CN108486150A - 一种棉花遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种棉花遗传转化方法，包括如下步骤：制备转化受体、制备侵染液、侵染、共培养、筛选、胚性愈伤诱导培养、苗诱导，得到棉花的带有KANA抗性基因的棉花遗传转化植株。本方法过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的棉花转基因植株。

Description

一种棉花遗传转化方法
技术领域
本发明属于植物遗传转化技术领域，特别提供了一种棉花遗传转化方法。
背景技术
棉花是我国的非起源作物，因此我国的棉花种质资源较为匮乏，利用遗传转化技术将外源基因导入棉花基因组内，不仅可以有效打破物种间的界限，还能增加棉花的品种，提高棉花抗性。但是目前的棉花遗传转化方法均存在着遗传转化率低、转化时间长等问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种棉花遗传转化方法，通过调整过程中的培养基及培养参数，大大缩短了棉花遗传转化的时间，并且提高了遗传转化率。
本发明是这样实现的，提供一种棉花遗传转化方法，包括如下步骤：
1)制备转化受体
棉花种子的灭菌：选取脱绒后的棉花种子用70％的乙醇灭菌1min，之后用15％的过氧化氢灭菌4h，最后用无菌水清洗3-5次；
预培养：用灭菌滤纸吸干种子表面水分，放到GS1培养基上，28℃培养室中避光培养6天，至下胚轴的长度在9-11cm；
2)制备侵染液
取50mL Gs-inf，将农杆菌挑至Gs-inf中，制成侵染液；
3)侵染
切取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5cm小段，将步骤2)调好的侵染液加至放有下胚轴小段的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吸干菌液；
4)共培养
将步骤3)吹至表面无液体的下胚轴，以全部卧倒的方式接至放有灭菌滤纸的Gs-cocu培养基上培养两天，至下胚轴变为淡黄色；
5)筛选
第一次筛选：将淡黄色的下胚轴接入到筛选培养基Gs2-1中筛选40天；
第二次筛选：第一次筛选后，将下胚轴转入到筛选培养基Gs2-1中筛选30-40d，直到筛选到大块初级愈伤；
6)胚性愈伤诱导培养
将步骤5)获得的初级愈伤接入Gs3培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有胚长出；
7)苗诱导
将步骤6)得到的胚继代到Gs4培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有生根好的苗长出，至少长出3根根系，3片叶绿色叶子；
各步骤中用到的培养基具体配方见下表：
上述培养基配方表中各个代码含义为：
。
进一步地，所述步骤2)中制备的侵染液OD600＝1.0。
选用的农杆菌为LBA4404，携带的为KANA抗性基因。
进一步地，所述棉花的品种为R15或Xu142中的一种。
与现有技术相比，本发明的优点在于：过程简单、操作方便、参数及培养基优化，能够在较短时间内获得高遗传转化率的棉花转基因植株。
附图说明
图1为利用本发明的方法获得的共培养阶段的下胚轴；
图2为利用本发明的方法获得的第一次筛选阶段的愈伤组织；
图3为利用本发明的方法获得的第二次筛选阶段的愈伤组织；
图4为利用本发明的方法获得的胚性愈伤；
图5为利用本发明的方法获得的胚；
图6为利用本发明的方法获得的芽；
图7为利用本发明的方法获得的伸长的芽；
图8为利用本发明的方法获得的生根的苗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例、
1)制备转化受体
棉花种子的灭菌：取50粒棉花种子(R15或Xu142)，用50mL70％的乙醇灭菌1min，之后用50mL 15％的过氧化氢灭菌4h，最后用无菌水清洗3-5次；
预培养：用灭菌滤纸吸干种子表面水分，放到GS1培养基上，28℃培养室中避光培养6天，至下胚轴的长度在9-11cm；
2)制备侵染液
取50mL Gs-inf，将携带KANA抗性基因的LBA4404农杆菌挑至Gs-inf中，制成侵染液，OD600＝1.0；
3)侵染
切取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5cm小段，将步骤2)调好的侵染液加至放有下胚轴小段的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吸干菌液；
4)共培养
将步骤3)吹至表面无液体的下胚轴，以全部卧倒的方式接至放有灭菌滤纸的Gs-cocu培养基上，至下胚轴变为淡黄色，参考图1；
5)筛选
第一次筛选：将淡黄色的下胚轴接入到筛选培养基Gs2-1中筛选40天，参考图2；
第二次筛选：第一次筛选后，将下胚轴转入到筛选培养基Gs2-1中筛选30-40天，直到筛选到大块初级愈伤，参考图3；
6)胚性愈伤诱导培养
将步骤5)获得的初级愈伤接入Gs3培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有胚长出，参考图4和图5；
7)苗诱导
将步骤6)得到的胚继代到Gs4培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有生根好的苗长出，至少长出3根根系，3片叶绿色叶子，参考图6、图7和图8；
各步骤中用到的培养基具体配方见下表：
。

Claims (4)

1.一种棉花遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备转化受体
棉花种子的灭菌：选取脱绒后的棉花种子用70％的乙醇灭菌1min，之后用15％的过氧化氢灭菌4h，最后用无菌水清洗3-5次；
预培养：用灭菌滤纸吸干种子表面水分，放到GS1培养基上，28℃培养室中避光培养6天，至下胚轴的长度在9-11cm；
2)制备侵染液
取50mL Gs-inf，将农杆菌挑至Gs-inf中，制成侵染液；
3)侵染
切取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5cm小段，将步骤2)调好的侵染液加至放有下胚轴小段的瓶中，放置摇床100rpm侵染20min，之后取出置于无菌滤纸上吸干菌液；
4)共培养
将步骤3)吹至表面无液体的下胚轴，以全部卧倒的方式接至放有灭菌滤纸的Gs-cocu培养基上培养两天，至下胚轴变为淡黄色；
5)筛选
第一次筛选：将淡黄色的下胚轴接入到筛选培养基Gs2-1中筛选40天；
第二次筛选：第一次筛选后，将下胚轴转入到筛选培养基Gs2-1中筛选30-40d，直到筛选到大块初级愈伤；
6)胚性愈伤诱导培养
将步骤5)获得的初级愈伤接入Gs3培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有胚长出；
7)苗诱导
将步骤6)得到的胚继代到Gs4培养基中光培养，每30天循环继代一次，直到有生根好的苗长出，至少长出3根根系，3片叶绿色叶子；
各步骤中用到的培养基具体配方见下表：
上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：
。
2.如权利要求1所述的棉花遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2)中制备的侵染液OD600＝1.0。
3.如权利要求1所述的棉花遗传转化方法，其特征在于，选用的农杆菌为LBA4404，携带的为KANA抗性基因。
4.如权利要求1所述的棉花遗传转化方法，其特征在于，所述棉花的品种为R15或Xu142中的一种。
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