ES2496893T3 - Manipulación de la senescencia vegetal mediante promotores modificados - Google Patents

Abstract

Un método para manipular la senescencia en una planta, incluyendo dicho método introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº: 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos, en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar: (a) uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o (b) uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

Description

Manipulación de la senescencia vegetal mediante promotores modificados

La presente invención se refiere a métodos para manipular la senescencia en plantas. La invención también se refiere a vectores de utilidad en dichos métodos, plantas transformadas con características de senescencia modificadas y células vegetales, semillas y otras partes de dichas plantas.

La senescencia de la hoja incluye cambios metabólicos y estructurales de las células antes de la muerte celular. También incluye el reciclado de nutrientes hacia las regiones de crecimiento activo.

La regulación de la senescencia de plantas y órganos de plantas por citoquininas tiene importantes consecuencias agrícolas. Los niveles elevados de citoquininas en hojas tienden a retardar la senescencia. Se han usado numerosos promotores para regular la expresión del gen ipt, cuyo producto (isopenteniltransferasa) cataliza una etapa clave en la síntesis de citoquininas. Sin embargo, en general, se ha informado que las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen ipt tienen retraso de crecimiento de raíces y brotes, sin formación de raíces, reducida dominancia apical y reducida superficie de la hoja.

Los documentos WO 02/20772 A1, Lin et al. (2003) Plant Science 165(6):1437-1444, Kranz et al. (1998) Plant Journal 16(2):263-276, y WO 1996/29858 A1 se refieren a la modificación de la senescencia vegetal por expresión génica, sin embargo se distinguen de la presente invención, entre otros, por el promotor empleado. Li et al. (1996) FEBS Letters 379:117-121 y Sidorenko et al. (2000) Plant Journal 22(6):471-482 describen promotores del gen myb diferentes del de la presente invención.

Un objetivo de la presente invención consiste en superar o al menos aliviar una o más de las dificultades o deficiencias asociadas en la técnica previa.

La invención puede definirse por las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la presente invención provee un método para manipular la senescencia en una planta de acuerdo con la reivindicación 1, incluyendo dicho método introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado de gen myb o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo.

La manipulación de la senescencia se refiere a la planta y/o órganos vegetales específicos. Se puede manipular la senescencia de diferentes órganos vegetales, tales como hojas, raíces, brotes, tallos, tubérculos, flores, estolones y frutas. La manipulación de la senescencia de plantas y de órganos de plantas puede tener importantes consecuencias agrícolas, tales como aumento de la vida de depósito por ejemplo de frutas, flores, hojas y tubérculos en productos hortícolas y flores cortadas, reducción del perecimiento de cultivos hortícolas, aumento de la fijación de carbono en hojas con senescencia retardada que conducen a aumento de los rendimientos, aumento de la producción de biomasa en plantas forrajeras, aumento de la producción de semillas, etc.

“Manipulación de la senescencia” se refiere en general a retrasar la senescencia en la planta transformada respecto de una planta control no transformada. Sin embargo, para algunas aplicaciones puede ser deseable promover o de otro modo modificar la senescencia en la planta. La senescencia se puede promover o de otro modo modificar por ejemplo, mediante la utilización de un gen antisentido.

Una cantidad efectiva de dicha construcción génica se puede introducir en dicha planta por cualquier técnica adecuada, por ejemplo por transducción, transfección o transformación. Por “una cantidad efectiva” se entiende una cantidad suficiente para dar un rasgo fenotípico identificable en dicha planta o una planta, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de ella. Dichas cantidades pueden ser determinadas con facilidad por las personas con la pericia correspondiente, si se tiene en cuenta el tipo de planta, la vía de administración y otros factores relevantes. Dicha persona podrá fácilmente determinar una cantidad y un método de administración adecuados. Ver, por ejemplo, Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, cuya descripción total se incorpora en la presente por referencia.

Por “promotor de gen modificado myb” se entiende un promotor asociado normalmente con un gen myb, en donde el promotor está modificado para eliminar o inactivar uno o más motivos específicos de raíz y/o motivos específicos de polen en dicho promotor.

Si bien el solicitante no desea estar restringido por la teoría, se postula que la eliminación o la inactivación de uno o más motivos específicos de raíz de dicho promotor de gen myb puede aliviar o superar el problema de filtración de la expresión del gen que codifica una enzima de biosíntesis de citoquinina en los meristemas vegetales, lo cual puede afectar el desarrollo de la raíz en algunas especies de plantas. También se postula que la eliminación o la inactivación de uno o más motivos específicos de polen de dicho promotor de gen myb pueden aliviar o superar el

problema de filtración de la expresión del gen que codifica una enzima de biosíntesis de citoquinina en polen, lo cual puede afectar el desarrollo del polen en algunas especies de plantas.

Preferentemente el promotor modificado de gen myb es un promotor modificado de gen myb32. Preferentemente el 5 promotor modificado de gen myb proviene de Arabidopsis, más preferentemente Arabidopsis thaliana.

Un promotor adecuado que se puede modificar de acuerdo con la presente invención se describe en Li et al., Cloning of three MYB-like genes from Arabidopsis (PGR 99-138) Plant Physiology 121:313 (1999).

10 Por “motivo específico de raíz” se entiende una secuencia de 3-7 nucleótidos, de preferencia 4-6 nucleótidos, con mayor preferencia 5 nucleótidos, que dirige la expresión de un gen asociado en las raíces de una planta.

De preferencia, el motivo específico de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT.

15 De preferencia, entre uno y diez, con mayor preferencia entre tres y ocho, con aún mayor preferencia entre cinco y siete motivos específicos de raíz se eliminan o inactivan, de preferencia se eliminan, en dicho promotor de gen myb.

Los motivos específicos de raíz se pueden eliminar mediante la remoción de motivos individuales o por remoción de un fragmento del promotor que contiene uno o más motivos. Por ejemplo, se puede eliminar la totalidad o parte de la 20 región entre los nucleótidos 1 y 530, de preferencia entre los nucleótidos 110 y 530 del promotor de gen myb de Arabidopsis thaliana.

La eliminación se puede efectuar por corte del ácido nucleico, por ejemplo mediante endonucleasas de restricción, y ligadura de los extremos cortados a fin de generar un promotor con un fragmento extraído.

25 Por ejemplo, un promotor modificado del gen myb de Arabidopsis thaliana se puede preparar al extraer un fragmento entre el sitio XcmI en las posiciones 162-176 y el sitio SspI en las posiciones 520-525. Esto genera un promotor modificado de gen myb con 6 de los 7 motivos específicos de raíz eliminados. Alternativamente, se pueden eliminar todos los 7 motivos específicos de raíz, por ejemplo al eliminar la región corriente arriba respecto del sitio SspI en las

30 posiciones 520-525, o por eliminación de la región entre los nucleótidos 1 y 120 junto con la región entre el sitio XcmI en las posiciones 162-176 y el sitio SspI en las posiciones 520-525.

Un motivo específico de raíz se puede inactivar por agregado, eliminación, sustitución o derivación de uno o más nucleótidos dentro del motivo, por lo que ya no tiene la secuencia de consenso preferido.

35 Preferentemente el promotor modificado del gen myb incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en las Figuras 2, 3 y 4 de la presente (Secuencias ID No: 2, 3 y 4, respectivamente) y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos.

40 Por “motivo específico de polen” se entiende una secuencia de 3-7 nucleótidos, de preferencia 4-6 nucleótidos, con mayor preferencia 4 o 5 nucleótidos, la cual dirige la expresión de un gen asociado en el polen de una planta.

De preferencia, el motivo específico de polen incluye una secuencia de consenso seleccionada del grupo que consiste en TTCT y AGAA.

45 De preferencia, entre uno y treinta, con mayor preferencia entre tres y quince, con aún mayor preferencia entre cuatro y diez motivos específicos de polen son suprimidos o inactivados, de preferencia eliminados, en dicho promotor de gen myb.

50 Los motivos específicos de polen se pueden eliminar por remoción de motivos individuales o por remoción de un fragmento del promotor que contiene uno o más motivos. Por ejemplo, se puede eliminar la totalidad o parte de la región entre los nucleótidos 1 y 540, de preferencia entre los nucleótidos 390 y 540 del promotor de gen myb de Arabidopsis thaliana.

55 La eliminación se puede efectuar por corte del ácido nucleico, por ejemplo mediante endonucleasas de restricción, y ligadura de los extremos cortados a fin de generar un promotor con un fragmento extraído.

Por ejemplo, un promotor modificado del gen myb de Arabidopsis thaliana se puede preparar por remoción de un fragmento entre el sitio XcmI en las posiciones 162-176 y el sitio SspI en las posiciones 520-525. Esto genera un

60 promotor modificado del gen myb con 4 de los 23 motivos específicos de polen eliminados. Alternativamente, se pueden eliminar 10 de los motivos específicos de polen, por ejemplo por eliminación de la región corriente arriba del sitio SspI en las posiciones 520-525.

Un motivo específico de polen se puede inactivar al agregar, eliminar, sustituir o derivar uno o más nucleótidos 65 dentro del motivo, de manera tal que ya no tenga la secuencia de consenso preferida.

Preferentemente el promotor modificado del gen myb incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en las Figuras 2, 3 y 4 de la presente (Secuencias ID No: 2, 3 y 4, respectivamente) y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos.

En otro aspecto de la presente invención se provee un método para incrementar la biomasa en una planta de acuerdo con la reivindicación 12, dicho método incluye introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor de gen myb, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos.

El promotor de gen myb o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos pueden ser un promotor del gen myb de longitud completa o un promotor modificado del gen myb.

El promotor del gen myb de longitud completa puede ser un promotor del gen myb32. Preferentemente el promotor del gen myb es de Arabidopsis, más preferentemente Arabidopsis thaliana. Más preferentemente el promotor del gen myb incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia mostrada en la Figura 1 de la presente (Secuencia ID Nº: 1) y fragmentos funcionalmente activos y variantes de los mismos.

Se describe un promotor adecuado en Li et al., Cloning of three MYB-like genes from Arabidopsis (PGR 99-138) Plant Physiology 121:313 (1999).

El promotor modificado del gen myb puede ser un promotor modificado del gen myb tal como se describió con anterioridad.

Por “incrementar la biomasa” se entiende aumentar o incrementar una planta transformada respecto de una planta control no transformada con una característica de crecimiento seleccionada del grupo que consiste en superficie total de la hoja, superficie acumulada de las hojas, dinámica de crecimiento de las hojas (es decir cantidad de hojas en el transcurso del tiempo), longitud del estolón, porcentaje de plantas con flor y rendimiento de semillas por flor o por superficie sembrada. El “incremento de la biomasa” también incluye reducir o disminuir el porcentaje de muerte del estolón en una planta transformada respecto de una planta control no transformada.

En particular, los solicitantes hallaron que mientras que el peso de semillas (es decir peso de mil semillas) de las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención era indistinguible de las plantas control no transgénicas, el rendimiento total de semillas expresado sobre la base de la flor o por superficie sembrada era significativamente superior en las plantas transgénicas si se comparaba con plantas control no transgénicas de intensidad de floración equivalente.

Por “funcionalmente activo” en relación con un promotor de gen myb o promotor modificado del gen myb se entiende que el fragmento o la variante (tales como un análogo, derivado o mutante) son capaces de manipular la senescencia en una planta por el método de la presente invención. Dichas variantes incluyen variantes alélicas naturales y variantes no naturales. Las adiciones, eliminaciones, sustituciones y derivaciones de uno o más de los nucleótidos se contemplan siempre que las modificaciones no den por resultado la pérdida de actividad funcional del fragmento o de la variante.

El fragmento o la variante funcionalmente activos tienen al menos 95 % de identidad con la parte relevante de la secuencia antes mencionada a la cual corresponden el fragmento o la variante. El fragmento tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos.

Por un “gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina” se entiende un gen que codifica una enzima que interviene en la síntesis de citoquinas tales como quinetina, zeatina y benciladenina, por ejemplo un gen que codifica isopentilotransferasa (ipt), o un gen símil ipt tal como el gen sho (por ejemplo de petunia). De preferencia, el gen es un gen de isopentenil transferasa (ipt) o gen sho. En una forma de realización preferida, el gen proviene de una especie seleccionada del grupo que consiste en Agrobacterium, con mayor preferencia Agrobacterium tumefaciens; Lotus, con mayor preferencia Lotus japonicus;y Petunia, con mayor preferencia Petunia hybrida.

Con máxima preferencia, el gen incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias mostradas en las Figuras 6, 8 y 10 de la presente (Secuencias ID No: 5, 7 y 9) las secuencias que codifican los polipéptidos mostrados en las Figuras 7, 9 y 11 de la presente (Secuencias ID No: 6, 8 y 10), y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos.

Por “funcionalmente activo” en relación con un gen que codifica una enzima de biosíntesis de citoquinina se entiende que el fragmento o la variante (tales como un análogo, derivado o mutante) son capaces de manipular la senescencia en una planta por el método de la presente invención. Dichas variantes incluyen variantes alélicas naturales y variantes no naturales. Se contemplan las adiciones, eliminaciones, sustituciones y derivaciones de uno

o más de los nucleótidos siempre que las modificaciones no den por resultado la pérdida de actividad funcional del

fragmento o de la variante. De preferencia, el fragmento o la variante funcionalmente activos tienen al menos aproximadamente 80 % de identidad con la parte relevante de la secuencia antes mencionada, con la cual el fragmento o variante corresponde con mayor preferencia en al menos aproximadamente 90 % de identidad, con máxima preferencia al menos aproximadamente 95 % de identidad. Dichos variantes y fragmentos funcionalmente activos incluyen, por ejemplo, los que tienen cambios conservadores de ácidos nucleicos o cambios de ácidos nucleicos que dan por resultado sustituciones conservadoras de aminoácidos de uno o más restos en la correspondiente secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la variante funcionalmente activa puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras de una secuencia mostrada en la Figura 6, 8 o 10, y la variante funcionalmente activa obtenida que codifica una secuencia de aminoácidos se muestra en la Figura 7, 9 o 11, respectivamente. De preferencia, el fragmento tiene un tamaño de al menos 20 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 50 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 100 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 500 nucleótidos.

La construcción genética se puede introducir en la planta por cualquier técnica adecuada. Las técnicas para incorporar las construcciones genéticas de la presente invención en células vegetales (por ejemplo por transducción, transfección o transformación) son bien conocidas por los expertos en la técnica. Dichas técnicas incluyen introducción mediada por Agrobacterium, electroporación de tejidos, células y protoplastos, fusión de protoplastos, inyección en órganos reproductivos, inyección en embriones maduros e introducción de proyectiles de alta velocidad en células, tejidos, callos, embriones inmaduros y maduros, transformación biolística y sus combinaciones. La elección de la técnica dependerá en gran medida del tipo de planta que se transforma y puede ser determinada fácilmente por una persona con la pericia adecuada.

Las células que incorporan la construcción genética de la presente invención se pueden seleccionar, tal como se describe más adelante, y luego se cultivan en un medio adecuado para regenerar las plantas transformadas, mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, serán aparentes para las personas expertas en la técnica. Las plantas obtenidas se pueden reproducir en forma sexual o asexual, mediante métodos bien conocidos en la técnica, a fin de producir sucesivas generaciones de plantas transformadas.

Los métodos de la presente invención se pueden aplicar a diversas plantas, incluso monocotiledóneas [tales como pastos (por ejemplo forraje, césped y pastos bioenergéticos que incluyen ryegrass perenne, festuca alta, ryegrass italiano, festuca roja, pasto canario rojo, tallo azul grande, cordgrass, napiergrass, centeno silvestre, caña de azúcar silvestre, Miscanthus), maíz, avena, trigo y cebada)], dicotiledóneas [tales como Arabidopsis, tabaco, poroto de soja, trébol (por ejemplo trébol blanco, trébol rojo, trébol subterráneo), alfalfa, canola, brassicas vegetales, lechuga, espinaca] y gimnospermas.

En otro aspecto de la presente invención se provee un vector de acuerdo con la reivindicación 7 capaz de manipular la senescencia en una planta, en donde dicho vector incluye un promotor modificado del gen myb, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos.

En aún otro aspecto de la presente invención se provee un vector de acuerdo con la reivindicación 13 capaz de incrementar la biomasa de una planta, en donde dicho vector incluye un promotor de gen myb, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos.

El promotor de gen myb o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos puede ser un promotor del gen myb de longitud completa o un promotor modificado del gen myb, tal como se describe en la presente.

En una forma de realización preferida del presente aspecto de la invención, el vector también puede incluir un terminador; dicho promotor, gen y terminador están ligados operativamente.

Por “ligado operativamente” se entiende que dicho promotor es capaz de generar la expresión de dicho gen en una célula vegetal y dicho terminador es capaz de terminar la expresión de dicho gen en una célula vegetal. De preferencia, dicho promotor está corriente arriba respecto de dicho gen y dicho terminador está corriente abajo respecto de dicho gen.

El vector puede ser de cualquier tipo adecuado y puede ser viral o no viral. El vector puede ser un vector de expresión. Dichos vectores incluyen secuencias de ácidos nucleicos cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo derivados de virus vegetales; plasmados bacterianos; derivados del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens; derivados del plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes; ADN fago; cromosomas artificiales de levaduras; cromosomas artificiales de bacterias; cromosomas artificiales bacterianos binarios; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos. Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector siempre que sea replicable o integrador o viable en la célula vegetal.

El promotor, el gen y el terminador pueden ser de cualquier tipo adecuado y pueden ser endógenos de la célula de

la planta blanco o pueden ser exógenos, siempre que sean funcionales en la célula de la planta blanco.

Diversos terminadores que se emplean en los vectores de la presente invención son también bien conocidos por los expertos en la técnica. El terminador puede provenir del mismo gen que la secuencia promotor o un gen diferente. Los terminadores particularmente adecuados son las señales de poliadenilación tales como poliA CaMV 35S y otros terminadores provenientes de los genes de nopalinasintetasa (nos) y octopinasintetasa (ocs).

El vector, además del promotor, el gen y el terminador, puede incluir otros elementos necesarios para la expresión del gen en diferentes combinaciones, por ejemplo el esqueleto del vector, el origen de replicación (ori), múltiples sitios de clonación, secuencias espaciadoras, mejoradores, intrones (tales como el intrón Ubicuitina de maíz Ubi), genes de resistencia a antibióticos y otros genes de marcadores seleccionables [tales como el gen de neomicina fosfotransferasa (nptII), el gen de higromicina fosfotransferasa (hph), el gen de fosfinotricina acetiltransferasa (bar o pat)], y genes informadores (tales como el gen de beta-glucuronidasa (GUS) (gusA)]. El vector también puede contener un sitio de fijación del ribosoma para la iniciación de la traducción. El vector también puede incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresión.

Como alternativa para usar un gen de marcador seleccionable par proveer un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas, la presencia del vector en las células transformadas se puede determinar por otras técnicas bien conocidas en la técnica, tales como PCR (reacción en cadena de polimerasa), análisis de hibridación por Southern blot, ensayos histoquímicos (por ejemplo ensayos GUS), cromatografía de capa fina (TLC), análisis de hibridación por northern y western blot.

Los expertos en la técnica apreciarán que los diversos componentes del vector están ligados operativamente, lo cual da por resultado la expresión de dicho gen. Las técnicas para la ligadura operativa de los componentes del vector de la presente invención son bien conocidas por los expertos en la técnica. Dichas técnicas incluyen el uso de ligadores, tales como los ligadores de síntesis, por ejemplo incluso uno o más sitios de restricción de enzima.

En otro aspecto de la presente invención, se provee una célula vegetal transgénica, planta, semilla de planta u otra parte de la planta de acuerdo con la reivindicación 9, con características de senescencia modificadas o aumento de la biomasa. De preferencia dicha célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de la planta incluye un vector de acuerdo con la presente invención. De preferencia, la célula vegetal transgénica, planta, semilla de planta u otra parte de la planta es producida por un método de acuerdo con la presente invención.

La presente invención también provee una planta transgénica, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de una célula vegetal de la presente invención.

La presente invención también provee una planta transgénica, semilla de planta u otra parte de la planta derivada de una planta de la presente invención.

La presente invenciones describirá ahora más exhaustivamente con referencia a los ejemplos y dibujos acompañantes. Se debe entender, sin embargo, que la siguiente descripción sólo es ilustrativa y de ninguna manera se debe tomar como una restricción de la generalidad de la invención descrita con anterioridad.

En las figuras:

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del promotor del gen myb32 (atmyb32) de Arabidopsis thaliana (Secuencia ID No: 1), la secuencia del promotor Atmyb32 con tipo MYB, el motivo específico de polen y los

motivos específicos de raíz destacados. WAACCA (subrayado/cursiva) MYB1AT; GTTAGTT (negrita/recuadro)

MYB1LEPR; CCWACC (recuadro) MYBPZM; GGATA (cursiva) MYBST1; AGAAA (subrayado) POLEN1LELAT52; ATATT (negrita) MOTIVO DE RAÍZ TAPOX1.

La Figura 2 muestra una variante de secuencia de promotor Atmyb32 (Atmyb32xs) con la secuencia vegetal XcmI – SspI eliminada. Están destacados el tipo MYB, específico de polen y los motivos específicos de raíz. WAACCA (subrayado/cursiva) MYB1AT; GTTAGTT (negrita/recuadro) MYB1LEPR; CCWACC (recuadro) MYBPZM; AGAAA (subrayado) POLEN1LELAT52; ATATT (negrita) MOTIVO DE RAÍZ TAPOX1 (Secuencia ID No: 2).

La Figura 3 muestra una variante de secuencia de promotor Atmyb32 con todos los motivos de raíz eliminados. Están destacados el tipo MYB, específico de polen y los motivos específicos de raíz. WAACCA (subrayado/cursiva) MYB1AT; CCWACC (recuadro) MYBPZM; AGAAA (subrayado) POLEN1LELAT52 (Secuencia ID No: 3)

La Figura 4 muestra una variante de secuencia de promotor Atmyb32 con la secuencia del sitio SspI corriente arriba eliminada. Están destacados el tipo MYB, específico de polen y los motivos específicos de raíz. WAACCA (subrayado/cursiva) MYB1AT; CCWACC (recuadro) MYBPZM; AGAAA (subrayado) POLEN1LELAT52

(Secuencia ID No: 4).

La Figura 5 muestra los motivos de las secuencias de promotor Atmyb32 y Atmyb32xs

La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de isopentenil transferasa (ipt) de Agrobacterium tumefaciens (Secuencia ID No: 5).

La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos deducida del gen de isopentilotransferasa de Agrobacterium tumefaciens (Secuencia ID No. 6)

La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de isopentilotransferasa de Lotus japonicus (Secuencia ID No. 7).

La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos deducida del gen de isopentilotransferasa de Lotus japonicus (Secuencia ID No. 8).

La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de biosíntesis de citoquinina Sho de Petunia hybrida (Secuencia ID No. 9)

La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos deducida del gen de biosíntesis de citoquinina Sho de Petunia hybrida (Secuencia ID No. 10).

La Figura 12 muestra el análisis por PCR y Southern ADN de atmyb32::ipt de plantas transgénicas de trébol blanco (Trifolium repens). a) La región T-ADN de patmyb32:ipt que muestra los sitios de enzimas de restricción y la ubicación de las sondas usadas para el análisis de hibridación Southern. b) 1 % de gel de agarosa teñido con bromuro de etidio de PCR amplificado de los productos 599 bp nptII y 583 bp ipt. c) hibridación por Southern blot con ADN HindIII genómico total digerido aislado de plantas de trébol blanco positivas para PCR hibridadas con la sonda ipt. d) hibridación por Southern blot con ADN HindIII genómico total digerido aislado de plantas de trébol blanco positivas para PCR hibridadas con la sonda nptII. Carriles 1-2: dos cv independientes resistentes a canamicina. regenerantes Haifa, código: Hmi01, Hmi08 respectivamente; carriles 3-12: doce cv independientes resistentes a canamicina. Regenerantes de irrigation, códigos: Imi06, Imi07, Imi08, Imi09, Imi10, Imi11, Imi12, Imi14, Imi16, Imi18 respectivamente; carril C: trébol blanco no transformado; carril P: control positivo de plásmido patmyb32ipt.

La Figura 13 muestra el análisis por RT-PCR de expresión de mARN de ipt en plantas transgénicas atmyb32::ipt de trébol blanco (T. repens). Carril 1-11 son muestras de 11 líneas transgénicas independientes con los correspondientes códigos de plantas como en la Figura 4.8; carril C, control de planta no transformada; carril P, plásmido como control positivo. Se aisló ARN total de tejidos de hojas. Se usó ARN total (13 µg) para cada reacción de transcripción inversa y 1/5 de producto RT se amplificó por PCR. Los productos de ADN en el gel de la derecha se amplificaron por 2X 30 ciclos de PCR intensivo. No se añadió transcriptasa inversa a la correspondiente reacción de RT-PCR cargada en carriles alternados.

La Figura 14 muestra un bioensayo de senescencia de hojas extraídas de plantas transgénicas de trébol blanco atmyb32::ipt (T. repens). Se juntaron al menos 30 hojas de cada línea desde posiciones similares en los estolones de las líneas de plantas. A. Cantidad de hojas amarillas como fracción de la cantidad total de hojas extraídas. B. Típico aspecto de las hojas mantenidas en agua con luz durante dos semanas. Clave para las líneas de plantas: HC, IC y Hmg, Img, no transformada y plantas transgénicas atmyb32::gusA (cv. Haifa e irrigación) respectivamente; 01 y 08, líneas transgénicas Haifa atmyb32::ipt Hmi01 y Hmi08 respectivamente; 11, 12, 16 y 18 líneas transgénicas de irrigación atmyb32::ipt Imi11, Imi12, Imi16 y Imi18 respectivamente.

La Figura 15 muestra A) morfología general de la planta, B) desarrollo normal de los brotes, y C) desarrollo normal de la raíz en plantas transgénicas de trébol blanco atmyb32::ipt (T. repens) (derecha) comparadas con plantas control (izquierda).

La Figura 16 muestra detalles del vector de pBMVkAtMYB32-900::ipt [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBMVkAtMYB32-900::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: 35S::kan::35ST; promotor de gen: AtMYB32-900; terminador de gen: nos.]

La Figura 17 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBMVkAtMYB32-900::ipt-nos (Secuencia ID No. 11)

La Figura 18 muestra detalles del vector de pBMVkAtMYB32xs::ipt-nos [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBMVkAtMYB32XS::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: 35S::kan::35ST; promotor de gen: AtMYB32-xs; terminador de gen: nos.]

La Figura 19 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBMVkAtMYB32xs::ipt-nos (Secuencia ID No. 12).

La Figura 20 muestra detalles del vector de pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: 35S::hph::35ST; promotor de gen: AtMYB32-900; terminador de gen: nos.]

La Figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBMVhAtMYB32-900::ipt-nos (Secuencia ID No. 13)

La Figura 22 muestra detalles del vector de pBMVhAtMYB32xs::ipt-nos [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBMVhAtMYB32XS::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: 35S::hph::35ST; promotor de gen: AtMYB32-xs; terminador de gen: nos.]

La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBMVhAtMYB32xs::ipt-nos (Secuencia ID No. 14)

La Figura 24 muestra detalles del vector de pBSubn-AtMYB32-900::ipt-nos [Gen: Isopentilotransferasa (IPT); Vector: pBSubn-AtMYB32-900::ipt-nos (esqueleto pPZPRCS2); Marcador seleccionable: spec; casete de marcador seleccionable vegetal: Ubi::bar::nos; promotor de gen: AtMYB32-900; terminador de gen: nos.]

La Figura 25 muestra la secuencia de nucleótidos del vector pBSAtMYB32900::ipt-nos (Secuencia ID No. 15)

La Figura 26 muestra la generación de canola transgénico que contiene pBMVhATMYB3-900::ipt-nos y pBMVhATMYB32xs::ipt-nos. A. Las semillas de canola se germinaron in vitro; B. las secciones de hipocotilo se extrajeron de semillas germinadas de 7 días y se inocularon con una suspensión de Agrobacterium; C&D. Regeneración de secciones de hipocotilo regeneradas con selección de higromicina; E-J. Plantas transgénicas de canola T0 portadoras de los vectores pBMVhATMYB3-900::ipt-nos y pBMVhATMYB32xs::ipt-nos.

La Figura 27 muestra un proceso para la transformación biolística de trigo.

La Figura 28 muestra la transformación biolística de trigo (Triticum aestivum L. MPB Bobwhite 26). Producción de planta donante (A&B); aislamiento de embrión cigótico (C&D); Regeneración con selección de glufosinato (E-G); formación de raíz durante la selección (H); plantas T0 que crecen en condiciones de invernadero de contención para recuperación de progenie transgénica (I).

La Figura 29 muestra el estudio de campo contenido de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt.

La Figura 30 muestra la evaluación comparativa de las tasas de crecimiento y la dinámica de crecimiento de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt con control de plantas de trébol blanco no transgénicas. A) Tasa de crecimiento B) Dinámica de crecimiento C) Características de crecimiento (después de 45 días)

□ trébol blanco transgénico (claro) ■ control de trébol blanco no transgénico (oscuro)

La Figura 31 muestra la intensidad de floración (es decir cantidad de flores maduras por m2) de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) y plantas control de trébol blanco no transgénicas (es decir WT) en condiciones de campo contenidas.

La Figura 32 muestra el peso de semillas (es decir el peso de mil semillas, en gramos) de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) y plantas control de trébol blanco no transgénicas (es decir WT) en condiciones de campo contenidas.

La Figura 33 muestra el rendimiento de semillas por flor (en miligramos) de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) y plantas control de trébol blanco no transgénicas (es decir WT) en condiciones de campo contenidas.

La Figura 34 muestra el rendimiento de semillas por superficie (en kg/ha) de plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) y plantas control de trébol blanco no transgénicas (es decir WT) en condiciones de campo contenidas.

La Figura 35 muestra la generación de plantas transgénicas de alfalfa que contienen los genes quiméricos pBMVkATMYB3-900::ipt-nos y pBMVkATMYB32xs::ipt-nos A. Se usan explantados de pecíolos de clones de alfalfa C2-3, C2-4 y 19-17 para la inoculación con una suspensión de Agrobacterium y llevó a la producción de callos embriogénicos transformados tras la selección en presencia de canamicina; B-D. Regeneración de plantines transgénicos de alfalfa portadores de genes quiméricos de los vectores pBMVkATMYB3-900::ipt-nos y pBMVkATMYB32xs::ipt-nos, a partir de embriones somáticos cultivados in vitro.

La Figura 36 muestra el análisis por PCR de plantas de canola transgénicas (T1 LXR línea de plantas de canola de línea 4). Se asiló el ADN genómico de diferentes plantas de canola transgénicas de las líneas T1 LXR04 y se

sometió a PCR mediante cebadores específicos para A. el marcador seleccionable (hph)o B. el gen candidato de interés (IPT).

La Figura 37 muestra el análisis de la expresión del gen IPT en plantas de canola transgénicas T1 (T1 LXR canola respecto de la expresión de IPT en hojas).

La Figura 38 muestra canola transgénico que muestra el retraso de la senescencia del cotiledón separado, comparado con cotiledones control de tipo salvaje 7 días después de separados.

La Figura 39 muestra la calificación de senescencia de cotiledones de canola transgénico T1 7 días después de la separación.

0= senescencia no visible

1= verde pálido

2 = algo amarillo

3 = más amarillo

4=

completamente amarillo

La Figura 40 muestra canola transgénico que muestra retraso de senescencia de hojas juveniles separadas, comparado con cotiledones control de tipo salvaje 14 días después de la separación.

La Figura 41 muestra la calificación de senescencia de las primeras hojas juveniles de canola transgénico T1 14 días después de la separación.

0= senescencia no visible

1= verde pálido

2 = algo amarillo

3 = más amarillo

4=

completamente amarillo

5= podrido/necrosis

La Figura 42 muestra análisis de hibridación Southern de líneas de trigo transgénico. Los carriles incluyen: PM – peso molecular; WT – tipo salvaje; líneas de trigo transgénico LXR3, LXR4, LXR13, LXR16 y controles positivos de plásmido que contiene 10 y 20 pg.

La Figura 43 muestra análisis de expresión de líneas de trigo transgénico independiente T1 (expresión cuantitativa de IPT en trigo). Los valores de transcripción cuantitativa se determinaron en fentomoles (fmol) por microgramo de ARN mediante una curva estándar derivada de ADN plásmido que contiene la secuencia blanco. Las muestras representan clases de expresión alta, media y baja para el gen candidato IPT.

La Figura 44 muestra la variación fenotípica de plantas de trigo transgénicas T1 cultivadas en invernadero. A. 13 plantas de trigo T1 LXR que muestran fenotipo normal, comparadas con plantas de trigo control nulas. B. Plantas de trigo T1 LXR 04 que muestran fenotipo romo y aumento de las hojas primarias, comparado con plantas de trigo control nulas.

La Figura 45 muestra trigo transgénico que muestra el retraso de la senescencia de las hojas, comparado con hojas control nulas 7 días después de la separación.

Ejemplos Ejemplo 1 Secuencia de promotor Atmyb32 y variantes de secuencia de promotor

La secuencia de promotor Atmybb32 y sus variantes se muestran en las Figuras 1-4.

Ejemplo 2 Genes de biosíntesis de citoquinina

Los ejemplos de genes de biosíntesis de citoquinina adecuados para el uso en la presente invención se muestran en las Figuras 6, 8 y 10. Los genes adecuados también incluyen los que codifican los polipéptidos mostrados en las Figuras 7, 9 y 11.

Ejemplo 3 Producción de plantas transgénicas de trébol blanco

Se produjeron plantas transgénicas de trébol blanco (Trifolium repens cv. Haifa e irrigación) por transformación mediada por Agrobacterium mediante un vector binario portador del gen quimérico atmyb32::ipt (Figura 12a). Las plantas transgénicas se analizaron por PCR mediante los cebadores ipt y nptII (Figura 12b). Las muestras de ADN genómico digeridas de HindIII sometidas a análisis por hibridación Southern demostraron que se detectaron

5 fragmentos de ADN mayores de 4,4 kb en todos los carriles mediante sondas ipt y nptII, lo cual demuestra la presencia y la integración de T-ADN de longitud total en el genoma de trébol blanco (Figura 12). Las líneas transgénicas Hmi01, Imi06, Imi11 e Imi18 (carril 1, 3, 5, 8 y 12 respectivamente) mostraron tener una única copia de T-ADN de longitud total integrado en el genoma. Otras líneas transgénicas tenían múltiples copias del transgén atmyb32::ipt.

Ejemplo 4

Expresión de gen IPT en plantas transgénicas de trébol blanco

15 La expresión del transgén atmyb32::ipt en plantas de trébol blanco transgénico (T. repens) se evaluó por RT-PCR. Se detectó mARN de ipt en los tejidos de las hojas de todas las plantas transgénicas atmyb32::ipt de trébol blanco examinadas, con niveles variables de productos de PCR detectados (Figura 13).

Ejemplo 5

Retraso de senescencia en hojas separadas de plantas transgénicas de trébol blanco

Se realizaron experimentos para evaluar la senescencia de hojas separadas de plantas transgénicas atmyb32::ipt. Se observó rápida aparición de color amarillo en las hojas separadas de plantas transgénicas de trébol blanco no 25 transformadas y atmyb32::gusA de ambos cultivars dentro de la semana. Las líneas transgénicas Hmi01, Hmi08, Imi16 y Imi18 mostraron retraso de la senescencia, mientras que Imi11 e Imi12 no mostraron signos de aparición de color amarillo al fin de los 7 días. Después de dos semanas, las hojas de todas las plantas transgénicas atmyb32::ipt eran mucho más verdes que las de plantas transgénicas control no transformadas y atmyb32::gusA (Figura 14). El grado de senescencia de las hojas extraídas estaba en el orden de HC, Hmg > Hmi01 > Hmi08 para cv. Haifa, y IC y

30 Img > Imi16 > Imi18 > Imi11 y Imi12 para cv. irrigación. HC es control Haifa no transformado, Hmg es control Haifa atmyb32::gusA, IC es control irrigación no transformado, Img es control irrigación atmyb32::gusA. Hmi01, Hmi08, Imi16, Imi18, Imi11 e Imi12 son plantas transgénicas de trébol blanco atmyb32::ipt independientes provenientes de los cultivar Haifa (H) e irrigación (I), respectivamente.

35 Ejemplo 6

Morfología vegetal y desarrollo de raíces en plantas transgénicas de trébol blanco

Se observó morfología normal de las plantas, así como desarrollo normal de brotes y raíces en plantas transgénicas

40 de trébol blanco atmyb32:ipt (Figura 6), lo cual indica que la expresión regulada del gen ipt bajo el control del promotor atmyb32 no afectaba negativamente la dominancia de raíces o apical de las plantas transgénicas de trébol blanco (Tabla 1).

Tabla 1

Transformante

Cultivar Construcción Copia ipt Nº Fenotipo

Hmi01

Haifa Atmyb32::ipt 1 Normal

Hmi08

Haifa Atmyb32::ipt >3 Normal

Imi06

irrigación Atmyb32::ipt 1 Normal

Imi07

irrigación Atmyb32::ipt 3 Normal

Imi09

irrigación Atmyb32::ipt >3 Normal

Imi10

irrigación Atmyb32::ipt >3 Normal

Imi11

irrigación Atmyb32::ipt 1 Normal

Imi12

irrigación Atmyb32::ipt 2 Normal

Imi16

irrigación Atmyb32::ipt 2 Normal

Imi18

irrigación Atmyb32::ipt 1 Normal

45 Se observó morfología normal de las plantas y raíces normales en diez líneas independientes de trébol blanco transgénico atmyb32::ipt analizadas. Se muestran las estimaciones de cantidades de copias de gen ipt en las diez líneas independientes de trébol blanco transgénico atmyb32::ipt.

50 Ejemplo 7

Generación de vectores para la transformación de plantas

Se generaron cuatro vectores binarios para la transformación mediada por Agrobacterium de las plantas (Figuras 16

19). Cada vector tenía un esqueleto de vector pPZP200 (Hajdukiewicz et al., 1994) y contenía Atmyb32-900::ipt-nos o Atmyb32-xs::ipt-nos quimérico con o sin casetes quiméricos de marcador seleccionable 35S::nptIII-35st o 35S::hph-35st.

Se construyó un vector de transformación para la transformación biolística (Figuras 20 y 21). El vector de transformación contenía Atmyb32-900::ipt-35st quimérico con un casete quimérico de marcador seleccionable Ubi::bar-nos.

Se amplificaron el promotor Atmyb32, la variante de promotor Atmyb32xs, el gen de isopentiloatransferasa y los terminadores 35st y nos por PCR con cebadores adaptados Gateway™ (Invitrogen) y se clonaron en vectores de entrada pDONR221. Estos luego se clonaron mediante recombinación en vectores de destinación que contenían los casetes clonados convencionalmente de marcador seleccionable. Se determinaron las secuencias completas de todos los vectores según protocolos de seguridad de estricta calidad.

Ejemplo 8

Transformación mediada por Agrobacterium de canola (Brassica napus)

Se usaron vectores binarios pBMVhATMYB3-900::ipt-nos (Figura 20) y pBMVhATMYB32xs::ipt-nos (Figura 22) que contienen los genes quiméricos ipt bajo el control del promotor Atmyb32 (Figura 1) y la secuencia de promotor variante Atmyb32xs con motivos específicos de raíz eliminados (Figura 2) para la transformación mediada por Agrobacterium de segmentos de hipocotilo de Brassica napus (Figura 26).

Semillas de Brassica napus se esterilizaron en superficie en 70 % de etanol durante 2 minutos, se lavaron 3 veces en agua estéril y luego se volvieron a esterilizar en superficie en una solución que contiene 1 % (p/v) de hipoclorito de calcio y 0,1 % (v/v) de Tween 20 de 30 minutos. Las semillas se lavaron al menos 3 times en agua estéril y se plantaron en frascos de cultivo de 120 ml que contienen un medio de germinación solidificado que contiene 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog Physiol. Plant, 15: 473-497, 1962), 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 complementado con 500 mg/L de MES, 2 % (p/v) de sacarosa a pH 5,8 con adición de 4 g/L de Gelrite. Los frascos se incubaron a 25 °C en condiciones de 16 h de luz/8 h de oscuridad durante 7 días para favorecer la germinación.

Después de 7 días, las semillas germinadas de Brassica napus (semillas germinadas enteras) se transfirieron a un medio líquido que consiste en 1x macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 3 % (p/v) de sacarosa a pH 5,8. Las semillas germinadas se agruparon y se extrajeron las raíces y los cotiledones antes de cortar los hipocotilos en secciones de 7-10 mm y plantarlos en placas de Petri de 9 X 1,5 cm que contienen un medio de preacondicionamiento que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 3 % (p/v) de sacarosa a pH 5,8 solidificado con 6,4 g/l de Bacto-Agar.

Las secciones de hipocotilo se cultivaron durante 24 horas antes de la inoculación con una suspensión de Agrobacterium DO600 = 0,2 durante 30 minutos que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 100 µM de acetosiringona, 3 % (p/v) de sacarosa a pH 5,8.

Tras la inoculación, se cortaron las secciones de hipocotilo en toallas de papel estériles y se transfirieron a placas de Petri de 9 X 1,5 cm que contienen 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 100 µM de acetosiringona, 1 mg/L de 2,4-D, 3 % (p/v) de sacarosa a pH 5,8 solidificado con 8 g/l de Bacto-Agar. Los explantados se incubaron a 25 °C en condiciones de 16 h de luz/8 h de oscuridad durante 72 horas para el cocultivo.

Tras el cocultivo, se transfirieron 20-30 explantados de hipocotilo a placas de Petri de 9 X 1,5 cm que contienen un medio de selección solidificado que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 1 mg/L de 2,4-D, 3 % (p/v) de sacarosa a pH 5,8 solidificado con 8 g/l de Bacto-Agar, suplementado con 250 mg/l de timentina y 10 mg/l de higromicina a fin de seleccionar los brotes resistentes a higromicina. Las placas se incubaron a 25 °C en condiciones de 16 h de luz/8 h de oscuridad.

Después de 7 días se transfirieron los explantados de hipocotilo a placas de Petri de 9 X 1,5 cm que contienen un medio de regeneración solidificado que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 1 mg/L de 2,4-D, 3 % (p/v) de sacarosa a pH 5,8 solidificado con 8 g/l de Bacto-Agar, suplementado con 4 mg/l de BAP, 2 mg/l de Zeatina, 5 mg/l de nitrato de plata, 250 mg/l de timentina y 10 mg/l de higromicina. Las placas se incubaron a luz directa a 25 °C en condiciones de luz fluorescente (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad; 55 µmol m-2 sec -1) durante 4 semanas para favorecer el desarrollo de brotes.

La regeneración se monitoreó semanalmente y los explantados de hipocotilo se transfirieron a placas de Petri nuevas de 9 X 2,0 cm que contienen medio de regeneración solidificado, RM suplementado con 4 mg/l de benciladenina, 2 mg/l de zeatina, 5 mg/l de nitrato de plata, 250 mg/l de timentina y 10 mg/l de higromicina durante 6-8 semanas para favorecer el desarrollo de brotes.

Posbrotes resistentes a higromicina (Hygr) se transfirieron a frascos de 120 ml que contiene, medio de inducción de raíces solidificado, RIM1, que consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog, 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas B5 suplementadas con 500 mg/L de MES, 1 mg/L de 2,4-D, 1 % (p/v) s e sacarosa a pH 5,8 solidificado con 8 g/l de Bacto-Agar, suplementado con 250 mg/l de timentina. Los brotes se incubaron a luz directa fluorescente a 25 °C (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad; 55 µmol m-2 sec -1) para favorecer la elongación de los brotes y el desarrollo de las raíces durante 4-5 semanas. Todos los brotes Hygr con brotes y sistemas de raíces desarrollados se transfirieron a suelo y se cultivaron en condiciones de invernadero.

Ejemplo 9

Transformación biolística de trigo (Triticum aestivum L.)

Se usaron vectores de transformación que contienen genes quiméricos ipt bajo el control del promotor Atmyb32 (Figura 1) y la secuencia variante de promotor Atmyb32xs con motivos específicos de raíz eliminados (Figura 2) para la transformación biolística de trigo (Triticum aestivum L. MPB Bobwhite 26). Se muestra un vector representativo en la Figura 24. Un esquema del procedimiento para la transformación biolística de trigo se representa en la Figura 27. El procedimiento de transformación incluye las siguientes etapas:

Etapa 1 (Producción de planta donante):

Se usaron semillas de Triticum aestivum (Bobwhite 26) para la producción del material de planta donante. Las plantas de trigo se cultivaron en una mezcla de vivero que consiste en compost de corteza de pino, perlita y vermiculita, con cinco plantas por maceta con un tamaño máximo de maceta de 20 cm. Las plantas se mantuvieron en condiciones de invernadero a aproximadamente 22-24 oC durante 12-16 semanas (Figura 28A). Una vez que emergió la primera espícula de la hoja primaria, se rotularon las plantas y se juntaron los embriones de las cabezas más grandes 12-15 días después de la antesis.

Etapa 2 (Día 1)

Se cosecharon las espículas del estado de desarrollo deseado (Figura 28B). Se extrajo el cariopsis de las espículas y se esterilizaron en superficie durante 20 minutos en una solución 0,8 % (v/v) de NaOCl y se enjuagaron al menos cuatro veces en agua destilada estéril.

Los embriones de hasta 10 mm de longitud se extrajeron asépticamente de cada cariopsis (remoción del eje) mediante un microscopio de disección y se cultivaron con el lado axial hacia abajo en medio osmótico (E3maltosa) que consiste en 2x de macronutrientes de Murashige y Skoog (1962), 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de L-asparagina, suplementado con 15 % (p/v) de maltosa, 0,8 % (p/v) de Sigma-agar y 2,5 mg/L de 2,4-D (Figura 28C&D). Los embriones se cultivaron en placas de Petri de 60 mm x 15 mm transparentes de polipropileno con 15 mL de medio. Las placas de cultivo se incubaron a 24 oC en oscuridad durante 4 horas antes del bombardeo. Los embriones se bombardearon con una pistola génica BioRad PDS1000 a 900 psi y a6cm con1 µg de ADN de vector plásmido precipitado en partículas de oro de 0,6 µm. Tras el bombardeo se incubaron los embriones durante la noche en oscuridad en el medio osmótico.

Etapa 3 (Día 2):

Los embriones se transfirieron a un medio de inducción de callo (E3calli) que consiste en 2x de macronutrientes de Murashige y Skoog (1962), 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de Lasparagina, suplementado con 6 % (p/v) de sacarosa, 0,8 % (p/v) de Sigma-agar y 2,5 mg/L de 2,4-D. Los embriones se cultivaron durante dos semanas a 24 oC en la oscuridad.

Etapa 4 (Día 16):

Después de 2 semanas de cultivo en E3calli, los embriones habían producido callos embriogénicos y se subcultivaron en medio de selección (E3Select) que consiste en 2x de macronutrientes de Murashige y Skoog (1962), 1x de micronutrientes y vitaminas orgánicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de L-asparagina, suplementado con 2 % (p/v) de sacarosa, 0,8 % (p/v) de Sigma-agar, 5 mg/L de D,L fosfinotricina (PPT) y sin reguladores de crecimiento vegetal (Figura 28E-G). Los cultivos se incubaron durante otros 14 días en E3Select a 24 oC en la luz y con un fotoperíodo de 12 horas.

Etapa 5 (Día 30):

Después de 14 días de cultivo en E3Select, los callos embriogénicos se subcultivaron en E3Select nuevo durante otros 14 días (Figura 28 E-G).

Etapa 6 (Día 44):

Después de aproximadamente 4 semanas en E3Select, las plantas en desarrollo se extrajeron de la masa del callo embrionario y se cultivaron durante otras tres semanas en frascos de cultivo de tejido de policarbonato de 65 mm X 80 mm o 65 mm x 150 mm que contienen medio de inducción de raíz (RM). El medio de inducción de raíz consiste en 1x de macronutrientes de Murashige y Skoog (1962), vitaminas orgánicas, 40 mg/L de tiamina, 150 mg/L de Lasparagina, suplementado con 2 % (p/v) de sacarosa, 0,8 % (p/v) de Sigma-agar, y 5 mg/L de PPT (Figura 28H). El resto de callo embriogénico se subcultivó en E3Select durante otros 14 días.

Etapa 7 (Día 65+):

Los plantines regenerados que sobrevivieron más de 3 semanas en RM con formación de raíces saludables se plantaron en una mezcla de invernadero que consiste en turba y arena (1:1) y se mantuvieron a 22-24 oC con humedad elevada en un sistema de cámara de humedad (Figura 28). Después de dos semanas, se extrajeron las plantas de la cámara de humedad y se regaron manualmente con agua y se alimentaron con Aquasol™ líquido semanalmente hasta maduración. Las plantas T0 se tomaron como muestra para el análisis de ADN genómico y molecular. Las semillas T1 se juntaron y plantaron para el análisis de Q-PCR de alto rendimiento (Figura 28J).

Ejemplo 10

Rendimiento agronómico de plantas transgénicas de trébol blanco

Se evaluó el rendimiento agronómico de plantas transgénicas atmyb32::ipt de trébol blanco (Trifolium repens), respecto de plantas de trébol blanco control no transgénicas, en condiciones de cámara de crecimiento controlada y en estudios de campo contenidos (Figura 29).

Las plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt evaluadas en condiciones de cámara de crecimiento controlada revelaron significativos aumentos de la acumulación de biomasa y reducciones de las manifestaciones de senescencia, comparadas con plantas control no transgénicas de trébol blanco (Figura 30). Las plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt mostraron mayor superficie total de hoja, aumento de la superficie acumulada de las hojas, mayor dinámica de crecimiento de las hojas (es decir cantidad de hojas en el tiempo), mayor altura de estolón y aumento del % de plantas florecidas, así como reducción de la senescencia del estolón y muerte comparado con plantas control no transgénicas de trébol blanco (Figura 30A-C).

El rendimiento de las semillas de 3 plantas transgénicas de trébol blanco independientes que expresan atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) también se evaluó comparativamente con plantas control no transgénicas (es decir de tipo salvaje, WT) en condiciones de campo contenidas. Se seleccionaron dos plantas transgénicas de trébol blanco independientes que expresan atmyb32::ipt (es decir LXR 12 y LXR 18) con intensidad de floración indistinguible (es decir cantidad de flores maduras por m2) respecto de la planta control no transgénica (es decir WT) para la evaluación de campo (Figura 31).

Si bien el peso de semillas (es decir el peso de mil semillas) de las plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12, LXR 18 y LXR 11) era indistinguible de las plantas de trébol blanco control no transgénicas (es decir WT) (Figura 32), el rendimiento total de las semillas expresado sobre la base por flor (Figura 33), y por superficie sembrada (Figura 34) se duplicó en las plantas transgénicas de trébol blanco que expresan genes quiméricos Atmyb32::ipt (es decir LXR 12 y LXR 18), comparado con plantas de trébol blanco control no transgénicas de intensidad de floración equivalente (es decir WT).

Ejemplo 11

Transformación de alfalfa (Medicago sativa) mediada por Agrobacterium

El vector binario pBMVkATMYB32xs::ipt-nos (Figura 18) que contiene genes quiméricos ipt bajo el control de la secuencia variante de promotor Atmyb32xs con motivos específicos de raíz eliminados (Figura 2) se usó para la transformación mediada por Agrobacterium de explantados de pecíolos de Medicago sativa de clones altamente regenerables de alfalfa (M. sativa) C2-3, C2-4 y 19-17 (Figura 35).

Tras el cocultivo con la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 que contiene el vector binario pBMVkATMYB32xs::ipt-nos, los explantados de alfalfa se lavaron con medio que contiene cefotaxima y se usaron para la inducción de callos embriogénico en medio selectivo que contiene 25 mg/l de canamicina. Se recuperaron los callos embriogénicos transgénicos de alfalfa y se dejaron regenerar brotes transgénicos de alfalfa, que se

transfirieron a medio de raíz para recuperar las plantas transgénicas de alfalfa que expresan genes quiméricos ipt bajo el control del promotor variante Atmyb32xs (Figura 35).

Se comprenderá que la invención descrita y definida en la presente memoria descriptiva se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o evidentes del texto o los dibujos. Todas estas diferentes combinaciones constituyen diversos aspectos alternativos de la invención.

Ejemplo 12

Producción de plantas de canola transgénicas

Se produjeron plantas transgénicas de canola (Brassica napus) por transformación mediada por Agrobacterium mediante vectores binarios (Figuras 20 y 22) portadores del gen quimérico atmyb32::ipt. La modificación genética se caracterizó por la presencia del gen candidato (IPT) o el marcador seleccionable (hph) mediante PCR en la generación T1 (Figuras 36).

La Figura 36 ilustra el análisis por PCR de plantas de canola transgénicas. El ADN genómico se aisló de diferentes plantas de canola transgénicas de líneas T1 LXR04 y sometidas a PCR mediante cebadores específicos para el marcador seleccionable (gen hph) o el gen candidato de interés (IPT). En la Figura 36A se usaron cebadores hph específicos para amplificar un producto a partir de ADN genómico y se visualizaron en gel de agarosa. La Figura 36B demuestra el uso de cebadores específicos IPT para amplificar el ADN genómico mediante un método de PCR fluorescente. Los cebadores son específicos para la secuencia blanco que da por resultado fluorescencia detectable que es inversamente proporcional a la cantidad de producto de PCR acumulado.

Ejemplo 13

Expresión del gen IPT en plantas de canola transgénicas

La expresión del transgén atmyb32::ipt en canola transgénico se evaluó mediante un método de RT-PCR fluorescente específico para la secuencia blanco (Figura 37). El mARN de IPT se detectó en tejidos y los niveles de expresión relativos se compararon entre líneas y con controles nulos. Los controles nulos son líneas de progenie que han sido sometidas al proceso de transformación pero no contienen secuencias blanco después del cruzamiento.

Ejemplo 14

Retraso de la senescencia de hojas separadas en plantas de canola transgénicas

Se realizaron experimentos para evaluar la senescencia de hojas separadas de plantas transgénicas atmyb32::ipt. Las Figuras 38 a 41 indican los datos de ensayos de senescencia de hojas caídas asociados con la expresión del gen candidato en canola. Los ensayos para cotiledones y hojas separadas se condujeron para inducir el envejecimiento y evaluar el fenotipo de senescencia de la canola transformada, comparado con los controles de tipo salvaje. El día 7 y 14 de los ensayos de senescencia de hojas separadas se calificó el progreso de la senescencia cualitativamente para cada muestra de tejido como 0 – sin posibles signos de senescencia; 1 – primeros signos visibles de senescencia con color verde pálido: 2 – ulterior progresión de senescencia con color amarillo notable; 3 – tejido principalmente de color amarillo, aunque permanecía evidente un color verde pálido; 4-progresión a color totalmente amarillo; 5 – color amarillo con algo de palidez y parches de necrosis (Figuras 39 y 41).

Ejemplo 15

Producción de plantas de trigo transgénicas

La transformación genética de trigo se basó en la transformación biolística de embriones cigóticos de la línea Triticum aestivum L Bobwhite 26 de trigo tal como se indica en las Figuras 27 y 28.

El gen quimérico atmyb32::ipt se insertó en el genoma de trigo mediante bombardeo de partículas con plásmido entero para incorporar también las secuencias de vector esqueleto al genoma (Figura 24).

Se ha obtenido la secuencia completa del vector de transformación (Figura 25). La modificación genética se caracterizó para la presencia del gen candidato mediante análisis Southern de la generación T1 (Figura 42).

La Figura 42 ilustra el análisis de hibridación Southern de plantas de trigo transgénicas. Se aisló el ADN genómico de diferentes líneas T1 de plantas de trigo transgénicas y se digirió con una enzima de restricción para determinar la cantidad de copias de gen candidato. El control es Triticum aestivum ‘Bobwhite 26’ de tipo salvaje no transformado. Las digestiones se sometieron a electroforesis, se transfirieron a membrana de nailon y se sondaron con un gen IPT con rótulo DIG de longitud total, como sonda. Se observó un rango de cantidades de copias.

Ejemplo 16 Expresión de gen IPT en plantas de trigo transgénicas

Se extrajo ARN de tejido de hojas jóvenes de plantas de trigo transgénicas T1 cultivadas en invernadero que contiene el gen IPT dirigido por el promotor AtMYB32 y se preparó la primera cadena de cADN.

Se determinó la expresión cuantitativa del transgén mediante una sonda basada en el método qRT-PCR para la secuencia blanco. Se presentan ejemplos representativos de líneas de expresión alta, mediana y baja para cada una de las construcciones en la Figura 43. También se usó un cebador /sonda diseñada para el gen endógeno de sacarosa sintetasa como control. Todos los gráficos de amplificación del gen de control comenzaron con un ciclo entre sí para indicar las diferencias en el nivel de detección de GMO debido a la variación de expresión.

Los cebadores y la sonda PCR son específicos para la secuencia blanco, lo cual da por resultado fluorescencia detectable que es proporcional a la cantidad de producto PCR acumulado. El plásmido de ADN diluido en forma seriada que contiene la secuencia blanco detectada se empleó para crear una curva estándar para la cuantificación.

Ejemplo 17 Morfología vegetal en plantas de trigo transgénicas

Se observaron las diferencias de características de crecimiento en el invernadero entre las líneas de trigo transgénicas. Los fenotipos predominantes observados entre las plantas T1 de trigo incluyeron detención de la altura de las plantas, intensidad de semillas, cantidad de hojas, y biomasa vegetativa (Figura 44).

Ejemplo 18 Retraso de la senescencia de hojas separadas en plantas de trigo transgénicas

Se usó un ensayo de hojas caídas para evaluar el envejecimiento inducido y el fenotipo de senescencia de las hojas de trigo transformadas, comparados con controles nulos (Figura 45). Los controles nulos son líneas de progenie que han sido sometidas al proceso de transformación pero no contienen secuencias blanco después del cruzamiento.

También se entenderá que el término “comprende” (o sus variantes gramaticales) tal como se usa en la presente memoria descriptiva es equivalente al término “incluye” y no se debe tomar como excluyente de la presencia de otros elementos o propiedades.

Los documentos citados en la presente memoria descriptiva tienen solo fines de referencia y su inclusión no es un reconocimiento de que formen parte del conocimiento general común en la técnica relevante.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Agriculture Victoria Services PTY Ltd La Trobe University

<120> Manipulación de senescencia vegetal mediante promotores modificados

<130> 118-006

<150> EP 08733383.7

<151>

<150> PCT/AU2008/000556

<151>

<150> US 11/798.526

<151>

<160> 15

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 941

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

<210> 2

<211> 588

<212> ADN 10 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210> 3

<211> 468

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

<210> 4

<211> 419

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

10 <210> 5

<211> 723

<212> ADN

<213> Agrobacterium tumefaciens

15 <400> 5

<210> 6

<211> 240

<212> PRT

<213> Agrobacterium tumefaciens

<400> 6

<210> 7

<211> 975

<212> ADN

<213> Lotus japonicus

<400> 7

<210> 8

<211> 324

<212> PRT

<213> Lotus japonicus

<400> 8

<210> 9

<211> 1053

<212> ADN

<213> Petunia x hybrida

<400> 9

<210> 10

<211> 350

<212> PRT

<213> Petunia x hybrida

<400> 10

<210> 11

<211> 10786 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 11

<210> 12

<211> 10468 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 12

<210> 13

<211> 11000

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética

<400> 13

<210> 14

<211> 10682 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 14

<210> 15

<211> 7862 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Construcción sintética 10

<400> 15

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para manipular la senescencia en una planta, incluyendo dicho método introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº: 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos, en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

   (a)

   uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

   (b)

   uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

2. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que entre uno y diez, preferentemente entre tres y ocho, preferentemente entre cinco y siete motivos específicos de raíz se suprimen o inactivan en dicho promotor del gen

   myb.

3. 3.

   Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que entre uno y treinta, preferentemente entre tres y quince, preferentemente entre cuatro y diez motivos específicos de polen se suprimen o inactivan en dicho promotor del gen myb.

4. 4.

   Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina es un gen de isopentenil transferasa (ipt)o sho, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos.

5. 5.

   Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacones 1 a 4, en el que dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina incluye una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las Secuencias ID No: 5, 7 y 9, secuencias que codifican los polipéptidos que tienen una secuencia de las Secuencias ID No: 6, 8 y 10, y sus fragmentos y variantes funcionalmente activos.

6. 6.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1, teniendo dicho promotor del gen myb entre uno y diez motivos específicos de raíz suprimidos o inactivados, teniendo dichos motivos específicos de raíz una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o teniendo entre uno y treinta motivos específicos de polen suprimidos o inactivados, teniendo dichos motivos específicos de polen una secuencia de consenso TTCT o AGAA; estando dicho promotor modificado del gen myb ligado operativamente a un gen ipt o sho.

7. 7.

   Un vector capaz de manipular la senescencia en una planta, incluyendo dicho vector un promotor modificado del gen myb, que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº: 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos; en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

   (a)

   uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

   (b)

   uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

8. 8.

   Un vector de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina es un gen de isopentenil transferasa (ipt)o sho o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos.

9. 9.

   Una célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta transgénica, con características de senescencia modificadas, incluyendo dichas célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº: 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos; en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

   (a)

   uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

   (b)

   uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye

   una secuencia de consenso TTCT o AGAA.
10. 10. Una célula vegetal, planta, semilla de planta u otra parte de planta transgénica, de acuerdo con la reivindicación 9 producida por un método que incluye introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº: 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activo, en el que dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

    (a)

    uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

    (b)

    uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

11. 11.

    Una planta, semilla de planta u otra parte de planta transgénica derivada de una célula vegetal o planta de acuerdo con la reivindicación 10 y que comprenden dicha construcción genética.

12. 12.

    Un método para incrementar la biomasa en una planta, incluyendo dicho método introducir en dicha planta una construcción genética que incluye un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tienen al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº: 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos; en donde dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

    (a)

    uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

    (b)

    uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

13. 13.

    Un vector capaz de incrementar la biomasa en una planta, incluyendo dicho vector un promotor modificado del gen myb que incluye una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, o un fragmento o una variante funcionalmente activos que tiene al menos 95 % de identidad con la parte de SEC ID Nº: 1 a la que corresponden el fragmento o la variante y que tiene un tamaño de al menos 300 nucleótidos, ligado operativamente a un gen que codifica una enzima que interviene en la biosíntesis de una citoquinina, o uno de sus fragmentos o variantes funcionalmente activos, en en el que dicho promotor del gen myb se modifica para suprimir o inactivar:

    (a)

    uno o más motivos específicos de raíz en donde cada uno de dichos motivos específicos de raíz incluye una secuencia de consenso ATATT o AATAT; o

    (b)

    uno o más motivos específicos de polen en donde cada uno de dichos motivos específicos de polen incluye una secuencia de consenso TTCT o AGAA.

    Cosechar espigas de trigo