ES2288478T3

ES2288478T3 - Metodo mejorado para la transformacion de algodon, mediada por agrobacterium.

Info

Publication number: ES2288478T3
Application number: ES00936770T
Authority: ES
Inventors: Arlette Reynaerts; Anne De Sonville
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1999-05-19
Filing date: 2000-05-18
Publication date: 2008-01-16
Anticipated expiration: 2020-05-18
Also published as: BR0010749B1; EP1183377A1; BR0010749A; ZA200109521B; TR200103311T2; DE60035272D1; CN1234869C; CN1351668A; ATE365218T1; AU5214800A; WO2000071733A1; AU772686B2; EP1183377B1; MXPA01011871A

Abstract

Un método para producir una planta transgénica de algodón, comprendiendo dicho método: a) cultivar concomitantemente un callo embriogénico de algodón cultivado en un medio sólido con células de Agrobacterium, comprendiendo dichas células de Agrobacterium un fragmento de ADN que interesa, engarzado operativamente con por lo menos un borde de ADN - T, en la presencia de un compuesto fenólico vegetal, capaz de inducir una expresión aumentada de un gen vir en dichas células de Agrobacterium, durante un período de tiempo que es suficiente para generar un callo embriogénico, que comprende una célula transformada de algodón; y b) regenerar una planta transgénica de algodón a partir de dicha célula transformada.

Description

Método mejorado para la transformación de algodón, mediada por Agrobacterium.

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Este invento se refiere al sector de la transformación de plantas, particularmente a un método mejorado para la transformación de algodón, mediada por Agrobacterium.

El algodón es una importante planta cultivada, que se hace crecer principalmente por su plumón, que proporciona mucha cantidad de la fibra de alta calidad para la industria textil. La simiente de algodón es también un artículo de consumo valioso, puesto que proporciona una fuente para aceite, harina y cáscaras de semillas.

Aproximadamente un 90% del algodón que crece en todo el mundo es Gossypium hirsutum L., mientras que el Gossypium barbadense constituye aproximadamente un 8%.

La mejoría de varios rasgos, tales como la resistencia a las plagas, al estrés o a las enfermedades, la calidad de las fibras, un contenido reducido de gosipol, se ha obtenido mediante técnicas de procreación convencionales, y se puede conseguir una mejoría adicional de estos y otros rasgos usando técnicas moleculares y genéticas.

Están disponibles varios métodos para la transformación del algodón incluyendo la transformación, mediada por Agrobacterium de explantes de algodón, tales como cotiledones aislados, hipocótilos aislados y zonas de transición de hipocótilos aislados, así como la transferencia directa de genes mediante bombardeo con microproyectiles de tejidos meristemáticos de algodón.

Firoozabady y colaboradores (1987, Plant Molecular Biology 10:105-116) describieron la transformación de tejidos de cotiledones de algodón mediante Agrobacterium tumefaciens y la regeneración de las plantas transgénicas.

Umbeck y colaboradores (1987, Bio/Technology 5: 263-266) informaron acerca de los resultados de la transformación de algodón por la vía de Agrobacterium usando hipocótilos como explantes.

Los documentos de publicación PCT ("WO") 89/05344, de patente de los EE.UU. ("US") 5.244.802 y US
5.583.036 proporcionan unos métodos para la regeneración de algodón mediante cultivo de tejidos y de suspensiones, partiendo de explantes, que son los hipocótilos, cotiledones o embriones inmaduros. También se enseña un método para transformar el algodón y mejorar el algodón mediante crecimiento selectivo.

Los documentos WO 89/12102 y US 5.164.310 se refieren a un nuevo método para transformar y regenerar rápidamente un tejido de plantas. El método emplea unos tejidos objetivos que son los ápices de vástagos, ampliando de esta manera la gama de especies para transformación y reduciendo el riesgo de una variación somaclonal.

El documento WO 98/15622 proporciona un método para la regeneración in vitro de plantas fértiles de Gossypium, en el que se escinden y cultivan células procedentes del tejido de la región de transición de plántulas. Se describe también un método para la producción de plantas transgénicas de Gossypium, capaces de transmitir un gen ajeno a una progenie, en el que las células derivadas del tejido de la región de transición de plántulas son destinadas a transformación.

El documento WO 97/12512 proporciona un método para regenerar plantas de algodón a partir de un tejido de explantes, que permite la generación de un callo embriogénico a partir de un explante de tejido de algodón, tal como un hipocótilo, que no es cultivado en medios para la iniciación de callos que tienen hormonas vegetales exógenas. El método se puede utilizar en la transformación de plantas de algodón, mediada por Agrobacterium.

Los documentos US 5.004.863 y US 5.159.135 y la publicación de patente europea "EP" 0.270.355 describen en su totalidad un método para conseguir una transformación genética de plantas y linajes de algodón, sometiendo a tejidos inmaduros de algodón, tales como segmentos de hipocótilos, a una transformación genética in vitro mediada por Agrobacterium.

El documento WO 97/43430 se refiere a un método versátil para regenerar con rapidez plantas de algodón a partir de explantes de tejidos meristemáticos apicales y/o nodales, que puede ser acoplado con métodos bien conocidos de transformación, tal como una transformación mediada por Agrobacterium para la producción rápida de variedades de algodón sometidas a ingeniería genética, que tienen importancia agronómica. Los documentos WO 92/15675 y EP 0.531.506 describen un método para la transformación de algodón, mediada por partículas, que permite someter directamente a ingeniería genética a linajes de algodón de élite, sin la necesidad de cultivar tejidos ni de proliferar callos, que implica una escisión de los ejes embrionarios a partir de semillas en germinación y una eclosión de partículas, que llevan genes ajenos, dentro de los ejes embrionarios.

Finer y Mc Mullen (1990, Plant Cell Reports, 8: 586-589) describieron la transformación de algodón por medio de un bombardeo con partículas de cultivos de suspensiones embriogénicas.

McCabe y Martinell, (1993, Bio/Technology 11: 596-598) han descrito la transformación de cultivares de algodón de élite mediante un bombardeo con partículas de un tejido meristemático de algodón procedente de ejes embrionarios escindidos.

Hansen y colaboradores (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7603-7607) han descrito una cepa de Agrobacterium que comprende un mutante virG constitutivo (viiGN54D) que conduce a unas eficiencias aumentadas de transformación de cotiledones aislados de algodón.

Veluthambi y colaboradores (1989, Journal of Bacteriology 171: 3696-3703) describieron una transformación notablemente aumentada de puntas de vástagos de algodón mediante la adición simultánea de acetosiringona y nopalina en el momento de la infección.

Los métodos de la técnica anterior para la transformación de algodón, mediada por Agrobacterium, padecen de la principal desventaja, como se indica en la cita de Murray y colaboradores (1993, en Transgenic Plants [Plantas Transgénicas] volumen 2, Academic Press Inc., páginas 153-168), de que es extremadamente largo el período de tiempo requerido para regenerar una planta transgénica a partir de un explante que ha sido cultivado concomitantemente con células de Agrobacterium.

Además, surge un problema adicional a partir del hecho de que todos los métodos de transformación de algodón, mediada por Agrobacterium, requieren la regeneración de un callo embriogénico a partir del explante que contiene las células transformadas, como una operación intermedia en la regeneración de plantas transgénicas de algodón. Puesto que no todas las células transformadas del explante son necesariamente competentes para la iniciación de un callo embriogénico, se observa con estos métodos una pérdida de regeneración de un cierto número de células potencialmente transgénicas, lo cual da como resultado consiguientemente una baja eficiencia de transformación. Un aumento en los números iniciales de explantes de algodón transformados putativos con el fin de compensar esta pérdida, da como resultado un enorme aumento de la cantidad de trabajo que se ha de dedicar para obtener plantas transgénicas regeneradas de algodón.

El documento US 4.954.442 describe que una mezcla de una opina (nopalina) y acetosiringona mejora la eficiencia de la transformación de ápices de vástagos de algodón, mediada por Agrobacterium.

Hoshino y colaboradores, 1998 (Plant Biotechnol. 15(1) 29-33) describen la producción de plantas transgénicas de viña mediante una cultivación concomitante de un callo embriogénico con Agrobacterium tumefaciens y una selección de embriones secundarios. La eficiencia de transformación de los callos embriogénicos evaluados por un ensayo histoquímico con GUS era aumentada por la adición de acetosiringona al medio para cultivación concomitante.

El documento WO98/3721 describe un procedimiento para integrar un fragmento de ADN en el genoma de una célula de una planta monocotiledónea, comprendiendo el procedimiento las operaciones de: 1) incubar, antes de la puesta en contacto con el fragmento de ADN, un cultivo de células de plantas monocotiledóneas sin transformar, en un medio que comprende un compuesto fenólico vegetal, durante un período de tiempo que es suficiente para estimular la división celular y aumentar la competencia para la integración de un ADN ajeno; y 2) poner en contacto las células sin transformar con el fragmento de ADN en unas condiciones en las que el fragmento de ADN es recogido por las células sin transformar y es integrado establemente en el genoma de las células sin transformar, para generar células transformadas.

El documento WO 89/05344 ha sugerido en términos generales que se puede usar un callo embriogénico como un material de partida apropiado para la transformación, mediada por Agrobacterium, de un callo de algodón. No obstante, durante la pasada década no se hicieron informes acerca de una producción satisfactoria de plantas transgénicas de algodón usando la cultivación concomitante de un callo embriogénico con Agrobacterium.

En una cierta extensión, el problema ha sido aliviado por medio de unas técnicas que comprenden un bombardeo con microproyectiles de un tejido meristemático, que da como resultado un mayor número de linajes transgénicos de algodón. No obstante, la generación de plantas de algodón transformadas en la línea germinal, que son capaces de hacer pasar el transgén a su progenie, es infrecuente.

La especialidad es deficiente, por lo tanto, en proporcionar un método eficiente, en términos tanto del tiempo requerido, como de la eficiencia de transformación, para la generación de plantas transgénicas de algodón, que sean capaces de transferir un ADN incorporado por medios ajenos en sus plantas de progenie.

Sumario y objetos del invento

A la vista de los defectos precedentes, asociados con los procedimientos de la técnica anterior para la transformación de algodón, así como de otras desventajas que no se han mencionado específicamente con anterioridad, debería resultar evidente que todavía existe una necesidad en la especialidad de un método para transformar algodón que consiga la combinación, hasta ahora ilusoria, de una alta eficiencia de transformación en un periodo de tiempo relativamente corto. Por lo tanto, un objetivo principal del presente invento es satisfacer esa necesidad, proporcionando un método para la producción de una planta transgénica de algodón, preferiblemente de una planta transgénica fértil, mediante una transformación mediada por Agrobacterium, que comprende cultivar concomitantemente células de Agrobacterium que comprenden un fragmento de ADN interesante, engarzado operativamente con por lo menos un borde de ADN - T, con un callo embriogénico de algodón, en la presencia de un compuesto fenólico vegetal.

Otro objeto del invento es proporcionar un método para producir una planta transgénica de algodón que elimine la operación de generar un callo embriogénico a partir de un explante de algodón que comprende las células transformadas, reduciendo de esta manera la pérdida potencial de linajes de algodón transformados a partir de células de plantas transformadas que no son capaces de generar un callo embriogénico, y de esta manera aumentando las frecuencias de transformación.

En un primer aspecto, el presente invento se refiere a un método para producir una planta transgénica de algodón, que comprende la incubación de células de Agrobacterium, que comprenden un fragmento de ADN interesante, engarzado operativamente a por lo menos un borde de ADN - T, con un compuesto fenólico vegetal, antes de o durante la cultivación concomitante de un callo embriogénico de algodón con las células de Agrobacterium.

En otro aspecto, el presente invento se refiere a un método para producir una planta transgénica de algodón, que comprende:

i): cultivar concomitantemente un callo embriogénico de algodón, preferiblemente derivado de un hipocótilo de una plántula de algodón, con células de Agrobacterium, comprendiendo las células de Agrobacterium un fragmento de ADN interesante, engarzado operativamente a por lo menos un borde de ADN - T, en la presencia de un compuesto fenólico vegetal, seleccionado preferiblemente entre el grupo que consiste en acetosiringona, \alpha-hidroxi-acetosiringona, ácido sinápico, ácido siríngico, ácido ferúlico, catecol, ácido p-hidroxibenzoico, ácido \beta-resorcílico, ácido protocatecuico, ácido pirogálico, ácido gálico y vainillina, presente preferiblemente en un intervalo de concentraciones comprendidas entre aproximadamente 50 \muM y aproximadamente 400 \muM, durante un período de tiempo que es suficiente para generar un callo embriogénico que comprende una célula de algodón transformada, preferiblemente durante alrededor de 3 a 4 días;

ii): regenerar una planta transgénica de algodón a partir de dicha célula transformada; y opcionalmente

iii): cruzar dicha planta transgénica de algodón con otra planta de algodón.

En otro aspecto, el invento se refiere al uso de un compuesto fenólico vegetal, preferiblemente acetosiringona, a partir de una transformación de un callo embriogénico de algodón, mediada por Agrobacterium.

Descripción detallada del invento

Los autores del invento han desarrollado un método mejorado y acelerado para la transformación mediada por Agrobacterium, destinado a la producción de plantas transgénicas de algodón, que comprende el uso de un compuesto fenólico vegetal tal como acetosiringona, durante una transformación de un callo embriogénico de algodón, mediada por Agrobacterium, preferiblemente durante la etapa de cultivación concomitante de un callo embriogénico de algodón con células de Agrobacterium. Este método conduce en promedio a una reducción del tiempo en el período que comienza desde la cultivación concomitante hasta el momento en el que la planta transgénica de algodón está lo suficientemente desarrollada como para ser transferida al suelo, preferiblemente en condiciones de invernadero, de por lo menos 2 a 3 meses.

Puesto que el método mejorado de este invento comprende el uso de un callo embriogénico como tejido de partida para la transformación, se elimina la operación de generar un callo embriogénico a partir del explante de algodón que comprende las células transformadas. Consiguientemente, se reduce la pérdida potencial de linajes de algodón transformados a partir de células de plantas transformadas que no son capaces de generar un callo embriogénico, y se aumentan las frecuencias de transformación.

Además, un callo embriogénico, una vez iniciado, se puede mantener íntegro (siempre y cuando que una variación somaclonal no interfiera con el fenotipo de plantas regeneradas), facilitando de esta manera el manejo de la existencia de material de partida para experimentos de transformación.

Desde luego, los autores del invento han descubierto con sorpresa que una transformación, mediada por Agrobacterium, de un callo embriogénico de algodón, necesitaba la adición de un compuesto fenólico vegetal tal como acetosiringona, pero sin limitarse a ella, preferiblemente en la etapa de cultivación concomitante. En ninguna parte de la técnica anterior se ha sugerido que la inclusión de dicho compuesto fenólico vegetal, de todas las variantes posibles, conduciría a una satisfactoria transformación, mediada por Agrobacterium, de un callo embriogénico de algodón.

En una forma de realización, el invento se refiere al uso de un compuesto fenólico vegetal durante la transformación, mediada por Agrobacterium, de un callo embriogénico de algodón.

Los "compuestos fenólicos vegetales" o "fenólicos vegetales" apropiados para el invento son aquellas moléculas fenólicas sustituidas que son capaces de inducir una respuesta quimiotáctica positiva, particularmente aquellas que son capaces de inducir una expresión aumentada de un gen vir en un plásmido Ti (inductor de tumores) que contiene Agrobacterium sp., particularmente de un plásmido Ti que contiene Agrobacterium tumefaciens. Ciertos métodos para medir una respuesta quimiotáctica a compuestos fenólicos vegetales, han sido descritos por Ashby y colaboradores (1988, J. Bacteriol. 170: 4181-4187), y ciertos métodos para medir la inducción de la expresión de un gen vir son también perfectamente conocidos (Stachel y colaboradores, 1985 Nature 318: 624-629; Bolton y colaboradores 1986, Science 232: 983-985).

Compuestos fenólicos vegetales preferidos son los que se encuentran en materiales exudados de heridas de células de plantas. Uno de los compuestos fenólicos vegetales mejor conocidos es la acetosiringona, que está presente en un cierto número de células heridas e intactas de diversas plantas, si bien en diferentes concentraciones. Sin embargo, la acetosiringona (3,5-dimetoxi-4-hidroxi-acetofenona) no es el único compuesto fenólico vegetal que puede inducir la expresión de genes vir. Otros ejemplos son la \alpha-hidroxi-acetosiringona, el ácido sinápico (ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinámico), el ácido siríngico (ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxi-benzoico), el ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxi-cinámico), el catecol (1,2-dihidroxi-benceno), el ácido p-hidroxibenzoico (ácido 4-hidroxi-benzoico), el ácido \beta-resorcílico (ácido 2,4-dihidroxi-benzoico), el ácido protocatecuico (ácido 3,4-dihidroxi-benzoico), el ácido pirogálico (ácido 2,3,4-trihidroxi-benzoico), el ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidroxi-benzoico) y la vainillina (3-metoxi-4-hidroxi-benzaldehído), y se sabe o espera que estos compuestos fenólicos son capaces de reemplazar a la acetosiringona con unos resultados similares. Como se usan en este contexto, las mencionadas moléculas son citadas también como compuestos fenólicos vegetales.

Los compuestos fenólicos vegetales se pueden utilizar ya sea a solas o en combinación con otros compuestos fenólicos vegetales. Se espera que ciertos compuestos tales como osmoprotectores (p.ej. L-prolina o betaína), fitohormonas (entre otras la NAA), opinas, o azúcares, actúen sinérgicamente cuando se añadan en combinación con compuestos fenólicos vegetales.

En una forma de realización preferida, el invento se refiere a un método para transformar una planta de algodón, es decir, producir una planta transgénica de algodón, mediante introducción de un fragmento de ADN que interese en el genoma de las células de una planta de algodón, en que el método comprende:

a): cultivar concomitantemente un callo embriogénico de algodón con células de Agrobacterium, comprendiendo dichas células de Agrobacterium un fragmento de ADN que interesa, engarzado operativamente a por lo menos un borde de ADN - T, en la presencia de un compuesto fenólico vegetal, durante un período de tiempo que es suficiente para generar un callo embriogénico que comprende una célula transformada de algodón; y

b): regenerar una planta transgénica de algodón a partir de dicha célula transformada.

Los métodos proporcionados por el invento emplean un callo embriogénico de algodón como material de partida para la cultivación concomitante con las células de Agrobacterium. Como se usa en el presente contexto, el término "callo embriogénico de algodón" o "callo embriogénico derivado de un explante de algodón" se refiere a un tejido de callo compacto o sólido, cultivado en medios sólidos, que se deriva de un explante de algodón, que se puede regenerar para dar una planta intacta de algodón mediante una embriogénesis somática. Esta definición de un callo embriogénico de algodón no incluye a células embriogénicas en suspensión, cultivadas en un medio líquido.

Métodos para inducir un callo embriogénico a partir de un explante de algodón han sido descritos en la especialidad, p.ej. en el documento WO 97/12512.

Resultará claro para un profesional experto que la fuente del explante de algodón a partir de la que se ha derivado el callo embriogénico tiene solamente una importancia limitada para el método del presente invento. Un callo embriogénico se puede derivar de cualquier explante apropiado de algodón tal como, pero sin limitarse a, hipocótilos, cotiledones, embriones inmaduros o maduros, etc.

Preferiblemente, el callo embriogénico de algodón usado en los métodos de transformación que aquí se describen, se obtuvo por incubación de explantes de hipocótilos de algodón en un medio para la inducción de callos, exento de hormonas, como se describe en el documento WO 97/12512.

El concepto de "cultivación concomitante" se usa en el presente contexto para indicar el proceso de puesta en contacto entre el callo embriogénico de algodón y las células de Agrobacterium, antes de la adición de compuestos bacteriostáticos o bactericidas con el fin de inhibir o eliminar las Agrobacterias. La "etapa de cultivación concomitante" de un método de transformación mediada por Agrobacterium, se refiere por lo tanto al período de tiempo que transcurre entre la puesta en contacto inicial de las Agrobacterias con el tejido vegetal, hasta el momento en que se añade un compuesto bacteriostático o bactericida al medio, con la intención de eliminar o inhibir las cepas de Agrobacterium, que comprenden el fragmento de ADN que interesa.

El concepto de "un fragmento de ADN que interesa" se usa aquí para describir cualquier fragmento de ADN que se quisiera introducir en el genoma de células de una planta de algodón, independientemente de que éste codifique o no una proteína o un polipéptido o bien un ARN. Desde luego, un fragmento de ADN se puede introducir principalmente para finalidades de marcación. El único requisito previo para el fragmento de ADN que interesa es que éste deberá estar "engarzado operativamente a por lo menos un borde de ADN - T".

Como se usa aquí, el concepto de "un borde de ADN - T" abarca un fragmento de ADN que comprende una secuencia con una longitud de aproximadamente 25 nucleótidos, capaz de ser reconocida por los productos de genes de virulencia de una cepa de Agrobacterium, preferiblemente una cepa de A. tumefaciens o A. rhizogenes, y suficiente para transferir el ADN engarzado operativamente a células eucarióticas, preferiblemente células de plantas, particularmente suficiente para la transferencia y la integración de ADN engarzado operativamente dentro del genoma de una célula eucariótica, preferiblemente una célula de planta. Está claro que esta definición abarca todos los bordes de ADN - T presentes en la naturaleza, de plásmidos de tipo salvaje, así como cualquier derivado funcional de los mismos, incluyendo a bordes de ADN - T sintetizados químicamente.

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Preferiblemente, el ADN que interesa está situado entre dos bordes de ADN - T, preferiblemente en un vector de ADN - T capaz de formar un plásmido Ti híbrido por simple cruzamiento pasando por un fragmento de homología de ADN entre el vector de ADN - T y el plásmido Ti cooperante.

El uso de un compuesto fenólico vegetal de acuerdo con el invento aumenta la eficiencia de transformación de una transformación de ADN, mediada por Agrobacterium, de un callo embriogénico de algodón, y se espera que este efecto sea independiente del fundamento cromosómico del anfitrión de Agrobacterium, del tipo del plásmido Ti, del plásmido cooperante o del vector de ADN - T que se use.

Fundamentos cromosómicos bacterianos particularmente preferidos son proporcionados por A. tumefaciens C58C1 (Van Larebeke y colaboradores, 1974, Nature 252: 169-170), A136 (Watson y colaboradores, 1975, J. Bacteriol 123: 255-264) o LBA4011 (Klapwijk y colaboradores, 1980, J. Bacteriol 141, 128-136).

En una primera forma de realización, la cepa de Agrobacterium, usada para formar el tejido vegetal previamente cultivado con el compuesto fenólico vegetal contiene un plásmido Ti del tipo de LL-succinamopina, preferiblemente desarmado, tal como el pEHA101.

El método del invento se puede usar también en combinación con cepas particulares de Agrobacterium, con el fin de aumentar aún más la eficiencia de transformación, tales como cepas de Agrobacterium, en las que se ha alterado la expresión de un gen vir y/o la inducción del mismo, debido a la presencia de genes virA o virG mutantes o quiméricos (p.ej. Hansen y colaboradores 1994, supra; Chen y Winans, 1991, J. Bacteriol. 173: 1139-1144; Scheeren-Groot y colaboradores 1994, J. Bacteriol. 176: 6418-6246).

En otra forma de realización, se pueden usar cepas de Agrobacterium que comprenden copias suplementarias del gen virG, particularmente el denominado gen super virG derivado de pTiBo542, preferiblemente engarzado a un plásmido de copias múltiples, para aumentar aún más la eficiencia de transformación.

Se cree que la concentración del compuesto fenólico vegetal en el medio de cultivación concomitante también tiene un efecto sobre la eficiencia de transformación. Sin embargo, dentro de ciertos intervalos de concentraciones, el efecto es mínimo. El intervalo óptimo de concentraciones de compuestos fenólicos vegetales en el medio de cultivación concomitante puede variar dependiendo de la especie o variedad a partir de la que se deriva el callo embriogénico de algodón, pero se espera que una de aproximadamente 100 \muM sea una concentración apropiada para muchas finalidades. La concentración óptima puede depender también de la naturaleza del compuesto fenólico vegetal específico que se use, particularmente de su fuerza promotora de división celular.

Se encontró, por ejemplo, que la concentración óptima para la acetosiringona es aproximadamente 100 \muM, pero se pueden usar concentraciones tan bajas como la de aproximadamente 25 \muM con el fin de obtener un buen efecto sobre la eficiencia de transformación. Similarmente, se espera que unas concentraciones más altas, hasta de aproximadamente 400 \muM, proporcionarán resultados similares.

Unas concentraciones comparables se aplican a otros compuestos fenólicos vegetales, y se pueden establecer fácilmente concentraciones óptimas mediante experimentación de acuerdo con este invento.

Unos tiempos típicos de cultivación concomitante para generar un callo embriogénico de algodón que comprende células transformadas, son los de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 días, pero se espera que un tiempo de cultivación concomitante de un día pueda ser suficiente para generar por lo menos algunas células transformadas. Además, se espera que los tiempos de cultivación concomitante no excedan de aproximadamente 7 días.

Está claro para un profesional experto que, además de la inclusión de un compuesto fenólico vegetal durante una cultivación concomitante de un callo embriogénico de algodón con células de Agrobacterium, las células de Agrobacterium usadas pueden también ser inducidas previamente por incubación con un compuesto fenólico vegetal durante un período de tiempo que es suficiente para inducir los genes de virulencia de las células de Agrobacterium.

Más aún, se espera que una inducción previa de células de Agrobacterium con un compuesto fenólico vegetal durante un período de tiempo que es suficiente para inducir los genes de virulencia de las células de Agrobacterium, puede evitar el requisito de la inclusión de un compuesto fenólico vegetal durante la etapa de cultivación concomitante.

Por lo tanto, en otra forma de realización preferida, el invento se refiere a un método para transformar una planta de algodón, es decir, para producir una planta transgénica de algodón, por introducción de un fragmento de ADN que interesa en el genoma de las células de una planta de algodón, en que el método comprende:

a): incubar un cultivo de células de Agrobacterium que comprende un fragmento de ADN que interesa, engarzado operativamente a por lo menos un borde de ADN - T, con un compuesto fenólico vegetal, durante un período de tiempo que es suficiente como para inducir genes de virulencia de dichas células de Agrobacterium;

b): cultivar concomitantemente un callo embriogénicos derivado de un explante de algodón con dichas células de Agrobacterium incubadas con dicho compuesto fenólico vegetal, de manera tal que se genere un callo embriogénico que comprenda una célula transformada de algodón; y

c): regenerar una planta transgénica de algodón a partir de dicha célula transformada.

Métodos para inducir previamente los genes de virulencia de células de Agrobacterium por incubación con unos compuestos fenólicos vegetales así como métodos para determinar si se inducen los genes de virulencia de una cepa de Agrobacterium, están disponibles en la especialidad, p.ej. tal como ha sido descrito por Stachel y colaboradores, 1985, o Bolton y colaboradores 1986.

Métodos optimizados para una inducción de Agrobacterias con compuestos fenólicos vegetales, particularmente con acetosiringona, han sido descritos p.ej. por Vernade y colaboradores, (1988, J. of Bacteriology 170: 5822-5829) incorporados en el presente documento por su referencia.

El período de tiempo de incubación de células agrobacterianas con un compuesto fenólico vegetal, suficiente para inducir los genes de virulencia, puede variar entre unas pocas horas y aproximadamente dos días antes de la cultivación concomitante, pero típicamente será suficiente una incubación durante alrededor de 1 día antes de la cultivación concomitante. Similarmente, la concentración del compuesto fenólico vegetal puede variar entre aproximadamente 50 \muM y aproximadamente 400 \muM, pero típicamente la de alrededor de 100 \muM será una concentración preferida para el compuesto fenólico vegetal.

Después de una cultivación concomitante, el callo embriogénico de algodón es sometido preferiblemente a un régimen de selección con el fin de separar células transformadas con respecto de células sin transformar, o por lo menos de enriquecer las células transformadas.

A este fin, el ADN ajeno usado en el método de este invento comprende preferiblemente también un gen marcador, cuya expresión permite la separación de células transformadas con respecto de células no transformadas. Dicho gen marcador codifica generalmente una proteína que permite distinguir fenotípicamente células transformadas con respecto de células no transformadas. En el caso de un gen marcador seleccionable, la resistencia a un antibiótico o a otro compuesto químico que normalmente es tóxico para las células, se proporciona generalmente a la célula mediante expresión de ese gen marcador. En las plantas, el gen marcador seleccionable puede por lo tanto codificar también una proteína que confiera resistencia a un herbicida, tal como un herbicida que comprende un inhibidor de la glutamina sintetasa (p.ej. fosfinotricina) como un ingrediente activo. Un ejemplo de tales genes es el de los genes que codifican una acetil transferasa de fosfinotricina tales como los genes sfr o sfrv (documentos EP 0,242.236; EP 0,242.246; De Block y colaboradores 1987, EMBO J. 6:2513-2518). Sin embargo, también puede ocurrir que el fenotipo distinguible no se pueda seleccionar, como se da el caso de genes marcadores, que normalmente se citan como genes marcadores explorables, incluyendo, pero sin limitarse a, las proteínas fluorescentes verdes (GFP) o las \beta-glucuronidasas (GUS) o las \beta-lactamasas, bien conocidas en la especialidad.

Más aún, usando métodos tales como los métodos de amplificación de ADN basados en una PCR (reacción en cadena de la polimerasa), cualquier secuencia de ADN, incluyendo una parte de la secuencia del ADN que interesa, se puede usar como una marca para la verificación de la presencia del fragmento de ADN que interesa.

La selección de células transformadas de callos embriogénicos se realiza preferiblemente en medios sólidos, pero también puede ser suplementada o reemplazada por una fase de selección en un medio líquido.

No hace falta decir que durante la selección y, si se requiere, durante la fase de regeneración, ha de ser inhibido el crecimiento de Agrobacterium, preferiblemente las células de Agrobacterium han de ser eliminadas. Esto se puede conseguir, tal como es bien conocido en la especialidad, por inclusión dentro del medio de un antibiótico, que es tóxico para Agrobacterias, tal como la cefotaxima, pero sin limitarse a ella.

La regeneración del callo embriogénico transformado para dar linajes de plantas transgénicas de algodón, se puede realizar de acuerdo con métodos que son bien conocidos por los expertos en la especialidad, tales como, pero sin limitarse a, los métodos de regeneración descritos en el documento WO 98/15622.

En una forma de realización preferida, se seleccionan pequeños embriones para su germinación y desarrollo para dar plantas maduras durante la fase de regeneración, preferiblemente haciendo crecer el callo embriogénico en un medio líquido sobre un agitador giratorio, y rechazando para la germinación la fracción de la suspensión líquida de callos embriogénicos o embriones somáticos que pasan a través de un tamiz, tal como un colador para té.

Un "linaje de plantas de algodón" transgénicas, como se usa en el presente contexto, consiste en un grupo de plantas transgénicas de algodón, que se originan de un trozo de callo embriogénico transformado, obtenido durante el proceso de regeneración. En general, las plantas procedentes de un linaje de plantas son genéticamente idénticas, y se originan a partir de un suceso de transformación, comprendiendo por lo tanto los mismos transgenes integrados en las mismas posiciones genómicas. No obstante, plantas individuales procedentes de un linaje de plantas pueden originarse a partir de sucesos de transformación independientes, cuando se usa una transferencia de ADN mediada por Agrobacterium, y por lo tanto pueden diferir unos de otros. Cuando las frecuencias de transformación se expresan por el número de linajes de plantas/100 trozos de callo embriogénico inicial, puede ocurrir que sean incluso mayores las frecuencias de transformación reales (sucesos de transformación/100 trozos de callo inicial).

Los métodos del invento son particularmente idóneos para la transformación de todas las plantas de algodón, a partir de las cuales se pueda derivar un callo embriogénico (tanto Gossypium hirsutum como Gossypium barbadense), particularmente para Coker 312, Coker 310, Coker 5Acala SJ-5, GSC251 10, FiberMax 819, Siokra 1-3, T25, GSA75, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5. Acala SJ-C1, Acala B1644, Acala B1654-26. Acala B1654-43, Acala B3991, Acala GC356, Acala GC510, Acala GAM1, Acala C1, Acala Royale, Acala Maxxa, Acala Prema, Acala B638, Acala B1810, Acala B2724, Acala B4894, Acala B5002, Siokra de "picker (desmotadora)" no Acala, FC2017 variedad "stripper (que se despoja)", Coker 315, STONEVILLE 506, STONEVILLE 825, DP50, DP61, DP90, DP77, DES119, McN235, HBX87, HBX191, HBX107, FC 3027, CHEMBRED A1, CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4, CHEMBRED B1, CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1, CHEMBRED C2, CHEMBRED C3, CHEMBRED C4, PAYMASTER 145, HS26, HS46, SICALA, PIMA S6 y ORO BLANCO PIMA, y plantas con genotipos derivados de ellas.

La planta de algodón transformada obtenida se puede usar en un esquema de procreación convencional para producir más cantidad de plantas de algodón transformadas con las mismas características o para introducir el fragmento de ADN que interesa en otras variedades de la misma especie de algodón o de una especie relacionada con ella, y se inclu-
yen también dentro del alcance del invento unos métodos que comprenden además tales actividades de cultivación.

Los siguientes Ejemplos describen los métodos del invento con detalle. A menos que se diga otra cosa distinta en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos clásicos. tal como se describen en las citas de Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular: un manual de laboratorio], Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los volúmenes 1 y 2 de la obra de Ausubel y colaboradores (1994) Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular], Current Protocols, EE.UU. Los materiales y métodos clásicos para el trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.

Ejemplos

Ejemplo 1

Medios, plásmidos y cepas bacterianas que se usan en los Ejemplos 1.1 Medios

1

2

1 litro del medio AB contiene 50 ml de un tampón AB, 50 ml de sales AB, 5 g/l de glucosa y 12 g/l de agar, si ello fuese apropiado.

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Medio 100:

Sales de Murashige & Skoog +

: 30 g/l de glucosa

: 10 mg/l de tiamina

: 100 mg/l de inositol

: 1 mg/l de ácido nicotínico

: 1 mg/l de piridoxina

: 0,5 g/l del tampón MES

: pH = 5,8

Se añaden 1,6 g/l de Gelrite y 0,75 g/l de MgCl_{2}.6H_{2}O cuando se requiere un medio 100 sólido

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Medio 104:

Sales de Murashige & Skoog +

: 30 g/l de glucosa

: 10 mg/l de tiamina

: 100 mg/l de inositol

: 1 mg/l de ácido nicotínico

: 1 mg/l de piridoxina

: 1 g/l de nitrato de potasio

: 0,5 g/l del tampón MES

: pH = 5,8

Se añaden 2,0 g/l de Gelrite y 0,94 g/l de MgCl_{2}.6H_{2}O cuando se requiere un medio 104 sólido

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Medio 700:

Macro elementos de Steward:

KNO_{3}: 0,506 g/l

NH_{4}NO_{3}: 0,240 g/l

MgSO_{4}.7H_{2}O: 0,493 g/l

KH_{2}PO_{4}: 0,027 g/l

CaCl_{2}.2H_{2}O: 0,176 g/l

\newpage

Micro elementos de Steward::

KI: 0,25 mg/l

MnSO_{4}.H_{2}O: 3,84 mg/l

H_{3}BO_{3}: 1,85 mg/l

ZnSO_{4}.7H_{2}O: 2,59 mg/l

Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O: 0,22 mg/l

CuSO_{4}.5H_{2}O: 0,0075 mg/l

CoCl_{2}.6H_{2}O: 0,0071 mg/l

FeEDTA: 0,7 ml/l de una solución original que contiene 0,54 g de FeCl_{3}.6H_{2}O y 0,74 g de Na_{2}EDTA en 100 ml H_{2}0

Vitaminas:: tiamina 1,5 mg/l

\quad: piridoxina 1,0 mg/l

\quad: ácido nicotínico 0,5 mg/l

sacarosa:: 20 g/l

pH = 6,8

Se solidifica el medio con 1 g/l de Gelrite + 0,47 g/l de MgCl_{2}.6H_{2}O y 2,25 g/l de agar

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Medio 701:

La misma composición que la del medio 700 pero con 30 g/l de glucosa

Se solidifica el medio con 20 g/l de agar

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Medio 702:

La misma composición que la del medio 700 pero con 5 g/l sacarosa

Se solidifica el medio con 1,5 g/l de Gelrite + 0,71 g/l de MgCl_{2}.6H_{2}0 y 5 g/l de agar.

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1.2 Plásmidos y cepas bacterianas Agrobacterium tumefaciens cepa A3311

La A3311 es una cepa C58C1Rif^{R} de A. tumefaciens que comprende el plásmido Ti cooperante pEHA101 (Hood y colaboradores 1986, J. of Bacteriology, 168: 1291-1301) y el vector de ADN - T pTHW136. El plásmido pTHW136 ha sido descrito en el documento WO 98/31822.

Agrobacterium tumefaciens cepa A3784

La A3784 es una cepa C58C1Rif^{R} de A. tumefaciens que comprende el plásmido Ti cooperante pEHA101 (Hood y colaboradores 1986) y el vector de ADN - T pTC0192. El pTCO192 es similar al pGSV71 (documento WO 98/37212) y difiere de este último solamente por la presencia de una región que es homóloga con el gen nptl de pEHA101, situado fuera de los bordes de ADN - T.

Agrobacterium tumefaciens cepa A3724

La A3724 es una cepa C58C1Rif^{R} de A. tumefaciens que comprende el plásmido Ti cooperante pEHA101 (Hood y colaboradores 1986) y el vector de ADN - T pTSVH9901.

El vector de ADN - T pTSVH9901 se deriva del vector de clonación de ADN - T pGSV5 (descrito en el documento WO 98/31822), que comprende entre sus secuencias de borde un gen bar quimérico expresable en plantas, bajo el control de un promotor CaMV35S, y seguido por una señal de formación en el extremo 3' procedente de un gen de nopalina sintasa. El vector de ADN - T pTSVH9901 contiene también entre sus secuencias de borde un gen quimérico Cry9C expresable en plantas, en que el cuadro de lectura abierto que codifica la CRY9C se introduce entre un promotor CaMV35S y una región en el extremo 3', y en que una secuencia directora cab22L ha sido introducida en la región no traducida que codifica un ARNm (mensajero). El vector de ADN - T comprende además una región, que es homóloga con el gen nptl de pEHA101, situada fuera de los bordes de ADN - T.

Agrobacterium tumefaciens cepa A3727

La A3311 es una cepa C58C1Rif^{R} de A. tumefaciens que comprende el plásmido Ti cooperante pEHA101 (Hood y colaboradores 1986) y el vector de ADN - T pTSVH0203.

El vector de ADN - T pTSVH0203 está basado en el vector de clonación de ADN - T pGSV5 (documento WO 98/31822), que comprende entre sus secuencias de borde un gen bar quimérico expresable en plantas, bajo el control de un promotor CaMV35S seguido por una señal de formación en el extremo 3' procedente de un gen de nopalina sintasa.. El vector de ADN - T pTSHV0203 contiene también entre sus secuencias de borde un gen quimérico quimérico Cry1Ab expresable en plantas, en que el cuadro de lectura abierto que codifica la CRY1Ab se introduce entre un promotor CaMV35S y una región en el extremo 3' procedente del gen de octopina sintasa. El ADN - T comprende además una región, que es homóloga con el gen nptl de pEHA101, situada fuera de los bordes de ADN - T.

Ejemplo 2

La inclusión de un compuesto fenólico vegetal, tal como acetosiringona, durante la cultivación concomitante, permite la transformación, mediada por Agrobacterium, de un callo embriogénico de algodón

Un callo embriogénico de algodón se obtuvo de la siguiente manera:

Semillas de algodón de la variedad Coker 312 se desinfectaron usando una solución al 12% de hipoclorito de sodio, y se germinaron individualmente en unos tubos que contenían una solución de Gelrite, 2 g/l de H_{2}O y 0,94 g/l de MgCl_{2}.6H_{2}O. Los tubos se incubaron en la oscuridad a 27-28ºC. Después de 10 a 14 días, se recogieron plántulas, las hipocótilos de las plántulas se cortaron en segmentos de aproximadamente 1 cm y se incubaron en un medio 104 (sin hormonas vegetales) a 28ºC bajo un régimen de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Cada tres semanas, los segmentos se transfirieron a un medio de nueva aportación, hasta que se formó un callo embriogénico (usualmente después de alrededor de 9 semanas). Este callo se retiró de los explantes y se cultivó adicionalmente en un medio 104.

Células de la cepa A 3311 de Agrobacterium se hicieron crecer en un medio AB o un medio MAG, se recogieron y se volvieron a suspender en un medio M104 líquido, de pH 5,2 (ya sea con o sin100 \muM de acetosiringona (AS)) o en un medio MAG con una densidad de aproximadamente 1 x 10^{9} CFU (unidades de formación de colonias)/ml. Se recogieron pequeños trozos de callo embriogénico de algodón, se lavaron en un medio 104 líquido a un pH de 5,2, y se sumergieron en la suspensión de Agrobacterium durante aproximadamente 20 minutos. Los callos embriogénicos infectados fueron luego transferidos a un medio 104 sólido, de pH 5,2, fueron suplementados ya sea con 100 \muM de AS y 0,5 g/l de casamino ácidos (cas. ácidos), o con 100 \muM de AS y 0,5 g/l de casamino ácidos, o no fueron suplementados de ninguna manera, y se incubaron para la cultivación concomitante durante 4 días en la oscuridad a aproximadamente 24ºC.

Después de la fase de cultivación concomitante, los trozos de callo se transfirieron a un medio 104 selectivo, suplementado con 50 mg/l de kanamicina y 500 mg/l de Claforan.

En diferentes intervalos de tiempo después de la cultivación concomitante, se recogieron muestras de callos embriogénicos y se sometieron a un ensayo con \beta-glucuronidasa, usando un substrato cromógeno como ha sido descrito por Jefferson y colaboradores (1987; Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405). Los resultados de estos ensayos se recopilan en la Tabla 1, y se expresan como el porcentaje de callos que expresan motas positivas para GUS.

Como un testigo, se incluyeron experimentos usando discos de hojas de tabaco concomitantemente cultivados con A3311, usando discos de hojas de tabaco inoculados de manera simulada (mock) o usando callos embriogénicos de algodón, inoculados de manera simulada.

Queda claro a partir de los resultados que se requiere la inclusión de acetosiringona durante la transformación, mediada por Agrobacterium, de un callo embriogénico, tanto para la expresión transitoria como después de una cultivación prolongada de los callos transformados.

3

4

Ejemplo 3

Transformación de algodón mediada por Agrobacterium usando un callo embriogénico

Un callo embriogénico (CE) de algodón se generó tal como se ha descrito en el Ejemplo 2. Trozos de callo embriogénico se recogieron y lavaron en un medio 104 líquido de pH 5,2.

Las cepas A3784, A3724 y A3727 de Agrobacterium se hicieron crecer durante 3 a 4 días en un medio AB de pH 7,0, se recogieron y se volvieron a suspender con una densidad de aproximadamente 1 a 5 x 10^{9} células/ml en un medio 104 líquido, de pH 5, 2, que contenía 100 \muM de acetosiringona.

Trozos de callo embriogénico se sumergieron en la suspensión de Agrobacterium durante como máximo aproximadamente 20 minutos y se transfirieron para cultivación concomitante durante 4 días en la oscuridad a 24ºC a un medio 104 sólido, de pH 5,2, suplementado con 100 \muM de acetosiringona.

Después de esta cultivación concomitante, los trozos de callo se transfirieron a un medio 104 selectivo, de pH 5,8, sin acetosiringona ni hormonas vegetales, suplementado con 500 mg/l de Claforan® (para inhibir el desarrollo de las células de Agrobacterium) y con 5 mg/l de fosfinotricina (PPT) (a fin de seleccionar específicamente el crecimiento de callos transgénicos).

Trozos que parecían sanos de callo embriogénico, que crecían activamente, se transfirieron cada 3 semanas a un medio 104 selectivo de nueva aportación.

Una parte del callo (aproximadamente 200 mg) se volvió a suspender en 20 ml de un medio líquido, suplementado con 5 mg/l de PPT, en un matraz con una capacidad de 100 ml sobre un sacudidor rotatorio (100-120 rpm).

Después de cultivar durante 2 semanas en el medio líquido, se retiraron los trozos grandes haciendo pasar la suspensión a través de un colador para té. La fracción de la suspensión embriogénica que había pasado a través del colador se dejó sedimentar durante aproximadamente 20 min, después de lo cual el medio agotado se retiró y se reemplazó por un medio 100 de nueva aportación. 2 ml de esta suspensión de pequeños embriones se sembraron en placas sobre un medio 104 sólido, suplementado con 5 mg/l de PPT y se incubaron a 28ºC.

Después de aproximadamente 2 semanas, embriones en desarrollo con un tamaño entre 4 y 10 mm se transfirieron a un medio 701 y se incubaron adicionalmente en la oscuridad a 28ºC. Los embriones de menor tamaño se transfirieron a un medio 104 cubierto superiormente con un papel de filtro estéril (con o sin 5 mg/l de PPT) con el fin de permitir un aumento en el tamaño, suficiente para la transferencia al medio 701.

Después de aproximadamente 2 semanas, los embriones se transfirieron al medio 702 (con o sin presión selectiva) para su germinación, y se incubaron a 28ºC con 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.

Las plantitas bien desarrolladas (que pueden requerir de 2 a 3 transferencias a un medio 702) se transfirieron a pequeños recipientes que contenían el M700. Cuando estas plantitas se hubieron desarrollado hasta el estadio de 2 a 3 hojas verdaderas, ellas se transfirieron a recipientes de mayor tamaño con un medio 700,

Cuando las plantas tenían una altura de aproximadamente 10 cm, se transfirieron a un suelo en condiciones de invernadero.

Los análisis moleculares (ensayo de acetilación de fosfinotricina, hibridación Southern, y ELISA para detectar la destrucción del gen cry, si fuese apropiado) se llevaron a cabo al nivel de los callos.

Los resultados de estos experimentos están recopilados en la Tabla 2.

Se realizaron como comparación similares experimentos de transformación de cotiledones de algodón, mediados por Agrobacterium, de acuerdo con los métodos conocidos en la especialidad.

5

Claims

1. Un método para producir una planta transgénica de algodón, comprendiendo dicho método:

a): cultivar concomitantemente un callo embriogénico de algodón cultivado en un medio sólido con células de Agrobacterium, comprendiendo dichas células de Agrobacterium un fragmento de ADN que interesa, engarzado operativamente con por lo menos un borde de ADN - T, en la presencia de un compuesto fenólico vegetal, capaz de inducir una expresión aumentada de un gen vir en dichas células de Agrobacterium, durante un período de tiempo que es suficiente para generar un callo embriogénico, que comprende una célula transformada de algodón; y

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto fenólico vegetal está presente en un intervalo de concentraciones de aproximadamente 50 \muM a aproximadamente 400 \muM.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células de Agrobacterium se cultivan concomitantemente en la presencia de dicho compuesto fenólico vegetal durante un período de tiempo de aproximadamente 3 a 4 días.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicho callo embriogénico se deriva de un hipocótilo de una plántula de algodón.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicho compuesto fenólico vegetal se selecciona entre el grupo que consiste en acetosiringona, \alpha-hidroxi-acetosiringona, ácido sinápico, ácido siríngico, ácido ferúlico, catecol, ácido p-hidroxibenzoico, ácido \beta-resorcílico, ácido protocatecuico, ácido pirogálico, ácido gálico y vainillina.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicho compuesto fenólico vegetal es acetosiringona.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dichas células de Agrobacterium son de Agrobacterium tumefaciens cepa C58C1 (pEHA101), que comprende además un fragmento de ADN que interesa.

8. El método de la reivindicación 1, que comprende además la operación de cruzar dicha planta transgénica de algodón con otra planta de algodón.