中的表达。
控制本发明提供的基因表达的启动子还可以是其它组织特异的启动子，例如STM特异启动子(U.S.Pat.No.5880330)、ARSK1根特异表达启动子(United States PatentApplication 20040067506)、AP1花分生组织启动子(Sasaki,Katsutomo,et al.(2011)Plant biotechnology,28:181-188)。这些启动子也可以导致GA生物合成关键酶基因在一些组织中特异性表达，从而促进这些器官的成熟提早。
控制本发明提供的基因的启动子还可以是组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒的CaMV 35S启动子(Terada and Shimamoto,(1990)Molecular&General Genetics,220:389-392)，水稻的actin 1启动子(Mcelroy et al.,(1990)The Plant Cell,2:163-171)。这些启动子可以导致GA生物合成关键酶基因在植物的大部分组织中特异性表达，从而促进这些组织的成熟提早。
本发明优选所述启动子核苷酸序列为下列之一：SEQ ID No:17、SEQ ID No:18、SEQ ID No:19、SEQ ID No:20、SEQ ID No:21、SEQ ID No:22或SEQ ID No:23。
控制基因表达的终止子可以是提供基因的天然终止子，也可以是同种植物的其他基因或者其他植物基因的终止子。常用的终止子包括来源于农杆菌的Octopine合成酶终止子和nopaline合成酶终止子等。参考文献包括：Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.,262:141-144；Proudfoot(1991)Cell,64:671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.,5:141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell,2:1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene,91:151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.,17:7891-7903；and Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.,15:9627-9639。
为了提高基因在目标植物中的表达水平，基因的多核苷酸序列可以进一步修饰和改变。这些改变包括删除内含子、清除一些可能影响基因正常表达的序列，如隐藏的非成熟的PolyA信号序列等。根据目标植物的密码子使用情况，编码相同蛋白质多肽的多核苷酸序列可以优化，以提高其在目标植物中的表达量。
本发明同时还提供了增强基因在目标植物中表达的调控序列，如CaMV的35S增强子。将增强子连接在基因表达框的上游或者下游20kb以内的位置，以提高基因的表达水平。利用本发明提供的基因，找到这个基因在基因组中的位置，然后通过DNA定点插入技术，将基因表达的调控序列，如CaMV的35S增强子，插入到可以增强本发明基因表达的位点上。一个增强子往往能够影响附近基因的表达，有的增强子可以提高相距20kb或更远的基因的表达。目前植物的DNA定点插入技术已经很成熟(Townsend,Jeffrey A.,et al.(2009)Nature,459:442-445；Jiang,W.,et al.(2013).Nat.Biotechnol.,31:233–239；Cong,L.etal.(2013)Science,339:819–823)。因此，利用定点插入的方法，将增强子插入到GA生物合成酶基因附近就可能提高这个基因的表达。
本发明用于构建基因表达框的载体也可以同时包含一个选择标记基因表达框。这个选择标记基因可以用来选择转化了的细胞，常用的基因包括抗生素抗性基因，如neomycin phosphotransferase II(NEO)和hygromycin phosphotransferase(HPT)、抗除草剂基因，如抗草甘膦基因EPSPS等。其他选择标记基因同样可以用作本发明转化的选择基因。
本发明提供的GA生物合成酶基因通过导入植物从而获得转基因的高产植物，提早植物成熟期。这些植物包括但不限于玉米、小麦、大麦、高粱、水稻、甘蔗、大豆、胡萝卜、马铃薯、棉花、向日葵、油菜、橡树、草坪草、牧草。
由于同一个家族中的基因在不同植物中往往具有类似的功能，因此可以在一个物种中过量表达另一个物种的GA生物合成酶基因来实现本发明所述的提早植物成熟的目的，也属于本发明提供的内容。比如，在玉米中过表达水稻的GA生物合成酶基因。
目前本领域的一般技术人员能够利用现有技术将本发明所述的GA生物合成酶多核苷酸导入到植物中进行表达。比较常用的方法是基因枪方法(Klein et al,1987,Nature(London),327:70-73；U.S.Pat.No.4,945,050))或农杆菌介导方法((De Blaere et al,1987,Meth.Enzymol.,143:277)。但是本发明不限于这些方法。
不同植物的转化方法和步骤有所不同。通常使用较广的方法是通过农杆菌或基因枪导入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体。然后用相应的筛选培养基进行筛选培养。再进行分化而获得转化芽，通过生根培养基培养就可以获得可以种植的转基因苗。进一步，抗除草剂转基因植物可以通过喷施除草剂筛选，例如喷施烟嘧磺隆可以杀灭非转基因的水稻。本发明涉及的植物包括但不限于水稻、玉米、高粱、甘蔗、棉花、小麦、大豆、油菜、草坪草或牧草。
本发明获得的GA生物合成酶基因过表达植株鉴定的方法包括：观察植株表型、喷洒除草剂、分子物学方法等，当然，在实际应用中可以多种方法一起使用。由于本发明提供的GA生物合成酶基因过表达植株和对照植株有比较明显的表型差异，可以通过肉眼辨别。GA生物合成酶基因过表达的玉米植株表现为和非转基因对照植株相比至少提前成熟1天。如果标记基因和目的基因紧密连锁，可以用喷洒除草剂的方法来鉴定目的基因。例如，GA生物合成酶基因构建在以抗草甘膦基因(EPSPS)为筛选标记的载体上，抗草甘膦的植株很可能就是GA生物合成酶基因过表达的植株。鉴定GA生物合成酶基因过表达植株还可以用分子生物学方法，这些方法主要包括Southern杂交法和PCR等技术，检测目标基因的DNA；荧光定量PCR或者定量PCR等技术，在mRNA的水平检测目标基因的表达；Western杂交法和酶联免疫吸附实验(ELISA)等技术，在蛋白水平检测目标基因的表达。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供GA生物合成酶基因的一种新应用，通过在玉米中过表达GA生物合成酶基因，能有效缩短植物生长周期，提高作物的灌浆效率，提早植物成熟，成熟期至少提早1天，优选提早1-30天。该技术能有效提高作物轮作效率，降低成本，提高整体生产率。
(四)附图说明：
图1：本发明中涉及到的水稻中GA生物合成酶基因的功能关系图例(Kaneko,etal.,(2003)Plant J 35,104-115)。
图2：玉米GA生物合成酶基因ZmGA20ox1过表达载体pCambia1300-ZmGA20ox1(geno)-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA结构示意图。
图3：玉米GA生物合成酶基因cDNA过表达载体pCambia1300-pZmTE1-ZmGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmTE1-ZmGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA结构示意图。
图4：水稻GA生物合成酶基因OsGA20ox1过表达载体pCambia1300-OsGA20ox1(geno)-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA结构示意图。
图5：水稻GA生物合成酶基因cDNA过表达载体pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300–pOsGA3ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsTE1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsARGOS-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA结构示意图。
图6：大豆GA生物合成酶基因GmGA20ox2cDNA过表达载体pCambia1300-p35S-pGmTE1-
GmGA20ox2的T-DNA结构示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology，和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Labortory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。
实施例1玉米GA生物合成酶基因ZmGA20ox1过表达载体的构建
ZmGA20ox1基因表达框基因组序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示)的获得：设计PCR引物ZmGA20OX1-geno-F:CCCAAGCTTCTGCCATGACGTGATTGTCCCTGG和ZmGA20OX1-geno-R:CCCAAGCTTCGCCACCGTCACGTGTCCAAGAT，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得推测的包括ZmGA20ox1基因启动子、表达序列和终止子序列的大小为3.8kb的基因组片段。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃4分钟，重复33个循环；然后72℃10分钟。
农杆菌T-DNA载体的构建：双元载体pCambia1300-p35S-G10载体(InternationlPat.No.PCT/CN2012/087069:SEQ ID NO.47)包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)(作为转化的标记基因)，p35S启动子(作为目标基因的增强子)和HindIII位点(作为目的基因的克隆位点)。pCambia1300-p35S-G10经过HindIII酶切以后，去磷酸化，作为克隆的载体与经过同样酶切的ZmGA20ox1基因表达框基因组片段连接。获得的T-DNA结构为：“启动子-ZmGA20ox1基因-终止子-增强子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-ZmGA20ox1(geno)-p35S-pZmUbi-1174(图2)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例2玉米GA生物合成酶基因cDNA过表达载体的构建
1、cDNA的克隆
玉米GA生物合成酶基因ZmGA20ox1cDNA的获得：设计PCR引物ZmGA20ox1-F(5’GGGATCCAACAATGGTGCTGGCTGCGCACGA)和ZmGA20ox1(5’TGGGCCCTTACTACTTCTTCTCCAGCAGGTGCTGTCCGC)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得ZmGA20ox1的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃80秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.3Kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物ZmGA20ox1-MF(5’GGGCGAGGGATACCGGCACCACGGGGAGGT)和ZmGA20ox1-MR(5’GGTGCCGGTATCCCTCGCCCAGCTTGTCCAC)进行点突变，去除启动子内部KpnI位点。最后，通过BamHI和ApaI双酶切得到相应的cDNA，并且DNA序列测定表明cDNA的核苷酸序列正确(SEQID NO：9)。然后以pCambia1300为过渡载体，用BamHI和ApaI双酶切获得测序正确的ZmGA20ox1cDNA片段，用ApaI和KpnI双酶切获得人工合成的终止子片段(SEQ ID NO：24)，然后再把上述两个片段和用BamHI和KpnI双酶切后的pCambia1300载体连接，获得的包含ZmGA20ox1cDNA和人工合成终止子的过渡载体，命名为pCambia1300-ZmGA20ox1-ter。保菌，用于构建转化植物的终载体。
GA生物合成酶基因ZmGA20ox2 cDNA的获得：设计PCR引物ZmGA20ox2-F(5’GGGATCCAACAATGGTGTCGCAGGAACGACAAG)和ZmGA20ox2(5’GGAGCTCTTACTAGGTGCAGGGAGGCGCCGC)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得ZmGA20ox2的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃70秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.1Kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过BamHI和SacI双酶切得到相应的cDNA，并且DNA序列测定表明cDNA的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：10)。然后以pCambia1300为过渡载体，用BamHI和SacI双酶切获得测序正确的ZmGA20ox2cDNA片段，用SacI和KpnI双酶切获得人工合成的终止子片段，然后再把上述两个片段和用BamHI和KpnI双酶切后的pCambia1300载体连接，获得的包含ZmGA20ox2cDNA和人工合成终止子(SEQ IDNO：24)的过渡载体，命名为pCambia1300-ZmGA20ox2-ter。保菌，用于构建转化植物的终载体。
1、启动子的克隆
玉米赤霉素合成酶基因ZmGA20ox1启动子(pZmGA20ox1)的获得：设计PCR引物pZmGA20ox1-F(5’TAAGCTTCTGCCATGACGTGATTGTCCCTGGC)和pZmGA20ox 1-R(5’GGGATCCAGGAGGGAGGAAGCAGAGGAGGAG)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得pZmGA20ox1。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子pZmGA20ox1，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：17)。
玉米(Zea mays)Mei2-like基因启动子(pZmTE1)的获得：设计PCR引物pZmTE1-F(5’AAGCTTGCGGTTGCCCAGGGCATGTGTCTA)和pZmTE1-R(5’GGATCCCCCCCACCCTCCATGGCTAGAG)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得pZmTE1。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物pZmTE1-MF(5’TTGCAGAGGATGCGAGCTAAAACAATCCAGCACA)和pZmTE1-MR(5’TGTTTTAGCTCGCATCCTCTGCAACGACAGCAC)进行点突变，去除启动子内部BamHI位点。最后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子pZmTE1，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：18)。
2、农杆菌T-DNA载体的构建
双元载体pCambia1300-p35S-G10经过HindIII和KpnI双酶切，作为克隆的载体与经过HindIII和BamHI双酶切获得的启动子和BamHI和KpnI双酶切获得的基因-终止子片段进行3段连接。获得的4个载体中的T-DNA结构为：“启动子-ZmGA20ox1基因/ZmGA20ox2cDNA-终止子-增强子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”(图3)。这些载体命名为：pCambia1300-pZmTE1-ZmGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmTE1-ZmGA20ox 2-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox 2-p35S-pZmUbi-1174。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例3、玉米的转化
玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:Vladimir Sidorov&David Duncan(in M.Paul Scott(ed.),Methods in MolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei&Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediatedtransformation of maize.Nature Protocols 2:1614-1622。基本方法如下：
取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将含有T-DNA载体(pCambia1300-ZmGA20ox1(geno)-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmTE1-ZmGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmTE1-ZmGA20ox 2-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174)的农杆菌与未成熟胚在共培养培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+5mg/L AgNO3+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L kinetin+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。分别获得含转化载体(pCambia1300-p35S-ZmGA20ox1(geno)；pCambia1300-p35S-pZmTE1-ZmGA20ox1；pCambia1300-pZmTE1-ZmGA20ox2；pCambia1300-p35S-pZmGA20ox1-ZmGA20ox1；pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox 2)和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株。
实施例4、转基因玉米的鉴定
将实施例3获得的转基因玉米植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因玉米植株和空载体对照植株的成熟时间进行比较分析。我们获得的72个转pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174载体的转基因植株(命名为eZmGA20ox1)中有55个植株的成熟明显提早。其中两个典型品系成熟时间如下如表1。
表1：两个典型品系成熟时间
| 品系 | 生长周期(天) |
| CK | 103±2 |
| eZmGA20ox1-23 | 98±2 |
| eZmGA20ox1-66 | 95±2 |
*CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株；eZmGA20ox1为载体pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中eZmGA20ox后面的编号(23，66)是对不同品系随机编号，以便于区分不同的转化事件。
pCambia1300-ZmGA20ox1(geno)-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmTE1-ZmGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmTE1-ZmGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174；pCambia1300-pZmGA20ox1-ZmGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174载体转基因玉米植株的表型变化和eZmGA20ox1类似，80％以上的转基因植株和空载体对照植株相比提前成熟。
实施例5水稻GA生物合成酶基因OsGA20ox1过表达载体的构建
OsGA20ox1基因表达框基因组序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示)的获得：设计PCR引物OsGA20OX1-geno-F:CCCAAGCTTAGAGTAGGAAGGGTAGAAAGAAAA ATAAGA和OsGA20OX1-geno-R:GGGAAGCTTAGCCAGCCATTTTCTTTTGAGAAGTA，以商业水稻品种秀水-134基因组为模板，通过PCR扩增获得推测的包括OsGA20ox1基因启动子、表达序列和终止子序列的大小为3.9kb的基因组片段。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃4分钟，重复33个循环；然后72℃10分钟。
农杆菌T-DNA载体的构建：双元载体pCambia1300-p35S-G10经过HindIII酶切以后，去磷酸化，作为克隆的载体与经过同样酶切的OsGA20ox1基因表达框基因组片段连接。获得的T-DNA结构为：“启动子-OsGA20ox基因-终止子-增强子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。这个载体命名为：pCambia1300-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174(geno)(图4)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例6水稻GA生物合成酶基因cDNA过表达载体的构建
1、cDNA的克隆
水稻GA生物合成酶基因OsGA20ox1的克隆：设计PCR引物OsGA20ox1-F(5’AGGATCCAACAATGAGCATGGTGGTGCAGCAGGAG)和OsGA20ox1-R(5’GGCGGAGCTCTCACTAGGAGTATATTGTTGGTTGCAGGT)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsGA20ox1的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃70秒，重复33个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.1kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物OsGA20ox1-MF(5’CCAACGCCAGATACCGCAGCTGCCTGCACC)和OsGA20ox1-MR(5’AGCTGCGGTATCTGGCGTTGGAGAGCGCCA)进行点突变，去除启动子内部KpnI位点。最后，通过BamHI和SacI双酶切得到相应的cDNA，并且DNA序列测定表明cDNA的核苷酸序列正确(SEQID NO：12)。然后以pCambia1300为过渡载体，用BamHI和SacI双酶切获得测序正确的OsGA20ox1cDNA片段，用SacI和KpnI双酶切获得人工合成的终止子片段，然后再把上述两个片段和用BamHI和KpnI双酶切后的pCambia1300载体连接，获得的包含OsGA20ox1cDNA和人工合成终止子(SEQ ID NO：24)的过渡载体，命名为pCambia1300-OsGA20ox1-ter。保菌，用于构建转化植物的终载体。
水稻GA生物合成酶基因OsGA20ox2的克隆：设计PCR引物OsGA20ox2-F(5’GGATCCAACAATGGTGGCCGAGCACCCCAC)和OsGA20ox2-R(5’GAGCTCTTATCAGCTGGCCGCCTCGACCTGCG)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsGA20ox2的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃80秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。最后，通过BamHI和SacI双酶切得到相应的cDNA，并且DNA序列测定表明cDNA的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：13)。然后以pCambia1300为过渡载体，用BamHI和SacI双酶切获得测序正确的OsGA20ox2cDNA片段，用SacI和KpnI双酶切获得人工合成的终止子片段，然后再把上述两个片段和用BamHI和KpnI双酶切后的pCambia1300载体连接，获得的包含OsGA20ox2cDNA和人工合成终止子(SEQ IDNO：24)的过渡载体，命名为pCambia1300-OsGA20ox2-ter。保菌，用于构建转化植物的终载体。
水稻GA生物合成酶基因OsGA3ox1的克隆：设计PCR引物OsGA3ox1-F(5’GGATCCAACAATGACATCGTCGTCGACCTCGC)和OsGA3ox1-R(5’TGGGCCCTTACTAACTCTCCTTGTCCTCTTCCTTCGC)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsGA3ox1的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃70秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.1kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物OsGA3ox1-MF(5’ACCTCCTCCGCTACCCGAAGCAGATGTGGGC)和OsGA3ox1-MR(5’CTTCGGGTAGCGGAGGAGGTACGGCGGCAC)进行点突变，去除启动子内部KpnI位点。最后，通过BamHI和ApaI双酶切得到相应的cDNA，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQID NO：14)。然后以pCambia1300为过渡载体，用BamHI和ApaI双酶切获得测序正确的OsGA3ox1cDNA片段，用ApaI和KpnI双酶切获得人工合成的终止子片段(SEQ ID NO：24)，然后再把上述两个片段和用BamHI和KpnI双酶切后的pCambia1300载体连接，获得的包含OsGA3ox1 cDNA和人工合成终止子(SEQ ID NO：24)的过渡载体，命名为pCambia1300-OsGA3ox1-ter。保菌，用于构建转化植物的终载体。
水稻GA生物合成酶基因OsGA3ox2的克隆：设计PCR引物OsGA3ox2-F(5’GGATCCAACAATGCCGACGCCGTCGCACTTG)和OsGA3ox2-R(5’GGAGCTCTCATTATGCGTGGACGTCGGCGGC)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsGA3ox2的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃70秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.1kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物OsGA3ox2-F1(5’GCTCCGAGCTACGCCGCCTCTGGCCCAAGTC)和OsGA3ox2-R1(5’GAGGCGGCGTAGCTCGGAGCGGAGGGAGGA)，OsGA3ox2-F2(5’TCAACTGGTATCCGAGGTGCCCGGAGCCGCG)和OsGA3ox2-R2(5’GGGCACCTCGGATACCAGTTGAGGTGCACCGTC)，进行点突变，去除启动子内部SacI和KpnI位点。最后，通过BamHI和SacI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：15)。然后以pCambia1300为过渡载体，用BamHI和SacI双酶切获得测序正确的OsGA3ox2cDNA片段，用SacI和KpnI双酶切获得人工合成的终止子片段，然后再把上述两个片段和用BamHI和KpnI双酶切后的pCambia1300载体连接，获得的包含OsGA3ox2cDNA和人工合成终止子(SEQ IDNO：24)的过渡载体，命名为pCambia1300-OsGA3ox2-ter。保菌，用于构建转化植物的终载体。
2、启动子的克隆
水稻GA生物合成酶基因OsGA20ox1启动子(pOsGA20ox1)的克隆：设计PCR引物pOsGA20ox1-F(5’CAAGCTTCTCTCTTCTATGCCACCAGTTC)和pOsGA20ox1-R(5’TGGATCCTGTTGATAATCTAGCTATCAATCAATTA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsGA20ox1的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子pOsGA20ox1，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：19)。
水稻GA生物合成酶基因OsGA3ox1启动子(pOsGA3ox1)的克隆：设计PCR引物pOsGA3ox1-F(5’CAAGCTTAATTTGCCACAAAGTATGAAATTCGTCC)和pOsGA3ox1-R(5’GGGATCCAACTCGTTGGCTAACGCACA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsGA20ox1的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物pOsGA3ox1-MF(5’GAACAAAGCATGATCCGATCCTATCCATTTCTGA)和pOsGA3ox1-MR(5’GGATCGGATCATGCTTTG TTCTAATTTAGTTCATTG)进行点突变，去除启动子内部HindIII位点。最后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子pOsGA3ox1，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：20)。
水稻ARGOS基因OsARGOS启动子(pOsARGOS)的克隆：设计PCR引物pOsARGOS-F(5’CAAGCTTCGGCAGCAACGGACTGAGAG)和pOsARGOS–R(5’TGGATCCAGCGAGCTTGAGCTAGCTTAGCTC)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsARGOS的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物pOsARGOS-MF(5’CTATGCGTAAGCTATACGTAGGACAGGTCACATTAT)和pOsARGOS-MR(5’GTGACCTGTCCTACGTATAGCTTACGCATAGATAGATAG)进行点突变，去除启动子内部HindIII位点。最后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：21)。
水稻(Oryza sativa)Mei2-like基因启动(pOsTE1)子的克隆：设计PCR引物pOsTE1-F(5’AAGCTTGAAACTAGTACTAGACATTACTCTTCCAATGCA)和pOsTE1-R(5’AGAGGATCCTGCAGCAGCACTTACCTACCCTACCA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得pOsTE1。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用引物OsTE-PRO-DELF(5’AGATCCGAGCAAA AAACAGGGCC)和OsTE-PRO-DELR(5’TCTATAGCGATAGAACTGTTTGATCTGGGT AGC)进行点突变，去除启动子内部BamHI位点。最后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：22)。
3、农杆菌T-DNA载体的构建
双元载体pCambia1300-p35S-G10经过HindIII和KpnI双酶切，作为克隆的载体与经过HindIII和BamHI双酶切或得的启动子和BamHI和KpnI双酶切获得的基因-终止子片段进行3段连接。获得的4个载体中的T-DNA结构为：“启动子-OsGA20ox1/OsGA20ox2/OsGA3ox1/OsGA3ox2 cDNA-终止子-增强子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”(图5)。这些载体命名为：pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300–pOsGA3ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsTE1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsARGOS-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例7、水稻的转化
转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取含如下载体的农杆菌划板：pCambia1300-OsGA20ox1(geno)-p35S-pZmUbi-117、pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300–pOsGA3ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsTE1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsARGOS-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174。挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6左右的农杆菌菌液中(农杆菌菌液的制备：将农杆菌接种至培养基，培养至OD为0.6左右；培养基组成：3g/L K2HPO4、1g/LNaH2PO4、1g/L NH4Cl、0.3g/L MgSO4·7H2O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl2、0.0025g/LFeSO4·7H2O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+1mg/L NAA+5mg/L 6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。分别获得含转化载体pCambia1300-OsGA20ox1(geno)-p35S-pZmUbi-117、pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300–pOsGA3ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsTE1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsARGOS-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株。
实施例8、转基因水稻的鉴定
将实施例7制备的转基因水稻植株的T0代植株移栽到温室中，对转基因水稻植株和空载体对照植株的成熟时间进行比较分析。我们获得的109个转pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174载体的转基因植株(命名为eOsGA20ox1)中有88个植株的成熟明显提早，其中两个典型品系成熟时间如下如表2。
表2：两个典型品系成熟时间
| 品系 | 生长周期(天) |
| CK | 152±2 |
| eOsGA20ox1-35 | 146±2 |
| eOsGA20ox1-69 | 148±2 |
*CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株；eZmGA20ox1为载体pCambia1300-p35S-pOsGA20ox1-OsGA20ox1的T-DNA转化植株，其中eOsGA20ox1后面的编号(42，69)是对不同品系随机编号，以便于区分不同的转化事件。
pCambia1300-OsGA20ox1(geno)-p35S-pZmUbi-117、pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA20ox1-OsGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300–pOsGA3ox1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsGA3ox1-OsGA3ox2-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsTE1-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174、pCambia1300-pOsARGOS-OsGA20ox1-p35S-pZmUbi-1174。载体转基因玉米植株的表型变化和eOsGA20ox1类似，79％以上的转基因植株和空载体对照植株相比提前成熟。
实施例9大豆GA生物合成酶基因cDNA过表达载体的构建
1、cDNA的克隆
大豆GA生物合成酶基因GmGA20ox2的克隆：设计PCR引物GmGA20ox2-F(5’GGATCCAACAATGGCAATAGACTGCATAACAAG)和GmGA20ox2(5’GAGCTCTTATCAGTTACTTTTCCGTTGCAGCCAG)，以商业大豆品种天隆1号基因组为模板，通过PCR扩增获得GmGA20ox1的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃70秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.1kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过BamHI和SacI双酶切得到相应的cDNA，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：16)。然后以pCambia1300为过渡载体，用BamHI和SacI双酶切获得测序正确的GmGA20ox2cDNA片段，用SacI和KpnI双酶切获得人工合成的终止子片段(SEQ ID NO：24)，然后再把上述两个片段和用BamHI和KpnI双酶切后的pCambia1300载体连接，获得的包含GmGA20ox2cDNA和人工合成终止子的过渡载体，命名为pCambia1300-GmGA20ox2-ter。保菌，用于构建转化植物的终载体。
2、启动子的克隆
大豆(Giycine max)Mei2-like基因启动子(pGmTE1)的克隆：设计PCR引物pGmTE1-F(5’AGGAAGCTTGAAAGAACGTAGTCCCTTCTTAAAAATGGTg)和pGmTE1-R(5’AGGGGATCCTCAAATCTCACTCACTCGCCTCTTTTCCTCA)，以商业大豆品种天隆1号基因组为模板，通过PCR扩增获得pGmTE1。PCR反应条件为：：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2.5分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2.5kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。通过HindIII和BamHI酶切以后，获得一个2.5kb的启动子。启动子的DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：23)。
3、农杆菌T-DNA载体的构建
双元载体pCambia1300-p35S-G10经过HindIII和KpnI双酶切，作为克隆的载体与经过HindIII和BamHI双酶切或得的启动子和BamHI和KpnI双酶切获得的基因-终止子片段进行3段连接。获得的载体中的T-DNA结构为：“启动子-GmGA20ox2cDNA-终止子-增强子-启动子-耐草甘膦基因-终止子”。载体命名为：pCambia1300-pGmTE1-GmGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174(图6)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
实施例10、大豆的转化
大豆的遗传转化技术目前比较成熟。例如Kan Wang(2006)Agrobacteriumtransformation Protocals Second Edition Volume 1Humana Press就有详细的说明。马丽萍等也发表了详细的转化方法(马丽萍等(2008)一种快速、高效的大豆农杆菌转化技术，中国农业科学41:661-668)。下面是大豆转化的方法描述：
挑选饱满健康的成熟大豆种子，放入含有氯气(5％NaOCl和3.5ml 12N HCl反应生成)的密闭容器内，消毒24h。将消毒后的大豆种子播种于发芽培养基(B5培养基)(GamborgO L,Miller R A,Ojima K.(1968)Experimental cell research,50:151-158)中，于25℃环境下光照18小时/暗6小时培养，催芽，至子叶变绿，而第一片真叶尚未完全长出，去掉种皮、根、原叶，保留3-5mm下胚轴将子叶从中竖直切开，得到两片各含有一片子叶，半个下胚轴和半个上胚轴外植体材料。子叶，胚尖朝上垂直接种于共培养培养基(1/10B5大量和微量元素，1/10MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，1mg/LBA，200μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.4)培养基中，进行预培养。
挑含实施例9中构建的载体质粒pCambia1300-p35S-pGmTE1-GmGA20ox2的单克隆，摇菌到OD600＝0.8-1.0，离心10min，收集菌体，重悬于液体共培养培养基(1/10的B5大量和微量元素；1/10的MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，1mg/L的BA，200μmol/L的乙酰丁香酮，pH5.4)，获得农杆菌工程菌液。从预培养基(MS+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite,pH 5.8)上取预培养24h的外植体转移到事先制备好的农杆菌工程菌液中，侵染30分钟。侵染后的外植体转到共培养培养基中25度共培养3天。三天后将外植体上的菌洗去，转到芽诱导培养基上(B5大量和微量，MS铁盐，3％蔗糖，1.68mg/L BAP，400mg/L timentin，2.5g/L gelrite，pH5.6)，25度培养14天，转移外植体到含有2mM的草甘膦的芽诱导培养基上，培养14天。然后切去子叶和死掉的组织，转移外植体到含有1mM草甘膦的芽伸长培养基上(MS大量、微量和铁盐，B5维生素，3％蔗糖，0.1mg/L IAA，0.5mg/L GA3，1mg/L ZR，200mg/L timentin，2.5g/Lgelrite，pH 5.6)培养14天。将健康的至少有3片叶子的芽转到生根培养基(1/2 B5，MS铁盐，2％蔗糖，1mg/L IBA，pH 5.6)上进行生根培养。获得含转化载体pCambia1300-pGmTE1-GmGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因大豆植株。
实施例11、转基因大豆的鉴定
通过上述方法，获得含转化载体pCambia1300-p35S-pGmTE1-GmGA20ox2和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因大豆植株。将T0代植株移栽到温室中，对转基因大豆植株和空载体对照植株的成熟时间进行比较分析。我们获得的31个转pCambia1300-p35S-pGmTE1-GmGA20ox2载体的转基因植株(命名为eOsGA20ox1)中有24个植株的成熟明显提早。其中两个典型品系成熟时间如下如表3
表3：两个典型品系成熟时间
| 品系 | 生长周期(天) |
| CK | 98±2 |
| eGmGA20ox2-7 | 93±2 |
| eGmGA20ox2-19 | 94±2 |
*CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株；eGmGA20ox2为载体pCambia1300-pGmTE1-GmGA20ox2-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中eGmGA20ox2后面的编号(8，19)是对不同品系随机编号，以便于区分不同的转化事件。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种赤霉素生物合成酶在提早植物成熟中的应用，其特征在于所述的应用是将赤霉素生物合成酶基因与表达元件连接构建表达框，然后将表达框导入植物中，实现植物成熟的提早；所述表达元件包括启动子、增强子和终止子；所述赤霉素生物合成酶的氨基酸序列为SEQ ID No: 3所示；所述增强子引入到赤霉素生物合成酶基因表达框的上游20 kb以内或者下游20 kb以内的位置；所述植物为水稻；所述启动子核苷酸序列为SEQ ID No:19所示，所述增强子为来自CaMV的35S增强子。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述赤霉素生物合成酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No:12所示。
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