TWI484907B - 使用經修飾的啟動子之植物老化操縱技術 - Google Patents

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Description

使用經修飾的啟動子之植物老化操縱技術
本申請案係2003年3月5日提申之美國專利申請案10/363,723，標題“Manipulation of plant senescence using an MYB gene promoter and cytokinin biosynthesis gene”之部分連續申請案，該美國專利申請案10/363,723請求2001年8月30日提申之國際專利申請案PCT/AU01/01092，標題“Manipulation of Plant Senescence Using An MYB Gene Promoter and Cytokinin Biosynthesis Genes”之優先權，該國際專利申請案PCT/AU01/01092請求2000年9月6日提申之澳洲專利申請案PQ 9946，標題“Manipulation of Plant Senescence Using An MYB Gene Promoter and Cytokinin Biosynthesis Genes”之優先權；其等之全部內容在此併入本案以為參考。
本發明有關操縱植物老化之方法。本發明亦有關可用於此方法之載體、具修飾的老化特徵之轉形植物以及此植物之植物細胞、種子和其它部分。
葉子之老化牽涉在細胞死亡前細胞內之代謝以及結構改變。其亦牽涉回收營養素給活躍的生長區域。
以細胞分裂素調節植物以及植物器官之老化，具有重要的農業重要性。提高葉子中細胞分裂素之位準，有助於延緩老化。已有許多啟動子被用於調節ipt基因之表達，其之產物(異戊烯基轉移酶)會催化細胞分裂素合成之關鍵步 驟。然而，概略而言，已有報告指出過度表達該ipt基因之基因轉殖植株，具有停滯的根與幼芽生長、無根形成、頂芽優勢減少以及葉面積減少。
本發明之目的係克服或緩和至少一或多個與先前技術有關之困難或缺點。
於一態樣中，本發明提供一種操縱植物老化之方法，該方法包括於該植物中引入一基因構築質體，該基因構築質體包括一經修飾的myb基因啟動子或其功能活性片段或變異體，其有效地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體。
老化之操縱涉及該植物和/或特定的植物器官。不同的植物器官，諸如葉、根、幼芽、莖、塊莖、花、匍匐莖以及果子之老化均可被操縱。植物以及植物器官老化之操縱可能具有重要的農業重要性，諸如增加園藝產品，如果子、花、葉與塊莖以及切花之耐儲時間；降低園藝作物之易腐爛性；增加老化經延緩的葉中之碳固定，使產率提高；提高飼料作物之生物量；提高種子生產等等。
"操縱老化"一般係指與未經轉形之對照組植株相比，延緩經轉形的植株之老化。然而，在某些應用方面，其可能需要去促進或在其它方面修飾植物之老化。例如，利用反訊息基因可促進或修飾老化。
該有效量之基因構築質體可經由任何適合的技術而被引入該植物中，例如經由轉導、轉染或轉形。“有效量”意 指於該植物或由其衍生而來之植物、植物種子或其它植物部分中，足以產生可識別的表型特徵之數量。此數量可由恰當的熟悉此技藝之人士，考慮植物之種類、投藥之途徑以及其它相關的因素而輕易地決定。此熟悉此技藝人士當可輕易地決定適合的投與數量以及方法。例如，見Maniatis et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor，其全部揭示內容在此併入本案以為參考。
“經修飾的myb基因啟動子”意指通常與myb基因相關之啟動子，該啟動子被修飾成刪除或去活化該啟動子中一或多種根特異性模體(motifs)和/或花粉特異性模體。
雖然申請人並不想被理論所限制，但其假定該myb基因啟動子中一或多種根特異性模體之刪除或去活化，可減緩或克服有漏洞的表達編碼植物分生組織中細胞分裂素生合成酵素之基因，而影響一些種類之植物中根之發展的問題。亦假定該myb基因啟動子中一或多種花粉特異性模體之刪除或去活化，可減緩或克服有漏洞的表達編碼花粉中細胞分裂素生合成酵素之基因，而影響一些種類之植物中花粉之發展的問題。
較佳地，該經修飾的myb基因啟動子係經修飾的myb32基因啟動子。較佳地，該經修飾的myb基因啟動子係來自阿拉伯芥屬(Arabidopsis)，更佳地來自阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)。
可依照本發明修飾之適合的啟動子述於Li et al., Cloning of three MYB－like genes from Arabidopsis(PGR 99－138)Plant Physiology 121：313(1999)中，其全部揭示內容在此併入本案以為參考。
“根特異性模體”意指3－7個核苷酸，較佳地4－6個核苷酸，更佳地5個核苷酸之序列，其會管理植物根中相關基因之表達。
較佳地，該根特異性模體包括一致序列ATATT或AATAT。
較佳地，於該myb基因啟動子中，有1至10個之間，更佳地3至8個之間，甚至更佳地5至7個之間的根特異性模體係被刪除或去活化的，較佳係被刪除的。
該根特異性模體可藉由移除個別模體或藉由移除含有一或多個模體之啟動子的片段而被刪除。例如，可刪除阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)myb基因啟動子之核苷酸1至530間，較佳地110至530間之區域之全部或部分。
該刪除作用可藉由以，例如，限制核酸內切酶切該核酸，然後接合該切下之終端以產生具有一片段被移除之啟動子而達成。
例如，經修飾的阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)myb基因啟動子可藉由移除位於162－176處之XcmI位置與位於520－525處之SspI位置之間的片段而製得。此產生7個根特異性模體中有6個被刪除之經修飾的myb基因啟動子。選擇性地，全部7個根特異性模體均被刪除，例如藉由刪除位於520－525處之SspI位置之上游區域，或藉由刪除核苷酸1至 120之間的區域以及位於162－176處之XcmI位置與位於520－525處之SspI位置之間的區域。
根特異性模體可藉經由添加、刪除、取代或衍化該模體內一或多個核苷酸，以致其不再具有該較佳的一致序列而達到去活化。
較佳地，該經修飾的myb基因啟動子包括擇自於在第2、3以及4圖中所示之序列所構成之群組之核苷酸序列(分別為序列辨識編號：2、3以及4)以及其功能活性片段以及變異體。
“花粉特異性模體”意指3－7個核苷酸，較佳地4－6個核苷酸，更佳地4或5個核苷酸之序列，其會管理植物花粉中相關基因之表達。
較佳地，該花粉特異性模體包括擇自於由TTCT以及AGAA所構成之群組之一致序列。
較佳地，於該myb基因啟動子中，有1至30個之間，更佳地3至15個之間，甚至更佳地4至10個之間的花粉特異性模體係被刪除或去活化的，較佳係被刪除的。
該花粉特異性模體可藉由移除個別的模體或藉由移除含有一或多個模體之啟動子的片段而被刪除。例如，可刪除阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)myb基因啟動子之核苷酸1至540間，較佳地核苷酸390至540間之區域之全部或部分。
該刪除可藉由以，例如，限制核酸內切酶切該核酸，然後接合該切下之終端以產生具有一片段被移除之啟動子而達成。
例如，經修飾的阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)myb基因啟動子可藉由移除位於162－176處之XcmI位置與位於520－525處之SspI位置之間的片段而製得。此產生23個花粉特異性模體中有4個被刪除之經修飾的myb基因啟動子。選擇性地，10個花粉特異性模體被刪除，例如藉由刪除位於520－525處之SspI位置之上游區域。
花粉特異性模體可藉由添加、刪除、取代或衍化該模體內一或多個核苷酸，以致其不再具有該較佳的一致序列而達到去活化。
較佳地，該經修飾的myb基因啟動子包括擇自於在第2、3以及4圖中所示之序列所構成之群組之核苷酸序列(分別為序列辨識編號：2、3以及4)以及其功能活性片段以及變異體。
於本發明之另外的態樣中，提供有一種提高植物之生物量之方法，該方法包括於該植物中引入一基因構築質體，該基因構築質體包括一經修飾的myb基因啟動子或其功能活性片段或變異體，其有效地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體。
該myb基因啟動子或功能活性片段或變異體可為整段myb基因啟動子或經修飾的myb基因啟動子。
該整段myb基因啟動子可為myb32基因啟動子。較佳地，該myb基因啟動子係來自阿拉伯芥屬，更佳地來自阿拉伯芥。最佳地，該myb基因啟動子包括擇自於由第1圖所示之序列所構成之群組之核苷酸序列(序列辨識編號：1)以及 其功能活性片段以及變異體。
適合的啟動子述於Li et al.,Cloning of three MYB－like genes from Arabidopsis(PGR 99－138)Plant Physiology 121：313(1999)中。
該經修飾的myb基因啟動子可為在上文中所述之經修飾的myb基因啟動子。
“提高生物量”意指相對於未經轉形對照組植株，提高或增加轉形的植株中擇自於由下列所構成之群組之成長特徵：總葉面積、累積葉面積、葉成長動力學(即，隨時間增加之葉的數目)、匍匐莖長度、有花植物之百分比以及每一朵花或每一播種面積之種子產率。“提高生物量”亦包括相對於未轉形對照組植株，降低或減少轉形的植株中匍匐莖死亡之百分比。
特別地，申請人已發現，雖然本發明之基因轉殖植株之種子重量(即，一千個種子之重量)無法與非基因轉殖對照組植株區別，但在每一朵花或每一播種面積為基礎之總種子產率方面，相對於具有相等開花強度之非基因轉殖植株，基因轉殖植株顯著地較高。
與myb基因啟動子或經修飾的myb基因啟動子相關之“功能活性”一詞，意指能夠以本發明之方法操縱植物之老化之片段或變異體(諸如類似物、衍生物或突變體)。此變異體包括天然發生之等位基因變異體以及非天然發生之變異體。意圖包括一或多個核苷酸之添加、刪除、取代以及衍化，只要該修飾不會導致該片段或變異體之功能活性喪 失。較佳地，該功能活性片段或變異體與以上所提及該片段或變異體對應之序列之相關部分，具有至少約80%之一致，更佳地至少約90%之一致，最佳地至少約95%之一致。 較佳地，該片段具有至少20個核苷酸，更佳地至少50個核苷酸，更佳地至少100個核苷酸，更佳地至少200個核苷酸，最佳至少300個核苷酸之大小。
“編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因”意指編碼涉及諸如激動素、玉米素以及苯甲腺嘌呤之細胞分裂素之合成的酵素之基因，例如編碼異戊基轉移酶(ipt)或像ipt之基因，諸如sho基因(如，來自牽牛花)。較佳地，該基因係異戊烯基轉移酶(ipt)基因或sho基因。於較佳具體例中，該基因係來自擇自於由下列所構成之群組之物種：土瓖桿菌屬(Agrobacterium)，更佳地根瘤土瓖桿菌(agrobacterium tumefaciens)；蓮花(Lotus)，更佳地百脈根(Lotus japonicus)；以及矮牽牛屬(Petunia)，更佳地矮牽牛(Petunia hybrida)。
最佳地，該基因包括擇自於由第6、8與10圖所示之序列所構成之群組之核苷酸序列(序列辨識編號：5、7與9)、編碼於第7、9與11圖中所示之多肽之序列(序列辨識編號：6、8與10)以及其功能活性片段以及變異體。
與編碼細胞分裂素生合成酵素之基因相關之“功能活性”一詞，意指能夠以本發明之方法操縱植物之老化之片段或變異體(諸如類似物、衍生物或突變體)。此變異體包括天然發生之等位基因變異體以及非天然發生之變異體。意圖 包括一或多個核苷酸之添加、刪除、取代以及衍化，只要該修飾不會導致該片段或變異體之功能活性喪失。較佳地，該功能活性片段或變異體與以上所提及該片段或變異體對應之序列之相關部分，具有至少約80%之一致，更佳地至少約90%之一致，最佳地至少約95%之一致。此功能活性變異體以及片段包括，例如，該等具有保守的核酸改變，或核酸改變會在對應的胺基酸序列中，產生一或多個殘基之保守的胺基酸取代者。例如，該功能活性變異體可包括第6、8或10圖中所示之序列中之一或多個保守的核酸取代，所產生的功能活性變異體編碼分別於第7、9或11圖中所示之胺基酸序列。較佳地，該片段具有至少20個核苷酸，更佳地至少50個核苷酸，更佳地至少100個核苷酸，更佳地至少500個核苷酸之大小。
該基因構築質體可經由任何適合的技術而引入該植物中。用於將本發明之基因構築質體併入植物細胞中之技術(例如轉導、轉染或轉形)係此技藝之人士所熟知的。此等技術包括土瓖桿菌屬介導的併入、電穿孔進入組織、細胞以及原生細胞中、注射進入生殖器官、注射進入未成熟的胚胎以及高速投射導入細胞、組織、癒合組織、未成熟以及成熟胚胎、基因槍轉形以及其等之組合。要選擇何種技術，主要係視欲進行轉形之植物而定，且可輕易地由熟悉此技藝之人士決定。
可依照如下所述選定併入本發明之基因建築質體之細胞，之後使用此技藝中眾所周知之技術，於適當的培養基 中培養，再生經轉形的植株。培養條件，諸如溫度、pH等等，對熟悉此技藝之人士而言係顯而易見的。所產生之植株可使用此技藝中眾所周知之方法以有性或無性方式繁殖，以產生經轉形的植株之繼代。
本發明之方法可應用於各種植物，包括單子葉植物[諸如禾本科植物(如，草料、草皮以及生質能源禾本科植物，包括多年生黑麥草、高羊茅、義大利黑麥草、紫羊茅、虉草、大藍莖草、網茅屬、紫狠尾草、野麥屬、野生甘蔗、芒屬)、玉米、燕麥、小麥以及大麥)]、雙子葉植物[諸如阿拉伯芥屬、菸草、大豆、三葉草(如，白三葉、紅三葉草、地三葉)、紫花苜蓿、加拿大芥花籽(canola)、蕓薹屬蔬菜、萵苣、菠菜]以及裸子植物。
於本發明之另外的態樣中，提供有一種能夠操縱植物老化之載體，該載體包括一經修飾的myb基因啟動子或其功能活性片段或變異體，其有效地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體。
於本發明之又另外的態樣中，提供有一種能夠提高植物之生物量之載體，該載體包括一myb基因啟動子或其功能活性片段或變異體，其有效地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體。
該myb基因啟動子或其功能活性片段或變異體，可為整段myb基因啟動子或在此所述之經修飾的myb基因啟動子。
於本發明之此態樣之較佳具體例中，該載體可進一步 包括終結子；該啟動子、基因以及終結子係有效地連接的。
“有效地連接的”意指該啟動子能夠使該基因於植物細胞中表達，而該終結子能夠使該基因於植物中之表達終止。較佳地，該啟動子在該基因之上游，而該終結子在該基因之下游。
該載體可為任何適合的類型，且可為病毒性的或非病毒性的。該載體可為表達載體。此載體包括染色體的、非染色體的以及合成的核酸序列，如植物病毒之衍生物；細菌質體；從根瘤土瓖桿菌(Agrobacterium tumefaciens)而來之Ti質體之衍生物；從發根土瓖桿菌(Agrobacterium rhizogenes)而來之Ri質體之衍生物；噬菌體DNA；酵母人工合成染色體；細胞人工染色體；雙元細菌人工染色體；由質體以及噬菌體DNA之結合衍生而來之載體。然而，任何能在植物細胞中進行複製或整合或存活之其它載體均可使用。
該啟動子、基因以及終結子可為任何適合的類型，且可為該標的植物細胞內生的，或可為外源性的，但條件是其等在該標的植物細胞中能起作用。
可於本發明之載體中使用之各種終結子亦為熟悉此技藝之人士所熟知的。該終結子可來自與該啟動子序列相同的基因或相異的基因。特別適合的終結子係多腺苷酸訊號，諸如CaMV 35S多聚A以及其它來自胭脂鹼合成酶(nos)與章魚鹼合成酶(ocs)基因之終結子。
除該啟動子、該基因以及該終結子之外，該載體亦可 包括其它該基因之表達所需之元素，呈不同的組合，例如，載體骨架、複製的起點(ori)、多重選殖位置、間隔區序列、加強子、內隱子(諸如玉米泛素Ubi內隱子)、抗生素抗性基因以及其它選擇性標記基因[諸如新黴素磷酸轉移酶(nptII)基因、潮黴素磷酸轉移酶(hph)基因、草胺膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶(bar或pat)基因]以及報告基因(諸如β－葡萄糖苷酸酶(GUS)基因(gusA)]。該載體亦可包含用於起始轉譯之核糖體結合位置。該載體亦可包括用於擴大表達之適當的序列。
除使用選擇性標記基因以提供用於選擇經轉形的宿主細胞之表現型特點外，存在於經轉形的細胞中之載體，可由此技藝中眾所周知之技術測定，諸如PCR(聚合酶鏈鎖反應)、南方點墨雜交分析、組織化學分析(如GUS分析法)、薄層色層分析法(TLC)、北方以及西方點墨雜交分析。
熟悉此技藝之人士應能認知到，該載體之各種組份係有效地連接，以便能使該基因表達。用於有效地連接本發明之載體之組份之技術，係熟悉此技藝之人士所熟知的。此等技術包括使用連接物，諸如合成連接物，例如，包括一或多種限制酵素位置。
於本發明之另外的態樣中，提供有一種具有經修飾的老化特徵或提高生物量之基因轉殖植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分。較佳地，該植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分包括如本發明之載體。較佳地，該基因轉殖的植物細胞、植物、植物種子或其它植物部分係由 如本發明之方法產生。
本發明亦提供一種由本發明之植物細胞衍生而來之基因轉殖植物、植物種子或其它植物部分。
本發明亦提供由本發明之植物衍生而來之基因轉殖植物、植物種子或其它植物部分。
參考所附之範例以及圖式，將能更完整的說明本發明。然而，應了解，下列之說明僅係用於例示，而不應以任何之方式作為以上所述本發明之概論之限制。
圖式簡單說明
第1圖顯示從阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)而來之myb32基因(atmyb32)之啟動子之核苷酸序列(序列辨識編號：1)，帶有特別強調MYB類型、花粉特異性以及根特異性模體(motif之Atmyb32啟動子序列。WAACCA(下面標線/斜體 )MYB1AT；GTTAGTTMYB1LEPR；CCWACCMYBPZM；GGATA(斜體)MYBST1；AGAAA(下面標線 )POLLEN1LELAT52；ATATT(粗體)ROOTMOTIFTAPOX1。
第2圖顯示具有CcmI－SspI植物序列被刪除之Atmyb32啟動子序列變異體(Atmyb32xs)。特別強調MYB類型、花粉特異性以及根特異性模體(motif)。WAACCA(下面標線/斜體 )MYB1AT；GTTAGTTMYB1LEPR；CCWACCMYBPZM；AGAAA(下面標線 )POLLEN1LELAT52；ATATT(粗體)ROOTMOTIFTAPOX1(序列辨識編號：2)。
第3圖顯示具有全部根模體(motif)均被刪除之Atmyb32啟動子變異序列。特別強調MYB類型、花粉特異性以及根特異性模體。WAACCA(下面標線/斜體 )MYB1AT；CCWACCMYBPZM；AGAAA(下面標線 )POLLEN1LELAT52(序列辨識編號：3)。
第4圖顯示具有SspI位置上游序列被刪除之Atmyb32啟動子變異序列。特別強調MYB類型、花粉特異性以及根特異性模體(motif)。WAACCA(下面標線/斜體 )MYB1AT；CCWACCMYBPZM；AGAAA(下面標線 )POLLEN1LELAT52(序列辨識編號：4)。
第5圖顯示Atmyb32以及Atmyb32xs啟動子序列中之模體(motif)。
第6圖顯示從根瘤土瓖桿菌(Agrobacterium tumefaciens)而來之異戊烯基轉移酶(ipt)基因之核苷酸序列(序列辨識編號：5)。
第7圖顯示從根瘤土瓖桿菌(Agrobacterium tumefaciens)而來之異戊烯基轉移酶基因推論而得之胺基酸序列(序列辨識編號：6)。
第8圖顯示從百脈根(Lotus japonicus)而來之異戊烯基轉移酶基因之核苷酸序列(序列辨識編號：7)。
第9圖顯示從百脈根(Lotus japonicus)而來之異戊烯基轉移酶基因推論而得之胺基酸序列(序列辨識編號：8)。
第10圖顯示從矮牽牛(Petunia hybrida)而來之細胞分裂素生合成Sho基因之核苷酸序列(序列辨識編號：9)。
第11圖顯示從矮牽牛(Petunia hybrida)而來之細胞分裂素生合成Sho基因推論而得之胺基酸序列(序列辨識編號：10)。
第12圖顯示atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉(Trifolium repens)植株之PCR以及南方DNA分析。a)patmyb32：ipt之T－DNA區域，顯示供用於南方雜交分析之限制酵素位置以及探針之位址。b)經PCR擴大之599 bp nptII以及583 bp ipt產物之溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠。c)從PCR陽性白三葉植株分離而來之總基因組DNA，經HindIII消化後，以該ipt探針雜交之南方墨點雜交圖。d)從PCR陽性白三葉植株分離而來之總基因組DNA，經HindIII消化後，以該nptII探針雜交之南方墨點雜交圖。泳道1－2：2個獨立的卡那黴素(kanamycin)抗性Haifa品系再生物，代號：分別為Hmi01、Hmi08；泳道3－12：12個獨立的卡那黴素抗性Irrigation品系再生物，代號：分別為Imi06、Imi07、Imi08、Imi09、Imi10、Imi11、Imi12、Imi14、Imi16、Imi18；泳道C：未轉形的白三葉；泳道P：陽性對照組質體patmyb32ipt。
第13圖顯示atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉(T.repens)植株中ipt mRNA表達之RT－PCR分析。泳道1－11係來自11個獨立的基因轉殖株之樣本，具有如第4.8圖之對應的植株代號；泳道C，對照組未轉形的植株；泳道P，作為陽性對照組之質體。從葉組織中分離出全部的RNA。使用全部的RNA(13 μg)供用於每一個逆轉錄反應，且利用PCR擴大1/5的RT產物。右邊凝膠上之DNA產物係利用2X 30週期密集PCR擴 大。於載負於間隔泳道上之對應的RT－PCR反應中，沒有添加逆轉錄酶。
第14圖顯示從atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉(T.repens)植株切離之葉子之老化生物分析。從每一植株之匍匐莖上相似位置處收集至少30個葉子。A.變黃的葉子之數目係切離的葉子總數之分數。B.保持在水上，光照射2週後之典型的外觀。植株之代號：HC、IC以及Hmg、Img，分別為未轉形以及atmyb32：：gusA基因轉殖植株(Haifa品系以及Irrigation品系)；01以及08，分別為atmyb32：：ipt基因轉殖Haifa株Hmi01以及Hmi08；11、12、16以及18分別為atmyb32：：ipt基因轉殖Irrigation株Imi11、Imi12、Imi16以及Imi18。
第15圖顯示A)一般植物形態，B)正常幼芽之生長以及C)atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉(T.repens)(右圖)植株與對照組植株(左圖)相比較之正常根之生長。
第16圖顯示有關pBMVkAtMYB32－900：：ipt之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體：pBMVkAtMYB32－900：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標記：spec；植物選擇性標記盒：35S：：kan：：35ST；基因啟動子：AtMYB32－900；基因終結子：nos]。
第17圖顯示載體pBMVkAtMYB32－900：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：11)。
第18圖顯示有關pBMVkAtMYB32xs：：ipt－nos之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體： pBMVkAtMYB32XS：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標記：spec；植物選擇性標記盒：35S：：kan：：35ST；基因啟動子：AtMYB32－xs；基因終結子：nos]。
第19圖顯示載體pBMVkAtMYB32xs：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：12)。
第20圖顯示有關pBMVhAtMYB32－900：：ipt－nos之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體：pBMVhAtMYB32－900：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標記：spec；植物選擇性標記盒：35S：：hph：：35ST；基因啟動子：AtMYB32－900；基因終結子：nos]。
第21圖顯示載體pBMVhAtMYB32－900：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：13)。
第22圖顯示有關pBMVhAtMYB32xs：：ipt－nos之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體：pBMVhAtMYB32XS：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標記：spec；植物選擇性標記盒：35S：：hph：：35ST；基因啟動子：AtMYB32－xs；基因終結子：nos]。
第23圖顯示載體pBMVhAtMYB32xs：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：14)。
第24圖顯示有關pBSubn－AtMYB32－900：：ipt－nos之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體：pBSubn－AtMYB32－900：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標記：spec；植物選擇性標記盒：Ubi：：bar：：nos；基因啟動子：AtMYB32－900；基因終結子：nos]。
第25圖顯示有關載體pBSAtMYB32900：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：15)。
第26圖顯示含有pBMVhATMYB3－900：：ipt－nos以及pBMVhATMYB32xs：：ipt－nos之基因轉殖加拿大芥花籽(canola)之產生。A.加拿大芥花籽於試管內生長；B.從7天大幼苗上切離下胚軸節段，然後接種土瓖桿菌屬(Agrobacterium)懸浮液；C與D.經接種的下胚軸節段在潮黴素(hygromycin)選擇下之再生；E－J.帶有pBMVhATMYB3－900：：ipt－nos與pBMVhATMYB32xs：：ipt－nos載體之基因轉殖T0 加拿大芥花籽植株。
第27圖顯示基因槍轉形小麥之方法。
第28圖顯示小麥(Triticum aestivum L.MPB Bobwhite 26)之基因槍轉形。供體植株之生產(A與B)；合子胚之分離(C與D)；草胺膦(glufosinate)選擇下之再生(E－G)；選擇下根之形成(H)；在供基因轉殖後代復元之隔離的溫室條件下生長之T0 植株(I)。
第29圖顯示表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株之隔離的田間試驗。
第30圖顯示表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株與非基因轉殖對照組白三葉植株之生長速率以及生長動力學之比較性評估。A)生長速率B)生長動力學C)生長特徵(45天後)。
第31圖顯示在隔離的田間條件下，表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12、LXR 18以及LXR 11)以及非基因轉殖對照組白三葉植株(即WT)之開花強度(即，每m2 成熟花之數目)。
第32圖顯示在隔離的田間條件下，表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12、LXR 18以及LXR 11)以及非基因轉殖白三葉植株(即，WT)之種子重量(即，一千個種子之重量，單位克)。
第33圖顯示在隔離的田間條件下，表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12、LXR 18以及LXR 11)以及非基因轉殖白三葉植株(即，WT)之每朵花之種子產率(毫克)。
第34圖顯示在隔離的田間條件下，表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12、LXR 18以及LXR 11)以及非基因轉殖白三葉植株(即，WT)之每區域之種子產率(單位kg/ha)。
第35圖顯示含有嵌合pBMVkATMYB3－900：：ipt－nos以及pBMVkATMYB32xs：：ipt－nos基因之基因轉殖紫花苜蓿植株之生殖。A.使用從紫花苜蓿選殖株C2－3、C2－4以及19－17而來之葉柄外植體，用於以土壤桿菌屬(Agrobacterium)懸浮液接種，誘使在卡那黴素(kanamycin)之存在下進行選擇後，產生轉形的胚性癒傷組織；B－D.帶有從pBMVkATMYB3－900：：ipt－nos與pBMVkATMYB32xs：：ipt－nos載體而來之嵌合基因之基因轉殖紫花苜蓿幼苗，從在試管內生 長之體細胞胚中新生出來。
第36圖顯示基因轉殖加拿大芥花籽(canola)植株之PCR分析(T1 LXR加拿大芥花籽植株4)。從不同的加拿大芥花籽植株T1 LXR04植株中分離出基因組DNA，然後使用對A.選擇性標記(hph)或B.有興趣之候選基因(IPT)具特異性之引子進行PCR。
第37圖顯示於T1 基因轉殖加拿大芥花籽(canola)植株中，IPT基因之表達分析(T1 LXR加拿大芥花將相對的IPT葉子之表達)。
第38圖顯示基因轉殖加拿大芥花籽(canola)之切離的子葉，在分離後7天，相較於野生對照組子葉，表現出老化延緩。
第39圖顯示T1 基因轉殖加拿大芥花籽(canola)之子葉，在分離7天後之老化計分。
0＝無明顯的老化1＝淡綠色2＝一些變黃3＝大部分變黃4＝完全變黃
第40圖顯示與野生對照組幼苗相比，切離的幼苗在分離後14天，表現出老化延緩之基因轉殖加拿大芥花籽(canola)。
第41圖顯示T1 基因轉殖加拿大芥花籽(canola)之幼苗第一葉，在分離14天後之老化計分。
0＝無明顯的老化1＝淡綠色2＝一些變黃3＝大部分變黃4＝完全變黃5＝腐爛/壞死
第42圖顯示基因轉殖小麥株之南方雜交分析。泳道包 括：MW－分子量；WT－野生型；基因轉殖小麥株LXR3、LXR4、LXR13、LXR16以及含10與20 pg之陽性質體對照組。
第43圖顯示獨立的T1 基因轉殖小麥株之表達分析(小麥中之IPT定量表達)。使用從含有標的序列之質體DNA推論而得之標準曲線，決定轉錄值之量，單位：毫微微莫耳(fmol)/微克。樣品表現候選基因IPT之高、中以及低表達等級。
第44圖顯示溫室中生長之T1 基因轉殖小麥植株之表現型差異。A.與空白對照組小麥植株相比，T1 LXR 13小麥植株表現正常表現型態。B.與空白對照組小麥植株相比，T1 LXR 04小麥植株表現長得矮小之表現型以及旗葉數目增加。
第45圖顯示在分離7天後，與空白對照組之葉子相比，基因轉殖小麥展現出葉之老化延緩。
 範例 範例1
Atmyb32啟動子序列以及啟動子序列變異體 該Atmybb32啟動子序列以及其變異體示於第1－4圖中。
範例2
細胞分裂素生合成基因 適合於本發明中使用之細胞分裂素生合成基因之例子示於第6、8以及10圖中。適合的基因亦包括該等編碼第7、9與11圖中所示之多肽肽者。
範例3
基因轉殖白三葉植株之產生 使用帶有嵌合atmyb32：：ipt基因之雙元載體(第12a圖)，利用土瓖桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉形，產生基因轉殖白三葉植株(海法以及Irrigation白三葉草(Trifolim repens cv.Haifa and Irrigation))。使用ipt與nptII引子，利用PCR篩選該基因轉殖植株(第12b圖)。HindIII消化的基因組DNA樣品，在經南方DNA雜交分析之處理後顯示出，在全部的泳道中均可被ipt與nptII探針二者檢測到大於4.4 kb之DNA片段，證明於該白三葉基因組中已存在以及整合入整段的T－DNA(第12圖)。基因轉殖株Hmi01、Imi06、Imi11以及Imi18(分別為泳道1、3、5、8以及12)顯露具有單一整段T－DNA的複製整合入該基因組中。其它基因轉殖株具有多份atmyb32：：ipt轉殖基因的複製。
範例4
基因轉殖白三葉植株中IPT 基因之表達 利用RT－PCR評估基因轉殖白三葉(T.repens)植株中atmyb32：：ipt轉殖基因之表達。於所有檢驗的atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉植株之葉組織中，檢測到該ipt mRNA，檢測到不同層度之PCR產物(第13圖)。
範例5
基因轉殖白三葉植株中分離葉之老化之延緩 進行實驗評估atmyb32：：ipt基因轉殖植株之分離葉之老化。培養1週內，從來自未轉形以及atmyb32：：gusA基因轉殖 白三葉植株二個栽培品種之分離葉中，觀察到快速的變黃。基因轉殖株Hmi01、Hmi08、Imi16以及Imi18顯示延緩老化，而Imi11與Imi12在7天結束時，沒有顯示變黃之現象。二個禮拜後，全部的atmyb32：：ipt基因轉殖植株之葉子均比未轉形以及atmyb32：：gusA對照組基因轉殖植株之葉子還綠(第14圖)。切離之葉子中老化之程度的順序為：海法(Haifa)品系，HC、Hmg>Hmi01>Hmi08，Irrigation品系，IC與Img>Imi16>Imi18>Imi11以及Imi12。HC係海法品系未轉形對照組，Hmg係海法品系atmyb32：：gusA對照組，IC係Irrigation品系未轉形對照組，Img係Irrigation品系atmyb32：：gusA對照組。Hmi01、Hmi08、Imi16、Imi18、Imi11以及Imi12係分別由栽培品種海法品系(H)與Irrigation品系(I)而來之獨立的atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉植株。
範例6
基因轉殖白三葉植株之植物形態以及根的生長 於atmyb32：ipt基因轉殖白三葉植株中觀察到正常的植物形態以及正常的幼芽與正常的根之生長(第6圖)，如此顯示出在atmyb32啟動子之控制下，ipt基因之規律的表達不會負面影響基因轉殖白三葉植株之生根以及頂芽優勢(表1)。
在10個經分析之獨立的atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉株中，觀察到正常的植物形態以及正常的生根。示出該10個獨立的atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉株之估計的ipt基因複製數。
範例7
產生供植物轉形之載體 已產生四個供用於土瓖桿菌屬(Agrobacterium)介導的植物轉形之雙元載體(第16－19圖)。每一個載體具有pPZP200載體骨架(Hajdukiewicz et al.,1994)以及在有或無嵌合35S：：nptII－35st或35S：：hph－35st選擇性標記盒之情況下，含有嵌合Atmyb32－900：：ipt－nos或Atmyb32－xs：：ipt－nos。
已建構一個供用於基因槍(biolistic)轉形之轉形載體(第20以及21圖)。該轉形載體含有嵌合Atmyb32－900：：ipt－35st，帶有嵌合Ubi：：bar－nos選擇性標記盒。
使用GatewayTM (Invitrogen)適應的引子，利用PCR擴大該Atmyb32啟動子、啟動子變異Atmyb32xs、該異戊烯基轉移酶基因以及終結子35st與nos，然後選殖入pDONR221中間載體(entry vectors)。此等之後使用重組而選殖進入含有慣用的選殖選擇性標記盒之目的載體(destination vectors)。所有的載體均採用嚴格的品質控制協定完全定序。
範例8
土瓖桿菌屬(Agrobacterium) 介導的加拿大芥花籽(canola)( 蔓菁(Brassica naPus)) 之轉形 使用含有在Atmyb32啟動子(第1圖)以及根特異性模體被刪除之Atmyb32xs變異啟動子序列(第2圖)控制下之嵌合ipt基因之雙元載體pBMVhATMYB3－900：：ipt－nos(第20圖)以及pBMVhATMYB32xs：：ipt－nos(第22圖)，進行土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的蔓菁下胚軸節之轉形(第26圖)。
於70%乙醇中對蔓菁種子之表面進行滅菌2分鐘，在無菌水中清洗3次，之後再於含有1%(w/v)次氯酸鈣以及0.1%(v/v)Tween 20之溶液中，進行表面滅菌30分鐘。在無菌水中清洗該等種子至少3次，然後種在120 ml含有固化萌芽培養基之培養容器中，該培養基含有1x Murashige and Skoog(Murashige and Skoog Physiol.Plant,15：473－497,1962)大量營養素、1x微量營養素以及B5有機維他命，補充有500 mg/L MES、2%(w/v)蔗糖，pH為5.8，添加4 g/L固化劑。將該等容器置於25℃，16小時亮/8小時暗之條件下培育7 天，以激發萌芽。
7天後，將蔓菁之幼苗(整個幼苗)轉移到含有1×Murashige and Skoog大量營養素、1×微量營養素以及B5有機維他命，補充有500 mg/L MES、3%(w/v)蔗糖，pH為5.8之液體培養基中。將幼苗聚集在一起，在將該下胚軸切成7－10 mm節段之前，移除根與子葉，然後種在9×1.5 cm含有預處理之培養基(由1x Murashige and Skoog大量營養素、1×微量營養素以及B5有機維他命所構成，補充有500 mg/L MES、3%(w/v)蔗糖，pH為5.8，以6.4 g/l Bacto－Agar固化)之培養皿中。
在接種土瓖桿菌屬懸浮液(OD600 ＝0.2，30分鐘，由1×Murashige and Skoog大量營養素、1×微量營養素以及B5有機維他命，補充有500 mg/LMES、100 μM乙酰丁香酮、3%(w/v)蔗糖，pH為5.8)之前，培育該下胚軸節段24個小時。
接種過後，將下胚軸節段在無菌紙巾上吸乾，然後轉移到9 x 1.5 cm培養皿(含有1×Murashige and Skoog大量營養素、1×微量營養素以及B5有機維他命，補充有500 mg/L MES、100 μM乙酰丁香酮、1 mg/L 2,4－D 3%(w/v)蔗糖，pH為5.8，以8 g/l Bacto－Agar固化)中。外植體在25℃，16小時亮/8小時暗之條件下，培育72個小時，進行共培育。
共培育後，將20－30個下胚軸外植體轉移至9×1.5 cm培養皿中(含有由下列構成之固化選擇培養基：1×Murashige and Skoog大量營養素、1x微量營養素以及B5有機維他命，補充有500 mg/L MES、1 mg/L 2,4－D 3%(w/v) 蔗糖，pH為5.8，以8g/l Bacto－Agar固化，補充有250 mg/l特美汀(timentin)以及10 mg/l潮黴素(hygromycin)，用以選擇潮黴素抗性幼芽)。令培養皿於25℃，16小時亮/8小時暗條件下培育。
7天後，將下胚軸外植體轉移到9×2.0cm培養皿中(由下列構成之固化再生培養基：1×Murashigeand Skoog大量營養素、1x微量營養素以及B5有機維他命，補充有500 mg/L MES、1 mg/L 2,4－D 3%(w/v)蔗糖，pH為5.8，以8g/l Bacto－Agar固化，補充有4 mg/l BAP、2 mg/l玉米素、5 mg/l硝酸銀、250 mg/l特美汀以及10 mg/l潮黴素)。令培養皿在直接螢光，25℃條件下(16小時亮/8小時暗光週期；55 μmol m－2 sec－1 )培育4週，促進幼芽之生長。
每週監控再生之情況，然後將下胚軸外植體轉移至新的9 X 2.0cm培養皿中(含有固化再生培養基，RM，補充有4 mg/l苯甲腺嘌呤、2mg/l玉米素、5 mg/l硝酸銀、250 mg/l特美汀以及10 mg/l潮黴素)，歷時6－8週，促進幼芽的生長。
將潮黴素抗性(Hygr )幼芽轉移至120 ml容器中(含有固化根誘導培養基，RIM1，由1x Murashige and Skoog大量營養素、1x微量營養素以及B5有機維他命構成，補充有500 mg/L MES、1 mg/L 2,4－D 1%(w/v)蔗糖，pH為5.8，以8 g/l Bacto－Agar固化，補充有250 mg/l特美汀)。在直接螢光，25℃(16小時亮/8小時暗光週期；55贡mol m－2 sec－1 )下培育幼芽，促進幼芽伸長以及根生長，歷時4－5週。將全部的幼芽以及根系統已長好之Hygr 幼芽轉移到土壤中，然後在溫室 中生長。
範例9
小麥(Triticum aestivum L.) 之基因槍轉形 使用含有在Atmyb32啟動子(第1圖)以及根特異性模體經刪除之Atmyb32xs變異啟動子序列(第2圖)控制下之嵌合ipt基因之轉形載體，進行基因槍轉形小麥(Triticum aestivum L.MPB Bobwhite 26)。代表性載體示於第24圖中。基因槍轉形小麥之程序概要，概述於第27圖。該轉形程序包括下列步驟：
步驟1 ( 供者植株之生產) ： 用小麥(Triticum aestivum)(Bobwhite 26)種子來生產供者植株材料。令小麥植株於由堆肥松樹皮、珍珠石以及蛭石構成之種苗混合物中成長，每個花盆有5株至最大為20 cm大小之花盆。將植株保持在將近22－24℃之溫室條件下，歷時12－16週(第28A圖)。一旦第一個穗從頂葉冒出來，則在植株上貼上標籤，且從開花期後12－15天之最高的頭狀花序採集胚芽。
步驟2 ( 第1 天) 收割在所欲之生長階段之穗(第28B圖)。將穎果從該穗上移除，然後表面於0.8%(v/v)NaOCl溶液中滅菌20分鐘，然後在無菌蒸餾水中至少清洗4次。
使用解剖顯微鏡，從每一穎果上以無菌方式切下高達10 mm長度之胚芽(移除主莖)，然後軸側向下在滲透性培養基(E3麥芽糖)(由2×Murashige and Skoog(1962)大量營養 素、1×微量營養素以及有機維他命、40 mg/L硫胺素、150 mg/L L－天門冬醯胺，補充有15%(w/v)麥芽糖、0.8%(w/v)Sigma瓊脂以及2.5 mg/L 2,4－D)上培養(第28C與D圖)。胚芽在具有15 mL培養基之60 mm×15 mm透明聚丙烯培養皿上培養。在轟擊之前，令培養盤在24℃下，黑暗中培育4個小時。使用BioRad PDS1000基因槍，以壓力900 psi以及距離6 cm，1 μg之載體質粒DNA沈澱於0.6 μm黃金粒子上，轟擊胚芽。轟擊過後，令胚芽於暗處滲透性培養基中培育一整夜。
步驟3 ( 第2 天) ： 將胚芽轉移至癒傷組織誘發液(E3calli)(由2x Murashige and Skoog(1962)大量營養素以及1x微量營養素以及有機維他命、40 mg/L硫胺素、150 mg/L L－天門醯胺，補充有6%(w/v)蔗糖、0.8%(w/v)Sigma瓊脂以及2.5 mg/L 2,4－D構成)中。令胚胎在黑暗中，24℃下培養2週。
步驟4 ( 第16 天) ： 在E3calli中培養2週後，胚胎已產生胚性癒傷組織，然後次培養於選擇性培養基(E3Select)(由2x Murashige and Skoog(1962)大量營養素以及1x微量營養素以及有機維他命、40 mg/L硫胺素、150 mg/L L－天門冬醯胺，補充有2%(w/v)蔗糖、0.8%(w/v)Sigma瓊脂、5 mg/L of D,L草胺膦(PPT)以及無植物成長調節劑)上(第28E－G圖)。令培養物在E3Select上，24℃光線下，12小時光週期，再培育14天。
步驟5 ( 第30 天) ： 在E3Select上培養14天後，令胚性癒傷組織再次於新的E3Select中培養14天(第28E－G圖)。
步驟6 ( 第44 天) ： 在E3Select上培養約4週後，將生長中之幼苗從胚性癒傷組織主體上割下來，然後在含有根誘導培養基(RM)之65 mm×80 mm或65 mm×150 mm聚碳酸酯組織培養管中生長3週。根誘導培養基係由1×Murashige and Skoog(1962)大量營養素、微量營養素以及有機維他命、40 mg/L硫胺素、150 mg/L L－天門冬醯胺所構成，補充有2%(w/v)蔗糖、0.8%(w/v)Sigma瓊脂以及5 mg/L之PPT(第28H圖)。剩餘的胚性癒傷組織再次於E3Select中次培養14天。
步驟7 ( 第65 ＋天) ： 將在RM上活超過3週，具健康的根形成之再生的幼苗栽在種苗混合物(由泥炭與沙(1：1)構成)中，然後保持在22－24℃增濕苗圃室系統中(第28圖)。2週後，將植株從增濕室中移出，手動澆水，每週給予液態AquasolTM 直到成熟。以T0 植株作為基因組DNA以及分子分析之樣本。收集與種植T1 種子，以供進行高通量Q－PCR分析(第28J圖)。
範例10
基因轉殖白三葉植株之農藝性狀表現 在環境控制的生長室內條件下以及於隔離的田間試驗中，評估相對於非基因轉殖對照組白三葉植株，該atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉(Trifolium repens)植株之農藝性狀表現(第29圖)。
在控制的成長室條件下評估之表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株，在與非基因轉殖對照組白三葉植株相較之下，顯示出生物量累積顯著的提高，以及老化之表現減少(第30圖)。與非基因轉殖對照組白三葉植株相比，該表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株顯示出總葉面積提高、累積葉面積增加、較高的葉生長動力學(即，隨時間增加之葉的數目)、較長的匍匐莖長度以及開花植株%增加，以及匍匐莖老化與死亡減少(第30A－C圖)。
亦在隔離的田間條件下，評估與非基因轉殖對照組(即，野生型，WT)相比，3個表達atmyb32：：ipt之獨立的基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12、LXR 18以及LXR 11)之種子產量之表現。選擇2個開花密度(即每m2 之成熟花之數目)難與非基因轉殖對照組植株(即WT)區別之表達atmyb32：：ipt之獨立的基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12以及LXR 18)，進行田間評估(第31圖)。
雖然表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12、LXR 18以及LXR 11)之種子重量(即，一千個種子之重量)難與非基因轉殖對照組白三葉植株(即，WT)區別(第32圖)，但在每一朵花(第33圖)以及每播種區域(第34圖)為基礎上表現之總種子產率，當與相當的開花密度之非基因轉殖對照組白三葉植株相比，表達嵌合Aimyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12以及LXR 18)之產率為2倍。
範例11
紫花苜蓿(Medicago sativa) 之土瓖桿菌屬介導的轉形 使用含有在根特異性模體經刪除之Atmyb32xs變異啟動子序列(第2圖)控制下之嵌合ipt基因之雙元載體pBMVkATMYB32xs：：ipt－nos(第18圖)，進行土壤桿菌屬介導的轉形從高度可再生之紫花苜蓿(M.sativa)選殖株C2－3、C2－4以及19－17而來之紫花苜蓿(Medicago sativa)莖外植體(第35圖)。
在與帶有雙元載體pBMVkATMYB32xs：：ipt－nos之根瘤土瓖桿菌株LBA 4404共同培養後，用含西弗士林(cefotaxime)之培養基清洗該紫花苜蓿外植體，然後在含25 mg/l卡那黴素(kanamycin)之選擇性培養基下誘發胚性癒傷組織。使基因轉殖肧性紫花苜蓿癒傷組織恢復，然後使其再生出基因轉殖紫花苜蓿幼芽，將其轉移至生根培養基上，使表達在Atmyb32xs變異啟動子控制下之嵌合ipt基因之基因轉殖紫花苜蓿植株得以恢復(第35圖)。
應了解，在此說明書中揭示以及定義之本發明，延伸至二或多個內文或圖式所提及或證明之個別特徵之所有選擇性組合。所有此等不同的組合構成本發明之各種選擇性態樣。
範例12
基因轉殖加拿大芥花籽(canola) 植株之產生 基因轉殖加拿大芥花籽植株(Brassica napus)，係使用帶有嵌合atmyb32：：ipt基因之雙元載體(第20以及22圖)進行 土瓖桿菌屬介導的轉形而產生。使用PCR，在T1 世代上已描繪出該基因修飾之特徵為存在候選基因(IPT)或選擇性標記(hph)(第36圖)。
第36圖說明基因轉殖加拿大芥花籽植株之PCR分析。 從T1 LXR04株之不同基因轉殖加拿大芥花籽植株中，分離出基因組DNA，然後使用對該選擇性標記(hph基因)或該有興趣之候選基因(IPT)具特異性之引子進行PCR。於第36A圖中，hph特異性引子係用於擴大從基因組DNA而來之產物，然後於瓊脂糖凝膠上顯現。第36B圖顯示使用螢光PCR方法，使用IPT特異性引子擴大基因組DNA。該引子對標的序列具有特異性，其產生可偵測之螢光，其與累積之PCR產物呈反比。
範例13
基因轉殖加拿大芥花籽(canola) 植株中IPT 基因之表達 使用對該標的序列具特異性之螢光RT－PCR方法，評估基因轉殖加拿大芥花籽中atmyb32：：ipt轉殖基因之表達(第37圖)。檢測組織中之IPT mRNA，以及比較植株之間以及與空白對照組間之相對的表達位準。空白對照組係已進行轉形程序，但在雜交後不含標的序列之後代株。
範例14
基因轉殖加拿大芥花籽(canola) 植株中分離的葉老化之延緩 進行實驗以評估atmyb32：：ipt基因轉殖植株之分離的葉之老化。第38圖至第41圖指出與加拿大芥花籽中候選基因之表達有關聯之分離的老化分析數據。進行分離的子葉以 及葉子之分析，引起老化以及評估轉形的加拿大芥花籽相較於野生對照組之老化表現型。在分離的老化分析之第7天以及第14天，從品質上來講，針對每一組織樣本之老化進展記分，從0－無可能的老化現象；1－最早可見的老化現象，綠色變淺；2－進一步老化，顏色變黃之現象變得顯著；3－組織顏色幾乎變黃，然而淡綠色仍然明顯；4－進展至顏色完全變黃；5－黃色，具有一些變白以及黑斑(第39圖以及第41圖)。
範例15
基因轉殖小麥植株之產生 小麥之基因轉形係如在第27與28圖中之概述，以基因槍轉形來自Triticum aestivum L Bobwhite 26小麥株之合子胚為基礎。
使用整個質體，藉由粒子轟擊，將嵌合atmyb32：：ipt基因插入小麥基因組中，如此載體骨架序列亦可併入該基因組中(第24圖)。
轉形載體已經完全定序(第25圖)。藉由在T1 世代上之南方分析，該基因修飾之特徵為存在候選基因(第42圖)。
第42圖說明基因轉殖小麥植株之南方雜交分析。從基因轉殖小麥植株之不同的T1 株分離出基因組DNA，然後用限制酵素消化，決定候選基因複製數。對照組係未轉形的野生Triticum aestivum‘Bobwhite 26’。對消化物進行電泳，轉移至尼龍膜，用整段DIG標誌的IPT基因作為探針探查。觀察到一系列的複數。
範例16
基因轉殖小麥植株中IPT 基因之表達 從在溫室中生長，含有由AtMYB32啟動子驅動之IPT基因之基因轉殖T1 小麥植株之幼葉組織中萃取出RNA，然後製得第一股cDNA。
使用針對標的序列之探針為主的qRT－PCR方法，決定轉殖基因之表達數量。該等構築質體中每一個之高、中以及低表達株之代表性例子，呈現於第43圖中。針對內源性蔗糖合成酶基因設計之引子/探針組，亦可用作為對照組。由於表達之變異，從一個週期內開始之對照組基因之擴大標繪圖，彼此在檢測GMOs之層度上指出差異。
該PCR引子以及探針均對該標的序例具特異性，其產生可偵測的螢光，其與累積的PCR產物之數量成正比。使用含有欲偵測之標的序列之連續稀釋的質體DNA，製造供定量之標準曲線。
範例17
基因轉殖小麥植株之植物形態 在溫室中，於基因轉殖小麥株間觀察到生長特徵之差異。在T1 小麥植株間觀察到之顯著的表現型，包括植物高度矮小、分蘗密度、葉子數目以及植物生長之生物量(第44圖)。
範例18
基因轉殖小麥植株之分離葉老化之延緩 使用分離葉分析來評估相較於空白對照組，基因轉殖 小麥葉被誘導之老化以及老化表現型(第45圖)。空白對照組係已進行轉形程序，但在雜交後不含標的序列之後代株。
應了解，在此說明書中所使用之術語“包含(comprises)”(或其文法上之變化)與術語“包括(includes)”相等，不應被用來排除其它元素或特徵之存在。
於此說明書中引述之文件僅供參考目的，且不能確認其等之內容形成相關技藝之通用知識之部分。
最後，需了解，各種改變、修飾和/或附加部分，可在不逸離本發明在此所概述之技術思想之範疇之情況下製得。
第1圖顯示從阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)而來之myb32基因(atmyb32)之啟動子之核苷酸序列(序列辨識編號：1)，帶有特別強調MYB類型、花粉特異性以及根特異性模體(motif)之Atmyb32啟動子序列。WAACCA(下面標線/斜體 )MYB1AT；GTTAGTTMYB1LEPR；CCWACCMYBPZM；GGATA(斜體)MYBST1；AGAAA(下面標線 )POLLEN1LELAT52；ATATT(粗體)ROOTMOTIFTAPOX1。
第2圖顯示具有XcmI－SspI植物序列被刪除之Atmyb32啟動子序列變異體(Atmyb32xs)。特別強調MYB類型、花粉特異性以及根特異性模體(motif) 。 WAACCA(下面標線/斜體 )MYB1AT；GTTAGTTMYB1LEPR；CCWACCMYBPZM；AGAAA(下面標 線 )POLLEN1LELAT52；ATATT(粗體)ROOTMOTIFTAPOX1(序列辨識編號：2)。
第3圖顯示具有全部根模體(motif)均被刪除之Atmyb32啟動子變異序列。特別強調MYB類型、花粉特異性以及根特異性模體。WAACCA(下面標線/斜體 )MYB1AT；CCWACCMYBPZM；AGAAA(下面標線 )POLLEN1LELAT52(序列辨識編號：3)。
第4圖顯示具有SspI位置上游序列被刪除之Atmyb32啟動子變異序列。特別強調MYB類型、花粉特異性以及根特異性模體(motif)。WAACCA(下面標線/斜體 )MYB1AT；CCWACCMYBPZM；AGAAA(下面標線 )POLLEN1LELAT52(序列辨識編號：4)。
第5圖顯示Atmyb32以及Atmyb32xs啟動子序列中之模體(motif)。
第6圖顯示從根瘤土瓖桿菌(Agrobacterium tumefaciens)而來之異戊烯基轉移酶(ipt)基因之核苷酸序列(序列辨識編號：5)。
第7圖顯示從根瘤土瓖桿菌(Agrobacterium tumefaciens)而來之異戊烯基轉移酶基因推論而得之胺基酸序列(序列辨識編號：6)。
第8圖顯示從百脈根(Lotus japonicus)而來之異戊烯基轉移酶基因之核苷酸序列(序列辨識編號：7)。
第9圖顯示從百脈根(Lotus japonicus)而來之異戊烯基轉移酶基因推論而得之胺基酸序列(序列辨識編號：8)。
第10圖顯示從矮牽牛(Petunia hybrida)而來之細胞分裂素生合成Sho基因之核苷酸序列(序列辨識編號：9)。
第11圖顯示從矮牽牛(Petunia hybrida)而來之細胞分裂素生合成Sho基因推論而得之胺基酸序列(序列辨識編號：10)。
第12圖顯示atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉(Trifolium repens)植株之PCR以及南方DNA分析。a)patmyb32：ipt之T－DNA區域，顯示供用於南方雜交分析之限制酵素位置以及探針之位址。b)經PCR擴大之599 bp nptII以及583 bp ipt產物之溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠。c)從PCR陽性白三葉植株分離而來之總基因組DNA，經HindIII消化後，以該ipt探針雜交之南方墨點雜交圖。d)從PCR陽性白三葉植株分離而來之總基因組DNA，經HindIII消化後，以該nptII探針雜交之南方墨點雜交圖。泳道1－2：2個獨立的卡那黴素(kanamycin)抗性Haifa品系再生物，代號：分別為Hmi01、Hmi08：泳道3－12：12個獨立的卡那黴素抗性Irrigation品系再生物，代號：分別為Imi06、Imi07、Imi08、Imi09、Imi10、Imi11、Imi12、Imi14、Imi16、Imi18；泳道C：未轉形的白三葉；泳道P：陽性對照組質體patmyb32ipt。
第13圖顯示atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉(T.repens)植株中ipt mRNA表達之RT－PCR分析。泳道1－11係來自11個獨立的基因轉殖株之樣本，具有如第4.8圖之對應的植株代號；泳道C，對照組未轉形的植株；泳道P，作為陽性對照組之質體。從葉組織中分離出全部的RNA。使用全部的RNA (13 μg)供用於每一個逆轉錄反應，且利用PCR擴大1/5的RT產物。右邊凝膠上之DNA產物係利用2X 30週期密集PCR擴大。於載負於間隔泳道上之對應的RT－PCR反應中，沒有添加逆轉錄酶。
第14圖顯示從atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉(T.repens)植株切離之葉子之老化生物分析。從每一植株之匍匐莖上相似位置處收集至少30個葉子。A.變黃的葉子之數目係切離的葉子總數之分數。B.保持在水上，光照射2週後之典型的外觀。植株之代號：HC、IC以及Hmg、Img，分別為未轉形以及atmyb32：：gusA基因轉殖植株(Haifa品系以及Irrigation品系)；01以及08，分別為atmyb32：：ipt基因轉殖Haifa株Hmi01以及Hmi08；11、12、16以及18分別為atmyb32：：ipt基因轉殖Irrigation株Imi11、Imi12、Imi16以及Imi18。
第15圖顯示A)一般植物形態，B)正常幼芽之生長以及C)atmyb32：：ipt基因轉殖白三葉(T.repens)(右圖)植株與對照組植株(左圖)相比較之正常根之生長。
第16圖顯示有關pBMVkAtMYB32－900：：ipt之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體：pBMVkAtMYB32－900：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標記：spec；植物選擇性標記盒：35S：：kan：：35ST；基因啟動子：AtMYB32－900；基因終結子：nos]。
第17圖顯示載體pBMVkAtMYB32－900：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：11)。
第18圖顯示有關pBMVkAtMYB32xs：：ipt－nos之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體：pBMVkAtMYB32XS：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標記：spec；植物選擇性標記盒：355：：kan：：35ST；基因啟動子：AtMYB32－xs；基因終結子：nos]。
第19圖顯示載體pBMVkAtMYB32xs：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：12)。
第20圖顯示有關pBMVhAtMYB32－900：：ipt－nos之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體：pBMVhAtMYB32－900：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標記：spec；植物選擇性標記盒：35S：：hph：：3SST；基因啟動子：AtMYB32－900；基因終結子：nos]。
第21圖顯示載體pBMVhAtMYB32－900：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：13)。
第22圖顯示有關pBMVhAtMYB32xs：：ipt－nos之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體：pBMVhAtMYB32XS：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標記：spec；植物選擇性標記盒：35S：：hph：：35ST；基因啟動子：AtMYB32－xs；基因終結子：nos]。
第23圖顯示載體pBMVhAtMYB32xs：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：14)。
第24圖顯示有關pBSubn－AtMYB32－900：：ipt－nos之載體細節[基因：異戊烯基轉移酶(IPT)；載體：pBSubn－AtMYB32－900：：ipt－nos(骨架pPZPRCS2)；選擇性標 記：spec；植物選擇性標記盒：Ubi：：bar：：nos；基因啟動子：AtMYB32－900；基因終結子：nos]。
第25圖顯示有關載體pBSAtMYB32900：：ipt－nos之核苷酸序列(序列辨識編號：15)。
第26圖顯示含有pBMVhATMYB3－900：：ipt－nos以及pBMVhATMYB32xs：：ipt－nos之基因轉殖加拿大芥花籽(canola)之產生。A.加拿大芥花籽於試管內生長；B.從7天大幼苗上切離下胚軸節段，然後接種土瓖桿菌屬(Agrobacterium)懸浮液；C與D.經接種的下胚軸節段在潮黴素(hygromycin)選擇下之再生；E－J.帶有pBMVhATMYB3－900：：ipt－nos與pBMVhATMYB32xs：：ipt－nos載體之基因轉殖T0 加拿大芥花籽植株。
第27圖顯示基因槍轉形小麥之方法。
第28圖顯示小麥(Triticum aestivum L.MPB Bobwhite 26)之基因槍轉形。供體植株之生產(A與B)；合子胚之分離(C與D)；草胺膦(glufosinate)選擇下之再生(E－G)；選擇下根之形成(H)；在供基因轉殖後代復元之隔離的溫室條件下生長之T0 植株(I)。
第29圖顯示表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株之隔離的田間試驗。
第30圖顯示表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株與非基因轉殖對照組白三葉植株之生長速率以及生長動力學之比較性評估。A)生長速率B)生長動力學C)生長特徵(45天後)。
第31圖顯示在隔離的田間條件下，表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12、LXR 18以及LXR 11)以及非基因轉殖對照組白三葉植株(即WT)之開花強度(即，每m2 成熟花之數目)。
第32圖顯示在隔離的田間條件下，表達嵌合Aimyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR12、LXR 18以及LXR 11)以及非基因轉殖白三葉植株(即，WT)之種子重量(即，一千個種子之重量，單位克)。
第33圖顯示在隔離的田間條件下，表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12、LXR 18以及LXR 11)以及非基因轉殖白三葉植株(即，WT)之每朵花之種子產率(毫克)。
第34圖顯示在隔離的田間條件下，表達嵌合Atmyb32：：ipt基因之基因轉殖白三葉植株(即，LXR 12、LXR 18以及LXR 11)以及非基因轉殖白三葉植株(即，WT)之每區域之種子產率(單位kg/ha)。
第35圖顯示含有嵌合pBMVkATMYB3－900：：ipt－nos以及pBMVkATMYB32xs：：ipt－nos基因之基因轉殖紫花苜蓿植株之生殖。A.使用從紫花苜蓿選殖株C2－3、C2－4以及19－17而來之葉柄外植體，用於以土瓖桿菌屬(Agrobacterium)懸浮液接種，誘使在卡那黴素(kanamycin)之存在下進行選擇後，產生轉形的胚性癒傷組織；B－D.帶有從 pBMVkATMYB3－900：：ipt－nos與pBMVkATMYB32xs：：ipt－nos載體而來之嵌合基因之基因轉殖紫花苜蓿幼苗，從在試管內生長之體細胞胚中新生出來。
第36圖顯示基因轉殖加拿大芥花籽(canola)植株之PCR分析(T1 LXR加拿大芥花籽植株4)。從不同的加拿大芥花籽植株T1 LXR04植株中分離出基因組DNA，然後使用對A.選擇性標記(hph)或B.有興趣之候選基因(IPT)具特異性之引子進行PCR。
第37圖顯示於T1 基因轉殖加拿大芥花籽(canola)植株中，IPT基因之表達分析(T1 LXR加拿大芥花籽相對的IPT葉子之表達)。
第38圖顯示基因轉殖加拿大芥花籽(canola)之切離的子葉，在分離後7天，相較於野生對照組子葉，表現出老化延緩。
第39圖顯示T1 基因轉殖加拿大芥花籽(canola)之子葉，在分離7天後之老化計分。0＝無明顯的老化1＝淡綠色2＝一些變黃3＝大部分變黃4＝完全變黃
第40圖顯示與野生對照組幼苗相比，切離的幼苗在分離後14天，表現出老化延緩之基因轉殖加拿大芥花籽(canola)。
第41圖顯示T1 基因轉殖加拿大芥花籽(canola)之幼苗第一葉，在分離14天後之老化計分。0＝無明顯的老化1＝淡綠色2＝一些變黃3＝大部分變黃4＝完全變黃5＝腐爛/壞死
第42圖顯示基因轉殖小麥株之南方雜交分析。泳道包括：MW－分子量；WT－野生型；基因轉殖小麥株LXR3、LXR4、LXR13、LXR16以及含10與20 pg之陽性質體對照組。
第43圖顯示獨立的T1 基因轉殖小麥株之表達分析(小麥中之IPT定量表達)。使用從含有標的序列之質體DNA推論而得之標準曲線，決定轉錄值之量，單位：毫微微莫耳(fmol)/微克。樣品表現候選基因IPT之高、中以及低表達等級。
第44圖顯示溫室中生長之T1 基因轉殖小麥植株之表現型差異。A.與空白對照組小麥植株相比，T1 LXR 13小麥植株表現正常表現型態。B.與空白對照組小麥植株相比，T1 LXR 04小麥植株表現長得矮小之表現型以及旗葉數目增加。
第45圖顯示在分離7天後，與空白對照組之葉子相比，基因轉殖小麥展現出葉之老化延緩。
<110> Agriculture Victoria Services Pty Ltd La Trobe University Spangenberg,German Ramage,Carl M Palviainen,Melissa A Parish,Roger W Heazlewood,Joshua <120> 使用經修飾的啟動子之植物老化操縱技術<130> 81161129 <140> 11/789,526 <141> 2007－04－24 <150> US 10/363723 <151> 2001－08－30 <160> 15 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 941 <212> DNA <213> 阿拉伯芥<400> 1<210> 2 <211> 588 <212> DNA <213> 阿拉伯芥<400> 2 <210> 3 <211> 468 <212> DNA <213> 阿拉伯芥<400> 3<210> 4 <211> 419 <212> DNA <213> 阿拉伯芥<400> 4<210> 5 <211> 723 <212> DNA <213> 根瘤土瓖桿菌<400> 5 <210> 6 <211> 240 <212> PRT <213> 根瘤土瓖桿菌<400> 6 <210> 7 <211> 975 <212> DNA <213> 百脈根<400> 7<210> 8 <211> 324 <212> PRT <213> 百脈根<400> 8 <210> 9 <211> 1053 <212> DNA <213> 矮牽牛<400> 9 <210> 10 <211> 350 <212> PRT <213> 矮牽牛<400> 10 <210> 11 <211> 10786 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> 合成構築質體<400> 11 <210> 12 <211> 10468 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> 合成的構築質體<400> 12 <210> 13 <211> 11000 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> 合成的構築質體<400> 13 <210> 14 <211> 10682 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> 合成的構築質體<400> 14 <210> 15 <211> 7862 <212> DNA <213> 人工的<220> <223> 合成的構築質體<400> 15

Claims (32)

  1. 一種操縱植物老化之方法，該方法包括於該植物中引入一基因構築質體(genetic construct)，該基因構築質體包括一經修飾的myb基因啟動子，其可操作地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體，該myb基因啟動子含有一如序列辨識編號：1所示之核苷酸序列或其功能活性片段或變異體，其中該myb基因啟動子被修飾成刪除或失活下列模體(motif)：(a)一或多種根特異性模體，其中該根特異性模體中之每一個包含一致序列ATATT或AATAT；或者(b)一或多種花粉特異性模體，其中該花粉特異性模體中之每一個包含一致序列TTCT或AGAA。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等功能活性片段與變異體對於該片段或變異體對應之序列辨識編號：1之部分具有至少95%之一致性，且具有至少300個核苷酸之大小。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於該myb基因啟動子中，有1至10個之間的根特異性模體係被刪除或去活化。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於該myb基因啟動子中，有3至8個之間的根特異性模體係被刪除或去活化。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於該myb基因啟動子中，有5至7個之間的根特異性模體係被刪除或去活化。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於該myb基因啟動子 中，有1至30個之間的花粉特異性模體係被刪除或去活化。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於該myb基因啟動子中，有3至15個之間的花粉特異性模體係被刪除或去活化。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中於該myb基因啟動子中，有4至10個之間的花粉特異性模體係被刪除或去活化。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該經修飾的myb基因啟動子包括一選自於由下列所構成之群組之核苷酸序列：序列辨識編號：2、3與4，以及其功能活性片段與變異體。
  10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該等功能活性片段與變異體對於該片段或變異體對應之序列辨識編號：2、3或4之部分具有至少95%之一致性，且具有至少300個核苷酸之大小。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因係異戊烯基轉移酶(ipt)基因或其功能活性片段或變異體。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因，包括一選自於由下列所構成之群組之核苷酸序列：序列辨識編號：5、7與9、編碼具有序列辨識編號：6、8與10之序列之多肽之序列，以及其功能活性片段與變異體。
  13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該基因構築質體係經由土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的或基因槍轉形(biolistic transformation)植物細胞，而引入該植物中。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中挑選併入該基因構築質體之植物細胞，之後進行培養使再生出經轉形的植物。
  15. 一種能夠操縱植物老化之載體，該載體包括一經修飾的myb基因啟動子，其可操作地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體，該myb基因啟動子含有一如序列辨識編號：1所示之核苷酸序列或其功能活性片段或變異體，其中該myb基因啟動子被修飾成刪除或去活化下列模體：(a)一或多種根特異性模體，其中該根特異性模體中之每一個包含一致序列ATATT或AATAT；或者(b)一或多種花粉特異性模體，其中該花粉特異性模體中之每一個包含一致序列TTCT或AGAA。
  16. 如申請專利範圍第15項之載體，其進一步包括一終結子；該啟動子、基因以及終結子係可操作地連接的。
  17. 如申請專利範圍第15項之載體，其中該等功能活性片段與變異體對於該片段或變異體對應之序列辨識編號：1之部分具有至少95%之一致性，且具有至少300個核苷酸之大小。
  18. 如申請專利範圍第15項之載體，其中於該myb基因啟動子中，有1至10個之間的根特異性模體係被刪除或去活 化。
  19. 如申請專利範圍第15項之載體，其中於該myb基因啟動子中，有3至8個之間的根特異性模體係被刪除或去活化。
  20. 如申請專利範圍第15項之載體，其中於該myb基因啟動子中，有5至7個之間的根特異性模體係被刪除或去活化。
  21. 如申請專利範圍第15項之載體，其中於該myb基因啟動子中，有1至30個之間的花粉特異性模體係被刪除或去活化。
  22. 如申請專利範圍第15項之載體，其中於該myb基因啟動子中，有3至15個之間的花粉特異性模體係被刪除或去活化。
  23. 如申請專利範圍第15項之載體，其中於該myb基因啟動子中，有4至10個之間的花粉特異性模體係被刪除或去活化。
  24. 如申請專利範圍第15項之載體，其中該經修飾的myb基因啟動子包括一選自於由下列所構成之群組之核苷酸序列：序列辨識編號：2、3與4，以及其功能活性片段與變異體。
  25. 如申請專利範圍第24項之載體，其中該等功能活性片段與變異體對於該片段或變異體對應之序列辨識編號：2、3或4之部分具有至少95%之一致性，且具有至少300個核苷酸之大小。
  26. 如申請專利範圍第15項之載體，其中該編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因係異戊烯基轉移酶(ipt)基因或其功能活性片段或變異體。
  27. 如申請專利範圍第26項之載體，其中該編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因包括一選自於由下列所構成之群組之核苷酸序列：序列辨識編號：5、7與9以及編碼具有序列辨識編號：6、8與10之序列之多肽之序列。
  28. 一種具有經修飾的老化特徵之基因轉殖植物細胞，該植物細胞包括一基因構築質體，該基因構築質體包括一經修飾的myb基因啟動子，其可操作地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體，該myb基因啟動子含有一如序列辨識編號：1所示之核苷酸序列或其功能活性片段或變異體，其中該myb基因啟動子被修飾成刪除或失活下列模體：(a)一或多種根特異性模體，其中該根特異性模體中之每一個包含一致序列ATATT或AATAT；或者(b)一或多種花粉特異性模體，其中該花粉特異性模體中之每一個包含一致序列TTCT或AGAA。
  29. 如申請專利範圍第28項之基因轉殖植物細胞，其係藉由下列方法產生，該方法包括於該植物細胞中引入一基因構築質體，該基因構築質體包括一經修飾的myb基因啟動子，其可操作地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體，該myb基因啟動子含有一如序列辨識編號：1所示之核苷酸序列或 其功能活性片段或變異體，其中該myb基因啟動子被修飾成刪除或失活下列模體：(a)一或多種根特異性模體，其中該根特異性模體中之每一個包含一致序列ATATT或AATAT；或者(b)一或多種花粉特異性模體，其中該花粉特異性模體中之每一個包含一致序列TTCT或AGAA。
  30. 一種操縱植物老化之方法，該方法包括於該植物中引入一基因構築質體，該基因構築質體包括一經修飾的myb基因啟動子，該myb基因啟動子含有一如序列辨識編號：1所示之核苷酸序列，該經修飾的myb基因啟動子具有1至10個之間的根特異性模體(motifs)被刪除或去活化，該根特異性模體具有一致序列ATATT或AATAT，或者，該經修飾的myb基因啟動子具有1至30個之間的花粉特異性模體係被刪除或去活化，該花粉特異性模體具有一致序列TTCT或AGAA；該經修飾的myb基因啟動子係可操作地連接至ipt或sho基因。
  31. 一種提高植物之生物量之方法，該方法包括於該植物中引入一基因構築質體，該基因構築質體包括一經修飾的myb基因啟動子，其可操作地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體，該myb基因啟動子含有一如序列辨識編號：1所示之核苷酸序列或其功能活性片段或變異體，其中該myb基因啟動子被修飾成刪除或失活下列模體：(a)一或多種根特異性模體，其中該根特異性模體中之 每一個包含一致序列ATATT或AATAT；或者(b)一或多種花粉特異性模體，其中該花粉特異性模體中之每一個包含一致序列TTCT或AGAA。
  32. 一種能夠提高植物之生物量之載體，該載體包括一經修飾的myb基因啟動子，其可操作地連接至一編碼涉及細胞分裂素生合成之酵素之基因或其功能活性片段或變異體，該myb基因啟動子含有一如序列辨識編號：1所示之核苷酸序列或其功能活性片段或變異體，其中該myb基因啟動子被修飾成刪除或失活下列模體：(a)一或多種根特異性模體，其中該根特異性模體中之每一個包含一致序列ATATT或AATAT；或者(b)一或多種花粉特異性模體，其中該花粉特異性模體中之每一個包含一致序列TTCT或AGAA。
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