KR100783652B1 - 음지내성 형질전환 고구마 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 음지회피성이 현저히 억제되거나 음지내성이 증가된, 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자 (S598A)가 도입된 형질전환 고구마 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 형질전환 고구마는 초장이 짧고, 절간이 짧으며, 분지 수가 증가되고, 엽자루 및 엽 수가 증가되고 줄기의 두께가 비대화되고, 식물체 잎이 농록색을 띄는 표현형적 특징을 나타냄으로써, 식물체 내 또는 식물체 간 광에 대한 경합을 감소 또는 억제시켜 식물체가 광을 효율적으로 활용하도록 하고, 식물체의 강건한 생육을 조장할 뿐만 아니라, 생물적·비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시켜, 궁극적으로 고구마의 생산성을 증대시킬 수 있다.
형질전환, 고구마, 음지내성, 내서성, 음지회피성, S598A, 배발생 캘러스, G418, 파로모마이신

Description

음지내성 형질전환 고구마 및 그의 제조방법{Transgenic sweetpotato plants with shade tolerance and process for producing the same}
도 1은 귀리 파이토크롬 A 유전자 및 598번 세린 코돈이 알라닌 코돈으로 치환된 돌연변이 귀리 파이토크롬 A 유전자 (S598A)의 염기 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 도면이고;
도 2는 S598A 유전자를 함유하는 재조합 벡터 pCAMBIA2301-S598A의 개략도이며;
도 3은 고구마 경정 분열조직으로부터 유도된 배발생 캘러스의 증식을 보여주는 사진이고;
도 4는 목적 조직을 카나마이신 및 G418 배지에 첨가하여 효율적인 항생제 및 농도 선별을 나타낸 도면이며;
도 5는 고구마 형질전환체의 선별과정을 개략적으로 보여주는 도면이고;
도 6는 형질전환 고구마를 확인하기 위하여 도입된 목적 유전자 (S598A) 및 선별 유전자 (GUS)를 PCR로 증폭시킨 후 해당 유전자 단편을 서던 블랏으로 확인한 사진이며;
도 7은 형질전환 고구마에서 목적 유전자 (S598A) 및 선별 유전자 (NPTⅡ 및 GUS)의 전사체 단편을 노던 블랏으로 확인한 사진이고;
도 8은 파로모마이신을 살포한 후 저항성을 나타내는 형질전환 고구마 식물체를 나타낸 사진이며;
도 9는 토양에서 생육 중인 형질전환 고구마의 표현형적 특징을 보여주는 사진이고;
도 10은 산화적 스트레스에 내성을 나타내는 형질전환 고구마를 보여주는 사진이다.
본 발명은 음지내성을 갖는 형질전환 고구마 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 음지회피성이 현저히 억제되거나 음지내성이 증가된, 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자 (S598A)가 도입된 형질전환 고구마 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
고구마(Ipomoea batatas)는 세계적으로 중요한 식량 및 사료 작물로서 1000만 헥타르 이상에서 재배되고 있다. 고구마는 대표적인 전분작물로서 타작물에 비해 수량성 증대 가능성이 매우 높아 알콜 생산을 위한 원료 작물, 의약품 생산을 위한 바이오리액터(bioreactor), 또는 바이오플라스틱과 같은 석유화학제품을 생산을 위한 산업용 등으로 가치가 매우 높다 (문헌 [Goddijin and Pen, Trends in Biotechnol. 131: 659-668, 1995]). 따라서 내병성, 제초제 저항성, 영양학적 품 질 개선, 및 광 활성을 향상시킨 품종을 육성함으로써 경제적인 이익을 얻을 수 있다.
생명공학기술을 이용한 유용 유전자를 작물에 도입하는 형질전환(transformation)은 기존의 전통 육종법인 교잡육종의 단점을 보완하여 새로운 형질 또는 기능성이 강화된 형질을 갖는 작물 품종을 효과적으로 육성하기 위한 방법으로 정립되었다. 작물의 유전자 조작에 적당한 잠재적인 목표는 작물 생장의 개선, 환경에 대한 유연한 적응, 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 내성 강화, 및 이들 형질을 통한 수량성의 증대를 포함한다. 최근 식물생명공학기술, 즉 분자생물학, 유전자 재조합 기술과 조직배양 기술 등의 발달로 작물의 농업형질을 개선하고자 하는 목적으로 교잡육종의 단점을 극복할 수 있게 되었으며, 특히 특정 형질을 개선하고자 할 때, 목적 유전자만을 원하는 품종에 도입함으로써 기존 작물 품종의 우수성을 유지하면서 원하는 유전형질만을 개선할 수 있게 되었다 (문헌 [Altenbach et al., Plant Mol. Biol. 13: 513-522]). 특히, 고구마는 영양번식 작물로서 전통적인 교잡육종법을 이용한 새로운 품종 육성이 자식성 작물에 비해 어렵다. 따라서, 고구마는 식물생명공학 기술을 이용한 품종 육성이 타작물에 비해 더욱더 필요하다.
생명공학을 이용하여 새로운 유전자를 작물에 도입하기 위해서는 식물체 재분화 및 형질전환 기술이 확립되어야 한다. 고구마의 경우, 생장점, 잎 단편, 잎자루, 구근을 목적 조직으로 하여 식물체 재분화가 보고되었다 (문헌 ([Templeton-Somers and Collins, Theor. Appl. Genet. 71: 835-841, 1986]; [Gosukonda et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 31: 65-71, 1995]; 및 [Kwon et al., Kor. J. Plant Biotechnol. 29: 189-192, 2002])). 그러나 이들 방법으로부터 얻어진 목적 조직은 재분화능이 낮고, 장기간 계대배양 시 전형성능이 현저히 떨어지는 것으로 알려져 있다. 또한, 유전자 총(gene gun) 기법과 아그로박테리움(Agrobacterium) 기법을 이용한 형질전환 고구마 생산이 보고되었으나 (문헌 ([Prakash and Varadarajan, Plant Cell Rep. 11: 53-57, 1992]; 및 [Newell et al, Plant Science 107: 215-227, 1995])), 재현성이 매우 낮아 보다 효율적이면서 안정적인 고구마 형질전환 기술 개발이 요구되고 있다.
한편, 귀리 파이토크롬 A(oat phytochrome A)의 염기서열 중 598번 아미노산 세린(Ser) 코돈이 알라닌(Ala) 코돈으로 치환되어 광반응에 민감한 돌연변이 파이토크롬 A 유전자 (S598A)가 알려져 있다. 이 S598A는 광형태발생학적 생장 및 발달 측면에서 광반응성을 높이도록 설계되어 변형된 유전자이다. 이 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자를 발현하는 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana) 식물은 광조건에서 생장할 때 일반 귀리 파이토크롬 A 유전자를 발현하는 식물보다 초장(草丈)이 작고, 엽록소 형성, 잎 및 뿌리의 발달이 우수한 것으로 알려져 있다 (문헌 [Kim et al., Plant Cell 16: 2629-2640]). 나아가, 미국특허공개 제2004-72353호 (2004. 4. 15 공개) 및 한국특허공개 제2003-11733호 (2003. 2. 11. 공개)는 S598A 유전자로 형질전환된, 음지회피성이 감소된 형질전환 한국형 잔디(zoysiagrass)를 개시한 바 있다. 이 형질전환 잔디는 야생형 식물과 비교하여 절간과 잎꼭지가 유의적으로 축소되었고, 분지 또한 적어도 2배 이상 증가하였으 며, 잎은 농록색을 나타내었다. 그러나, 지금까지 형질전환이 까다로운 고구마에 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자를 도입하려는 시도는 전혀 없었으며, 따라서 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자가 도입된 형질전환 고구마는 제조된 바 없었다.
본 발명자들은 유전자 조작기술을 이용하여 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자 (S598A)가 도입된 형질전환 고구마를 제조하기 위하여 지속적인 연구를 수행해오던 중, 재분화능이 우수한 목적 조직을 선택하여, 효율적인 재분화 기술과 효율적인 형질전환체 선별방법을 이용함으로써, 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자가 도입된 형질전환 고구마를 제조하는데 성공하고, 이 형질전환 고구마가 현저히 억제된 음지회피성 또는 증가된 음지내성, 즉 내서성을 가짐으로써, 궁극적으로 고구마의 생산성을 증대시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 제1목적은 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자가 도입된 재조합 벡터, 형질전환 미생물, 형질전환 조직, 및 억제된 음지회피성 또는 증가된 음지내성을 갖는 형질전환 고구마를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 고구마의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 고구마를 이용하여 고구마의 생산량을 증대시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1면은 598번 아미노산 세린 코돈 (AGT)이 알라닌 코돈 (GCT)으로 치환된 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자 (S598A)를 함유하고, 상기 유전자의 발현이 CaMV35S(cauliflower mosaic virus 35S) 프로모터의 제어 하에 있는, 재조합 벡터, 예를 들어 pCAMBIA2301-S598A에 관한 것이다.
본 발명의 제2면은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물, 예를 들어 아그로박테리움 튜메파시엔스(A. tumefaciens)에 관한 것이다.
본 발명의 제3면은 상기 재조합 벡터 또는 상기 미생물로 형질전환된 고구마의 배발생 캘러스(embryogenic callus)에 관한 것이다.
본 발명의 제4면은 상기 형질전환 캘러스로부터 재분화된, 억제된 음지회피성 또는 증가된 음지내성을 갖는 형질전환 고구마에 관한 것이다.
본 발명의 제5면은
(1) 598번 아미노산 세린 코돈 (AGT)이 알라닌 코돈 (GCT)으로 치환된 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자 (S598A)를 함유하고, 상기 유전자의 발현이 CaMV35S 프로모터의 제어 하에 있는, 재조합 벡터를 제작하고;
(2) 유전자 총 또는 아그로박테리움 기법에 의해 단계 (1)의 재조합 벡터로 고구마의 배발생 캘러스를 형질전환시킨 후, 형질전환된 캘러스를 선별하고;
(3) 단계 (2)의 형질전환된 캘러스로부터 억제된 음지회피성 또는 증가된 음지내성을 갖는 형질전환 고구마를 재분화시킨 후, 형질전환된 고구마를 선별하는:
단계를 포함하는, 억제된 음지회피성 또는 증가된 음지내성을 갖는 형질전환 고구마의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제6면은 상기 형질전환 고구마의 뿌리를 유도한 후, 토양으로 옮겨 재배하는 단계를 포함하는, 고구마의 생산량을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 광형태발생학적 생장 및 발달 측면에서 향상된 광반응성을 설계하도록 변형된 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자를 형질전환 기술을 이용하여 고구마 세포에 도입하여 발현하는, 형질전환 고구마의 생산에 관한 것이다.
귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자, S598A는 귀리 파이토크롬 A 유전자 (젠뱅크 등록번호 16110)의 염기서열 중 598번 아미노산 세린의 코돈 (AGT)이 부위-특이적 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의해 알라닌 코돈 (GCT)으로 치환된 돌연변이 파이토크롬 A 유전자이다 (도 1, 및 서열번호 1 및 2 참조). 본 발명에서는, 이 돌연변이 파이토크롬 A 유전자의 발현이 CaMV35S 프로모터의 제어 하에 있도록 재조합 벡터를 제조하며, 예를 들어, 돌연변이 파이토크롬 A 유전자를 pCAMBIA2301 벡터 (CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)로부터 입수)로 서브클로닝(subcloning)하여, pCAMBIA2301-S598A 벡터를 제작하며 (도 2 참조), 이 벡터로 적당한 미생물, 예를 들어 대장균(E. coli) 또는 A. 튜메파시엔스를 형질전환시킨다.
또한, 본 발명에서는 형질전환을 위한 목적 조직으로 1 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 MS(Murashige Skoog) 배지에서 고구마의 경정 분열조직(meristem)으로부터 배발생 캘러스를 유도하고, 이를 2 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 배지 (Sigma-Aldrich)에서 계대배양한 것을 사용한다 (도 3 참조). 상기 목적 조직에 광활성이 높은 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자 (S598A)를 유전자 총 기법과 아그로박테리움 기법을 이용하여 도입하고, 카나마이신 유사체 항생제 G418 (제네티신(Geneticin))과 파로모마이신(paromomycin) 저항성에 의해 형질전환체를 선별한다 (도 4 및 8 참조). 도 5는 본 발명에 따른 형질전환 고구마의 선별과정을 개략적으로 나타낸 것이다. 형질전환된 고구마는 목적 유전자 (S598A) 및 선별 유전자 (GUS: β-glucuronidase)를 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭시킨 후 해당 유전자 단편을 서던 블랏(Southern blot)으로 확인하고 (도 6), 목적 유전자 (S598A) 및 선별 유전자 (NPTⅡ(neomycin phosphotransferase Ⅱ) 및 GUS)의 전사체 단편을 노던 블랏(Northern blot)으로 확인함으로써 (도 7), 확인될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 형질전환 고구마는 절간(internode length)을 짧게 하여 초장은 왜성을 띄며, 증대된 절엽경(stem diameter), 증가된 분지 수(tiller number), 짧은 잎자루(petiole), 잎자루 및 잎 수의 증가, 농록색(dark green)의 잎 등의 표현적인 형질을 갖는다 (도 9 참조). 이는 작물의 재배생리 및 생장에 있어서 유용한 형질로서, 종간(inter-species) 및 종내(intra-species)의 광 경합(light competition)이 강한 고구마의 음지회피성 반응을 감소 또는 억제시킴으로써 고구마의 내서성을 증대시켜 강건한 식물의 생장을 조장하여, 결과적으로 생물학적 및 비생물학적 스트레스에 대한 내성, 예를 들어, 내병성, 내충성, 내비성(耐肥性), 산화적 스트레스에 대한 내성을 증대시키고 (도 10 참조), 재식밀도를 증대시켜 고구마 수량을 증대시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것은 아니다.
실시예 1: 식물 발현벡터의 제조
귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자는 귀리 파이토크롬 A 유전자 (젠뱅크 등록번호 16110)의 염기서열 중 598번 세린의 코돈 (AGT)을 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 알라닌 코돈 (GCT)으로 치환한 돌연변이 파이토크롬 A 유전자이다 (도 1). 이 돌연변이 파이토크롬 A 유전자는 5' 말단 및 3' 말단에 각각 BamHⅠ과 EcoRⅠ 제한효소 부위를 가지고 있어 pCAMBIA2301 벡터 (CAMBIA로부터 입수) 내로 서브클로닝하여 pCAMBIA2301-S598A 벡터를 제작하였다. 이때 pCAMBIA2301-S598A 벡터는 선별마커 유전자로 NPTⅡ, 리포터 유전자로 GUS를 포함하고 있다. S598A 유전자는 CaMV35S 프로모터의 전사조절을 받는다 (도 2). 이 벡터로 대장균 및 아그로박테리움 튜메파시엔스를 형질전환시켰다. 최종 벡터 구조는 제한효소를 이용한 제한 맵핑(restriction mapping) 및 직접적인 DNA 서열화에 의해 증명되었다.
실시예 2: 형질전환을 위한 고구마 목적 조직의 선택
고구마 품종 '율미'의 경정 분열조직(meristem)로부터 1 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 MS 배지에서 배발생 캘러스를 유도하였다. 이들 캘러스를 각각 1 ㎎/ℓ 2,4-D 및 2 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 MS 배지 및 2 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 배지 (Sigma-Aldrich)에서 증식시켜 그 결과를 비교하였다. 캘러스의 증식속도는 2 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 배지에서 가장 우수하였고 (도 3), 증식된 캘러스의 재분화율도 우수하였다. 반면, 1 ㎎/ℓ 2,4-D 및 2 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 MS 배지에서 증식시킨 캘러스는 증식속도가 매우 낮고 4 주 간격의 계대배양 시 재분화율이 현저히 저하되었다. 따라서, 유도된 배발생 캘러스를 2,4-D 2 ㎎/ℓ를 함유하는 N6 배지에서 4 주 간격으로 계대배양하여 형질전환을 위한 목적 조직으로 이용하였다. 본 실험에서는 1 년 이상 계대배양된 캘러스를 형질전환을 위한 목적 조직으로 이용하였다.
실시예 3: 형질전환체 선별을 위한 항생제의 선택
본 실험에서는 카나마이신 (농도 0, 25, 50, 100, 200 ㎎/ℓ)과 카나마이신 유사체로서 효율적인 NPTⅡ 유전자 형질전환체를 선별하는데 이용되는 G418 (제네티신) (문헌 [Nehra et al., Plant J. 5: 285-297]) (농도 0, 5, 10, 20, 50, 100 ㎎/ℓ)을 이용하여 고구마 목적 조직의 저항성 여부를 검정하고, 적정 농도를 확인하고자 하였다. 항생제가 각각의 농도로 함유된 N6 + 2 ㎎/ℓ 2,4-D 배지에 배발생 캘러스를 4 주간 배양하여, 증식된 캘러스의 무게 및 트리페닐테트라졸리움 클로라이드(TTC: triphenyltetrazolium chloride)를 이용하여 세포활력을 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 카나마이신 농도에 따른 캘러스의 증식 정도는 대조구에 비해 차이가 크지 않았으며, 세포활력 역시 대조구 에 비해 차이가 없었다. 일반적으로 고구마 형질전환 시 카나마이신은 50∼100 ㎎/ℓ이 이용되지만, 실험 결과 고구마 목적 조직은 카나마이신에 대해 높은 저항성을 보였다. 이에 비해, G418 배지에서 캘러스의 무게는 10 ㎎/ℓ 이상에서 크게 감소하였으며, TTC 시험결과 역시 10 ㎎/ℓ 이상에서 세포활력이 크게 감소됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 실험에서는 NPTⅡ 도입 형질전환체 선별을 위하여 20 ㎎/ℓ G418을 이용하였다.
실시예 4: 유전자의 도입
(1) 유전자 총 기법을 이용한 유전자 도입
피격(bombardment) 전에 목적 유전자가 포함된 플라스미드 DNA를 0.6 또는 1.0-㎛ 크기의 금 입자에 코팅하였다. 60 g의 금 입자로 100% 에탄올에서 스탁 현탁용액을 제조하였다. 35 ㎕ 현탁용액을 1.5 ㎖ 미세원심분리관에 분주한 후 14,000×g에서 3 분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 남아있는 펠렛에 200 ㎕의 멸균수를 첨가하여 혼합한 후 다시 2차 원심분리하였다. 다시 상등액을 제거한 후 펠렛에 25 ㎕의 TE 완충액 (pH 8.0)을 첨가하여 잘 혼합하였다. 이 현탁액에 멸균수 200 ㎕, 2.5 M CaCl2 250 ㎕, 0.1 M 스퍼미딘(spermidine) 50 ㎕를 첨가하여 잘 혼합한 후 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 남아있는 펠렛에 100% 에탄올 200 ㎕를 첨가하여 원심분리한 후, 다시 100% 에탄올 36 ㎕를 첨가하여 플라스미드 DNA가 금 입자에 코팅된 미세주입물(microprojectile)을 조제하였다.
또한 피격 전에, 약 50개의 배발생 캘러스 목적 조직을 MS 기본배지, 2,4-D 1.0 ㎎/ℓ, 슈크로스 30 g/ℓ, 피타젤(phytagel) 0.3%(w/v)를 포함하는 페트리디쉬 (10×1.5 ㎝)의 약 2.5 ㎝ 직경의 중앙에 치상하였다. 바이오-래드 생탄도 전달 시스템(Bio-Rad Biolistic Delivery System) (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여, 10 ㎕의 미세주입물을 파괴 디스크(rupture disk) 강도 1,100 psi, 중지 플레이트(stopping plate)와 목적 조직의 간격 6 ㎝의 조건으로 고구마의 목적 조직에 도입시켰다. 유전자가 도입된 캘러스는 1 주일간 동일한 배지조건에서 배양한 후, 20 ㎎/ℓ G418이 함유된 캘러스 증식배지에서 25 ℃ (암조건), 4∼8 주간 생육시켰다. 이때 캘러스는 3∼4 주 간격으로 신선한 배지로 계대배양하면서 G418에 저항성인 캘러스 계통을 선별하였다. 저항성을 보이는 캘러스 계통은 재분화 배지 (0.1 ㎎/ℓ BA(6-benzylaminopurine)를 함유하는 MS 배지)에 옮겨 식물체 재분화를 유도하였다. 또한 G418에 저항성인 캘러스 계통 및 재분화 식물체는 X-글루쿠론산(X-gluc) 용액에 가하여 GUS 유전자 발현의 발색반응을 통해 형질전환 계통을 선별하였다. 이들 조직화학적 GUS 분석으로 확인된 식물체는 뿌리 유도배지 (MS 기본 배지, 30 g/ℓ 슈크로스)에 옮겨주어 고구마 식물체의 뿌리를 유도한 후, 뿌리가 잘 발달된 식물체는 토양으로 옮겨 생육을 촉진하였다 (도 5).
(2) 아그로박테리움 기법을 이용한 유전자 도입
pCAMBIA2301-S598A 벡터로 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 LBA4404 (Life Technologies)를 형질전환시키고, 이 균주로의 벡터 DNA의 도입을 플라스미드 레스큐(plasmid rescue)에 의해 확인하였다. 이 벡터 DNA를 포함하는 박테리아 세포를 카나마이신 50 ㎎/ℓ, 리팜피신 50 ㎎/ℓ가 포함된 YEP(Yeast Extract-Phosphate) 배지에서 160 rpm, 28 ℃ 조건에서 24 시간 진탕배양하였다. 다음날 박테리아를 3000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 박테리아 펠렛을 회수한 후 캘러스 증식배지에 200 μM 아세토시리곤(acetosyrigone)을 첨가한 공동배양 배지를 혼합하여 아그로박테리아를 재현탁하였다. 고구마 배발생 캘러스를 박테리아 현탁액을 함유하고 있는 공동배양 배지에서 1 시간 동안 공조 배양하였다. 이후, 0.3%의 피타젤을 함유하고 있는 공동배지에 3 M 여과지 (7 ㎝ 직경)를 깔고 배양된 캘러스를 적당한 간격으로 배열하여 24 ℃ 암조건에서 3∼5 일간 공동 배양하였다. 이때 아그로박테리아가 너무 자라지는 않도록 확인하였다. 박테리아에 감염된 고구마 캘러스는 500 ㎎/ℓ 세포탁심이 함유된 캘러스 증식 액체배지에서 남아있는 박테리아를 씻어준 후 300 ㎎/ℓ 세포탁심(cefotaxime) 및 20 ㎎/ℓ G418이 포함된 캘러스 증식배지에서 25 ℃, 암조건에서 4∼8 주간 배양하였다. 이때 캘러스는 3∼4 주 간격으로 신선한 배지로 계대배양하면서 저항성 캘러스 계통을 선별하였다. G418에 저항성인 캘러스 계통 및 재분화 식물체는 X-gluc 용액으로 처리하여 GUS 유전자 발현의 발색반응을 통해 형질전환 계통을 선별하였다. 이들 조직화학적 GUS 분석으로 확인된 식물체는 뿌리 유도배지 (MS 기본 배지, 30 g/ℓ 슈크로스)에 옮겨주어 고구마 식물체의 뿌리를 유도한 후 뿌리가 잘 발달된 식물체는 토양으로 옮겨 생육을 촉진하였다 (도 5).
실시예 5: 형질전환 고구마 식물체의 분자생물학적 분석
고구마 식물체의 잎으로부터 게놈 DNA를 분리하여 제한효소 EcoRⅠ 및 HindⅢ로 절단하여 PCR로 증폭된 S598A 유전자 단편을 프로브로 하여 서던(southern) 분석을 수행하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 유전자 총 기법으로 도입된 형질전환 고구마에서는 다수의 트랜스진(transgene)이 도입되었고, 아그로박테리움 기법으로 도입된 형질전환 고구마에서는 소수의 트랜스진이 도입되었으며, 일반 고구마의 경우에는 목적 유전자가 도입되지 않았음을 알 수 있다.
또한, 형질전환 고구마의 잎으로부터 RNA를 분리하여 형질전환 고구마에서 목적 유전자의 발현을 확인하였다. 즉, 목적 유전자 (S598A) 및 선별마커 유전자 (NPTⅡ, GUS) 단편을 프로브로 하여 노던(Northern) 분석을 수행하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, S598A, NPTⅡ 및 GUS 유전자가 형질전환 고구마에서 발현됨을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 형질전환 고구마 식물체의 파로모마이신 저항성 검정
형질전환 고구마 식물체를 토양으로 옮겨 300 ppm 파로모마이신을 식물체에 충분히 분사하여 1 주간 관찰하여 저항성 여부를 조사하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, NPTⅡ 유전자가 도입되어 발현되는 식물체는 파로모마이신 분사에 저항성을 보여 분사 전후의 식물체의 상태가 변화가 없었으나, 대조군의 고구마 식물체는 생장이 멈추고 잎이 먼저 고사하고 결국에 식물체가 죽었다.
실시예 7: 형질전환 고구마 식물체의 표현형적 특성
토양에서 생장 중인 형질전환 고구마 식물체의 표현형적 특성을 관찰하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 변형된 귀리 파이토크롬 A 유전자가 발현되는 형질전환 고구마 식물체는 대조군 고구마 식물체와 비교하여 초장이 짧고, 절간이 짧고, 엽 자루가 짧으며, 잎 수가 증가하고, 분지 수가 증가하며, 줄기 두께가 비대화되는 등 많은 표현형적 형질을 나타내었다. 또한, 형질전환 고구마의 잎은 농록색을 띄어 대조군 고구마와 확연히 구별되었다.
실시예 8: 형질전환 고구마 식물체의 산화적 스트레스에 대한 내성 검정
온실에서 생육 중인 비슷한 시기의 형질전환 고구마와 일반 고구마의 잎을 채취하여 메틸 비올로젠(methyl viologen)을 처리하여 형질전환 식물체의 산화적 스트레스에 대한 내성을 검정하였다. 즉, 고구마 식물체에 여러 농도의 메틸 비올로젠 (0, 1, 2, 5, 10, 20 μM)을 처리하여 36, 48 시간 (24 시간 일장, 14000 Lux) 동안 관찰하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, 형질전환 고구마는 10 μM 이상의 메틸 비올로젠 용액에서도 강한 내성을 보였으나, 일반 고구마는 5 μM 메틸 비올로젠 용액에서 백화 또는 갈변현상이 뚜렷이 나타났다. 이 결과로부터, S598A 유전자 도입 형질전환 고구마는 산화적 스트레스에 내성을 보임을 알 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 형질전환 고구마는 초장이 짧고, 절간이 짧으며, 분지 수가 증가되고, 엽자루 및 엽 수가 증가되고 줄기의 두께가 비대화되고, 식물체 잎이 농록색을 띄는 표현형적 특징을 나타냄으로써, 식물체 내 또는 식물체 간 광에 대한 경합을 감소 또는 억제시켜 식물체가 광을 효율적으로 활용하도록 하고, 식물체의 강건한 생육을 조장할 뿐만 아니라, 생물적·비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시켜, 궁극적으로 고구마의 생산성을 증대시킬 수 있다.
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  6. 598번 아미노산 세린 코돈 (AGT)이 알라닌 코돈 (GCT)으로 치환된 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자 (S598A)를 함유하고, 상기 유전자의 발현이 CaMV35S 프로모터의 제어 하에 있는 재조합 벡터 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물로 형질전환된 고구마의 배발생 캘러스(embryogenic callus)로부터 재분화된, 억제된 음지회피성 또는 증가된 음지내성을 갖는 형질전환 고구마(Ipomoea batatas).
  7. (1) 598번 아미노산 세린 코돈 (AGT)이 알라닌 코돈 (GCT)으로 치환된 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자 (S598A)를 함유하고, 상기 유전자의 발현이 CaMV35S 프로모터의 제어 하에 있는, 재조합 벡터를 제작하고;
    (2) 유전자 총 또는 아그로박테리움 기법에 의해 단계 (1)의 재조합 벡터로 고구마의 배발생 캘러스를 형질전환시킨 후, 형질전환된 캘러스를 선별하고;
    (3) 단계 (2)의 형질전환 캘러스로부터 억제된 음지회피성 또는 증가된 음지내성을 갖는 형질전환 고구마를 재분화시킨 후, 형질전환된 고구마를 선별하는:
    단계를 포함하는, 억제된 음지회피성 또는 증가된 음지내성을 갖는 형질전환 고구마의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 단계 (1)의 재조합 벡터가 귀리 돌연변이 파이토크롬 A 유전자가 pCAMBIA2301에 도입된 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 단계 (2)의 배발생 캘러스가 고구마의 경정 분열조직으로부터 1 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 MS 배지에서 유도된 후, 2 ㎎/ℓ 2,4-D가 첨가된 N6 배지에서 계대배양된 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 단계 (2)에서 형질전환된 캘러스를 G418에 대한 저항성에 의해 선별하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 단계 (3)에서 형질전환된 고구마를 파로모마이신에 대한 저항성에 의해 선별하는 방법.
  12. 제6항에 따른 형질전환 고구마의 뿌리를 유도한 후, 토양으로 옮겨 재배하는 단계를 포함하는, 고구마의 생산량을 증대시키는 방법.
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