CN103966258B - 一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的甘监型油菜遗传转化方法，包括以下步骤：取甘蓝型油菜幼苗的下胚轴，以下胚轴的下端为外植体进行预培养，诱导产生愈伤组织；利用携带目的基因的农杆菌侵染愈伤化的外植体，然后进行共培养；共培养后的外植体在含选择剂的分化培养基上诱导生成抗性不定芽；进行生根培养，获得抗性苗。本发明因以甘蓝型油菜下胚轴的下端为外植体，且使用了最适于甘蓝型油菜遗传转化的生长条件，特别是共培养基中的pH值和两种高低浓度草甘膦分化筛选方式，成功获得了抗草甘膦的转基因植株，并与现有技术相比具有更高的抗性苗分化率，建立了一个高效的抗草甘膦的甘蓝型油菜再生体系，为研究甘蓝型油菜农杆菌介导的转基因技术奠定基础。

Description

一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法

技术领域

本发明涉及一种以油菜下胚轴为外植体的农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法，属于植物组织培养和转基因技术领域。

背景技术

油菜是一种重要的油料作物，广泛种植于中国、印度、加拿大和欧洲等地，且在全球油料作物产量中排名第三。1974年Kartha等人首次从油菜的茎切段诱导培养出小植株。此后，人们依据细胞全能性原理，利用油菜的不同外植体类型诱导出愈伤组织，并获得再生植株，如油菜的茎、子叶、叶片、小孢子、茎尖、下胚轴、根和原生质体等。油菜再生体系的建立是其遗传转化的基础，油菜外植体的再生频率降低，将造成其遗传转化效率的降低，因此建立一个高效的油菜再生体系是保证转基因油菜遗传转化成功的关键。

有研究表明，油菜植株的高效再生与外植体的类型有着密切关系，不同油菜外植体的再生频率及转化效率不相同。其中利用无菌苗下胚轴作为起始外植体建立的再生体系，与其他外植体类型相比，具有再生周期短、再生能力强、转化效率高，分化芽质量好、易被农杆菌感染和转化等特点，因此下胚轴成为油菜再生和转化体系的首选外植体类型。

近年来研究发现，油菜下胚轴的分化存在极性，再生频率、转化效率与下胚轴的部位有关。在目前已公开的油菜转基因技术中，大部分研究只考虑使用下胚轴作为外植体，很少研究下胚轴的分化极性对其再生频率和转化效率的影响。此外，农杆菌介导的油菜遗传转化受诸多因素的影响，在共培养阶段农杆菌Vir区控制着带有目的基因T-DNA的转移，除了酚类化合物能够活化Vir区基因，pH值对Vir区基因也有明显的诱导作用。合适的共培养基pH值有利于提高抗性芽苗分化率，促进农杆菌的转化。

目前的甘蓝型油菜遗传转化技术普遍存在抗性苗分化率低，目的基因转化效率差的现状，如何能够建立高效地转化体系，提高抗性苗的分化率，是油菜转基因技术的一个重要研究方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法，建立完整的农杆菌介导的抗草甘膦甘蓝型油菜遗传转化体系，提高再生体系的分化效率。

一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)取甘蓝型油菜幼苗的下胚轴，以下胚轴的下端为外植体进行预培养，诱导产生愈伤组织；

所述下胚轴的下端为下胚轴靠近胚根的长0.5～1cm的部分；所述预培养的培养基为：MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH为5.8；

(2)利用携带抗草甘膦基因的农杆菌侵染愈伤化的外植体，然后进行共培养；

所述共培养的培养基为：MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH在5.0～5.4之间；

(3)将共培养后的外植体，在含低浓度草甘膦的分化培养基I上筛选培养10天，再接种到含高浓度草甘膦的分化培养基II上，诱导生成抗性不定芽；

所述分化培养基I为：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgNO₃+250mg/LTim+4.5mg/L草甘膦，pH为5.8；

所述分化培养基II为：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgNO₃+250mg/LTim+9.0mg/L草甘膦，pH为5.8；

(4)进行生根培养，获得抗性苗。

所述甘蓝型油菜幼苗的培养方法包括：将油菜种子消毒后平铺在固体培养基上进行培养直至获得幼苗，所述同体培养基为：1/2MS+18.0g/L蔗糖+9.0g/L琼脂，pH为5.8。

所述农杆菌侵染愈伤化的外植体包括：制备侵染液，将愈伤化的外植体浸入侵染液中，取出后吹干。

所述愈伤化的外植体浸入侵染液的时间为3～10分钟。

所述侵染液制备方法包括：

(1)农杆菌的活化；

(2)将活化后的农杆菌接入液体培养基，当培养液OD₆₀₀值达到0.8～1时，分离获得农杆菌；

(3)将分离得到的农杆菌混入1/5MS+15g/L蔗糖的培养液中，悬浮制得侵染液。

所述液体培养基为：YEB+12mg/L四环素+50mg/L卡那霉素。

所述生根培养包括：当抗性不定芽长至3～5cm时，从基部切去愈伤组织，将抗性不定芽转移到生根培养基中。

所述生根培养基为：MS+0.2mg/LNAA+4.5mg/L草甘膦，pH为5.8。

当抗性苗形成完整根系后，开瓶炼苗天，取出抗性苗移入1/5MS培养液中，水培1周后，移栽到有机质培养土中。

所述抗草甘膦基因GI号为：8469109。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明因以甘蓝型油菜下胚轴的下端为外植体，且在组织培养和遗传转化过程中使用了最适于甘蓝型油菜遗传转化的生长条件，特别是共培养基中的pH值和两种高低浓度草甘膦的分化筛选方式，成功的获得了抗草甘膦的转基因植株，并与现有技术相比具有更高的抗性苗分化率，能够建立一个高效的抗草甘膦的甘蓝型油菜再生体系，为研究甘蓝型油菜农杆菌介导的转基因技术奠定基础，促进了油菜基因工程技术的发展。

附图说明

图1为以甘蓝型油菜下胚轴上端为外植体获得的抗性芽苗生长情况。

图2为以甘蓝型油菜下胚轴下端为外植体获得的抗性芽苗生长情况。

图3为在共培养基的不同pH值条件下获得的抗性芽苗的生长情况；

A：pH5.0；B：pH5.2；C：pH5.4；D：pH5.8。

图4为共培养的暗培养阶段。

图5为抗性植株DNA的PCR扩增产物的检测；

M：DNAMarker；1：阳性对照；2～9：抗性植株DNA的PCR扩增产物。

具体实施方式

实施例1

(1)挑选适量籽粒饱满的“浙大619”甘蓝型油菜种子，在75％的酒精中清洗30s，倾倒出酒精后，加入25mL左右的5％次氯酸钠溶液消毒15min，同时震荡，使消毒液和油菜种子充分接触，倒出次氯酸钠溶液后，无菌水冲洗4～5遍，然后将消毒好的种子均匀地平铺在含有同体培养基的瓶子中。

(2)固体培养基为1/2MS+18.0g/L蔗糖+9.0g/L琼脂，pH为5.8。每瓶同体培养基大约播种24粒种子，在25～27℃、光照16h、黑暗8h和光照强度为70μmolm^-2s^-1的条件下进行培养。

(3)无菌苗培养8d时，在超净工作台上分别切取油菜幼苗下胚轴上端和下端作为外植体，接种到预培养的培养皿上，预培养培养基为MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH为5.8，在26±1℃、光照16h、黑暗8h和适宜的光照强度条件下，预培养3d，诱导产生愈伤组织。

(4)将预培养后的下胚轴上端和下端分别接种到不含选择剂的分化培养基上，分化培养基为MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgNO₃.pH5.8，且每10d继代培养次。

(5)取浙江大学农业与生物技术学院基因工程改良实验室提供的带有抗草甘膦基因G10(GI：8469109)的农杆菌LBA4404置于-80℃条件下保存。利用接种针沾取少量农杆菌菌液，解冻后划平板于YEB+12mg/L四环素(Tet)+50mg/L卡那霉素(Kan)+4.8g/L进口琼脂的同体培养基上，27℃，200rpm的恒温摇床中暗培养2d后，挑取农杆菌单菌落接种于20mL的YEB+12mg/LTet+50mg/LKan(不含琼脂)的液体培养基中，27℃，200rpm恒温摇床中暗培养过夜。

(6)用分光光度计测定农杆菌菌液浓度，当OD₆₀₀值达到0.8～1左右时，将20mL的农杆菌菌液移入20mL已灭菌的离心管中，5000rpm离心5min，然后用已灭菌的1/5MS+15g/L蔗糖溶液悬浮农杆菌，制备侵染液。

(7)获取步骤(3)中预培养3d的愈伤化的下胚轴下端，将其接种到步骤(6)的制备好的农杆菌侵染液中，侵染5min中后(侵染过程中可以轻微震荡)倒出菌液，将侵染后的下胚轴下端在超净工作台上吹成半干状态。

(8)将上述侵染后的愈伤化下胚轴下端接种到铺有一层无菌滤纸的共培养基上，27℃暗培养2d，共培养培养基的成分为MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，以通常使用的pH值为5.8的共培养基为对照，增加pH值为5.0、5.2和5.4的三种处理，其余实验步骤不变。

(9)愈伤化的下胚轴下端共培养后，用无菌水洗涤2～3次进行脱菌，然后在含低浓度草甘膦的分化培养基I上筛选培养10天，再接种到含高浓度草甘膦的分化培养基II上，诱导生成抗性不定芽；分化培养基I为：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgNO₃+250mg/LTim+4.5mg/L草甘膦，pH为5.8；分化培养基II为：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgNO₃+250mg/LTim+9.0mg/L草甘膦，pH为5.8；且每10d继代培养一次。

(10)当下胚轴下端再生的抗性不定芽在含有草甘膦选择剂的分化培养基上长到3～5cm时，从基部切去愈伤组织后，将再生的抗性不定芽转移到瓶子中的生根培养基上，生根培养基为MS+0.2mg/LNAA+4.5mg/L草甘膦，pH为5.8。

(11)抗性苗形成完整根系后，开瓶炼苗一天，取出抗性幼苗移入含有1/5MS溶液的玻璃瓶中，在光照培养箱中光照16h，温度26±1℃，黑暗8h，20℃水培1周后，移栽到有机质培养土中，继续在光照培养箱中培养至获得抗性植株。

(12)根据已知的抗草甘膦目的基因序列，设计目的基因部分序列的引物，引物序列如下：

引物F：5′-AGCACAGCCATCCAAGAACTA-′3(No.303Tm：57.5℃)

引物R：5′-AGAGGACCGAGGAACATAAGG-′3(No.782Tm：57.6℃)

(13)从抗性植株中提取DNA，并以引物序列为模板，建立PCR反应体系：

PCR反应条件为：

1)预变性：94℃3min；

2)变性：94℃1min；退火：62℃45s；延伸：72℃1min；共进行35次循环；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存。

(14)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并染色，在凝胶成像系统中观察电泳条带，判断抗草甘膦目的基因是否成功整合到抗性植株DNA中。

根据上述步骤(1)-(4)，可获得下述结果：

表1甘蓝型油菜下胚轴上端下端的抗性芽苗再生能力

由图1、2可知，下胚轴下端的出愈率和分化率高于上端，且从表1可知，下胚轴下端的出愈率和分化率比上端分别高出19.33％和34.49％，且下胚轴的下端出愈率高达78.33％，分化率高达67.27％。结果表明，甘蓝型油菜下胚轴的分化存在极性差异，不同部位的下胚轴具有不同的再生能力，下胚轴的下端作为外植体与上端相比更佳，且出愈率和抗性芽苗分化率显著提高。

根据上述步骤(1)-(3)和(5)-(11)，可获得下述结果：

表2共培养培养基不同pH值对抗性芽苗再生能力的影响

山图3和表2可知，共培养培养基pH值为5.4时，抗性芽苗分化率最高，且pH值为5.0、5.2、5.4时下胚轴下端的抗性芽苗分化率均高于目前普遍使用的pH值为5.8的共培养培养基。结果表明，适当降低现有技术中共培养培养基的pH值可提高抗性芽苗的分化率，提高抗性苗的再生能力。

由图5可知，以抗草甘膦目的基因部分序列设计的引物序列为模板，进行抗性植株DNA的PCR扩增，所得产物经琼脂糖凝胶电泳检测存在480bp大小的条带，说明抗性植株中含有抗草甘膦的目的基因，目的基因成功整合到抗性植株DNA中。经统计通过农杆菌介导的甘蓝型油菜转化的转化效率为4％。

Claims (1)

1.一种农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取甘蓝型油菜幼苗的下胚轴，以下胚轴的下端为外植体进行预培养，诱导产生愈伤组织；

所述甘蓝型油菜的品种为浙大619；

所述甘蓝型油菜幼苗的培养方法包括：将油菜种子消毒后平铺在固体培养基上进行培养直至获得幼苗，所述固体培养基为：1/2MS+18.0g/L蔗糖+9.0g/L琼脂，pH为5.8；

所述下胚轴的下端为下胚轴靠近胚根的长0.5～1cm的部分；所述预培养的培养基为：MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH为5.8；

(2)利用携带抗草甘膦基因的农杆菌侵染愈伤化的外植体，然后进行共培养；

所述农杆菌侵染愈伤化的外植体包括：制备侵染液，将愈伤化的外植体浸入侵染液中3～10分钟，取出后吹干；

所述侵染液制备方法包括：

(A)农杆菌的活化；

(B)将活化后的农杆菌接入液体培养基，当培养液OD₆₀₀值达到0.8～1时，分离获得农杆菌；所述液体培养基为：YEB+12mg/L四环素+50mg/L卡那霉素；

(C)将分离得到的农杆菌混入1/5MS+15g/L蔗糖的培养液中，悬浮制得侵染液；

所述共培养的培养基为：MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH在5.0～5.4之间；

(3)将共培养后的外植体，在含低浓度草甘膦的分化培养基Ⅰ上筛选培养10天，再接种到含高浓度草甘膦的分化培养基Ⅱ上，诱导生成抗性不定芽；

所述分化培养基Ⅰ为：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgNO₃+250mg/LTim+4.5mg/L草甘膦，pH为5.8；

所述分化培养基Ⅱ为：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgNO₃+250mg/LTim+9.0mg/L草甘膦，pH为5.8；

(4)进行生根培养，获得抗性苗；

所述生根培养包括：当抗性不定芽长至3～5cm时，从基部切去愈伤组织，将抗性不定芽转移到生根培养基中；所述生根培养基为：MS+0.2mg/LNAA+4.5mg/L草甘膦，pH为5.8；

当抗性苗形成完整根系后，开瓶炼苗一天，取出抗性苗移入1/5MS培养液中，水培1周后，移栽到有机质培养土中。