CN102586317B - 一种农杆菌介导的叶片转化培育柑橘转基因植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物转基因技术领域，具体地，本发明涉及柑橘转基因植株的培育方法。公开了一种利用农杆菌介导，以柑橘试管苗叶片为外植体培育转基因柑橘植株的方法，其步骤包括遗传转化、筛选再生、PCR检测和GFP荧光观察。其特征在于，通过农杆菌介导将GFP报告基因导入受体柑橘叶片，对影响叶片转化的不同因素进行筛选，利用卡那霉素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，通过PCR检测，GFP荧光检测等辅助方法筛选得到转基因柑橘植株。本发明为柑橘遗传转化创新种质资源提供了新的技术平台。

Description

一种农杆菌介导的叶片转化培育柑橘转基因植株的方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域。具体涉及一种农杆菌介导的叶片遗传转化培育柑橘转基因植株的方法。

背景技术

柑橘是我国的一种重要果树，在农业结构调整、农民脱贫致富和出口创汇中具有重要的作用。近年来，我国柑橘产量和面积持续增长，居世界前列。但柑橘在发展过程中，也受到很多生物和非生物逆境胁迫，因此培育抗逆品种对于柑橘产业持续稳定发展至关重要。但作为多年生木本植物，柑橘生命周期长，树体高大，遗传背景复杂(基因高度杂合)、童期长，最为关键的是大多数柑橘品种具有多胚特性，通过有性杂交很难获得杂种。现在的芽变选种也存在资源范围狭窄及选种周期长、变异不确定性等问题。总之，采用常规的育种方法对柑橘进行改良很难在短期内达到预期目的，致使其遗传育种进展缓慢。近些年来，植物基因工程的开展及其在木本植物中的应用为木本植物的遗传改良带来了无限生机。

目前，柑橘遗传转化主要采用农杆菌介导法和DNA直接导入法。农杆菌介导法具有费用低廉、操作简便、重复性好以及转化率相对较高等优点，广泛用于柑橘遗传转化。柑橘遗传转化第一例成功的报道是Hidaka等(Hidaka T，Omura M，Ugaki M.Agrobacterium-mediated transformat ion and regenerat ion of Citrusspp.from suspension cells.Japan Journal of Breeding，1990，40：199-207)的工作，他们首次用农杆菌介导转化法获得华盛顿脐橙转基因植株。自此以后，柑橘遗传转化取得了长足的进展。很多实验室均将农杆菌介导的遗传转化方法用于柑橘遗传改良，证实了遗传转化技术在柑橘品种改良中应用的可行性，从而加快了柑橘遗传转化研究的前进步伐。

迄今为止，已成功实现遗传转化的柑橘种类较多，包括柚类、甜橙、酸橙、柠檬和来檬类等，其中转化最多的是甜橙，但宽皮柑橘类相对较少(如温州蜜柑、红橘、焦柑或椪柑等)。此外，柑橘近缘植物(如枳及其杂种)也已经转化成功。当前柑橘遗传转化的目的主要有：第一，提高抗性，包括抗病(溃疡病、黄龙病)和非生物逆境(干旱、高盐、低温、氧化胁迫等)；第二，缩短童期，利用开花相关的基因转化多年生柑橘成功地得到在一年左右就能开花的转基因植株；第三，提升品质，主要有无核、着色及熟期等(李健，杨昌鹏。柑橘遗传转化育种研究进展，安徽农业科学，2010，38(3)：1209-1211)。

利用于农杆菌介导的柑橘遗传转化受体组织有(外植体)有愈伤组织、上胚轴、下胚轴、子叶，用于DNA直接导入的受体主要是原生质体，通过这些受体转化均已得到转基因植株。

植物的离体叶片取材简单，并且可以提供大量的转化材料，是一种理想的转化受体。但是，迄今为止，国内外均未见到利用叶片作为外植体开展柑橘遗传转化获得转基因植株的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，利用离体培养的柑橘无菌苗叶片为转化受体，通过农杆菌介导获得转基因柑橘植株，为柑橘种质创新和品种分子设计育种提供技术平台。

本发明是这样实现的：

一种利用农杆菌介导的叶片转化培育转基因柑橘植株的方法，其步骤包括遗传转化，用离体无菌苗叶片作为遗传转化的受体材料，通过农杆菌介导将GFP报告基因导入受体，利用卡那霉素作为选择剂对转化后的受体材料进行筛选，通过载体上的基因设计特异引物进行PCR和GFP荧光观察检测筛选得到转基因柑橘植株。

具体地，本发明的方法如下：

1)在离体条件下播种柑橘种子于MS培养基上(附加8g/L的琼脂)获得无菌苗(详见实施例1)。

2)将步骤1)的柑橘无菌苗叶片切成1cm²的方块，每个小方块用刀刻伤造成伤口，置于OD₆₀₀为0.2-1农杆菌菌液中浸泡10分钟(每2-3分钟摇动一次)；将侵染后的叶片依次转移至共培养培养基、选择培养基、生芽培养基和生根培养基上培养，筛选获得侯选转基因植株；

其中：所述共培养的步骤包括，取出农杆菌侵染过的叶片，用无菌滤纸上吸干，接入共培养培养基(MT培养基+0.1mg/L NAA+0.5mg/L BA+0.5mg/L KT+25mg/L乙酰丁香酮，附加蔗糖30g/L，琼脂8g/L，pH5.8)中；在26±1℃黑暗条件下培养3d；

其中：所述的选择培养步骤包括，将共培养后的叶片在添加有200mg/L头孢霉素(Cefotaxime)的无菌水中洗3-4次，用无菌滤纸上吸干后接入选择培养基(MT培养基+0.1mg/LNAA+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+0.5mg/L细胞激动素(KT)+50mg/L卡那霉素+250mg/L Cefotaxime，附加蔗糖30g/L，琼脂8g/L，pH 5.8)上，在黑暗条件下培养4周，然后转入光照条件(45μmol m^-2s^-1)下培养诱导不定芽，每隔3-4周更换一次新鲜的选择培养基直至不定芽的分化。

其中：所述芽伸长培养步骤包括，将分化培养叶片上的芽长到1-1.5cm时，切下转入芽伸长培养基(MT培养基+0.2mg/L6-BA+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+0.2mg/L赤霉素(GA)+50mg/L卡那霉素+250mg/LCefotaxime，附加蔗糖30g/L，琼脂8g/L)上；pH 5.8，以促进芽进一步的伸长。

其中：所述生根培养步骤包括，将发育良好的芽切下，接入生根培养基(1/2MT培养基+0.5mg/L NAA+0.1mg/L吲哚丁酸(IBA)，附加蔗糖25g/L，0.5g/L活性碳，琼脂8g/L，pH 5.8)。，对抗性植株进行筛选，从而获得候选转基因抗性植株，

3)PCR检测候选转基因植株，具体方法如下：

根据nptII选择标记基因和GFP报告基因的序列设计特异引物，

扩增nptII基因的引物序列如下：

正向引物，5’-TGCGCTGCGAATCGGGAGCG-3，

反向引物，5’-GAGGCTATTCGGCT-ATGACT-3’；

PCR扩增得到nptII基因特异DNA片段，其片段长度为740bp(见序列表SEQ ID NO：1)；

扩增nGFP基因的引物序列如下：

正向引物，TGGCCAACACTTGTCA-CTAC-3’，

反向引物，5’-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3’；

PCR扩增nptII基因特异DNA片段，片段长度为491bp(见序列表SEQ ID NO：2)。

4)GFP瞬时表达观察和PCR阳性植株GFP荧光观察：取部分转化的外植体，在Leica荧光显微镜(MZFLIII)下观察；PCR检测呈阳性的植株，也在同一种显微镜上观察。

本发明的积极效果是：

本发明是在国内外首次利用叶片转化获得柑橘转基因植株，为今后柑橘的遗传改良如利用转基因技术培育抗逆(生物和非生物逆境)种质资源提供了新的技术平台。

附图说明

图1.本发明技术路线图。

图2.是本发明应用的一个报道的质粒pPI121的物理图谱。

图3.是本发明的实施例中叶片GFP瞬间表达检测。

图4.是柑橘叶片外植体在不同培养基上的状况。其中图4A：柑橘叶片外植体在共培养基上生长情况；

图4B：柑橘叶片外植体在选择培养基上由切口处长芽；图4C：抗性芽在芽伸长培养基上；图4D：在伸长培养基上增殖芽。

图5.抗性芽在生根培养基上生根情况。

图6.是叶片转化再生的转基因植株群体和盆栽植株；其中图6A：获得的转基因植株群体，图6B：盆栽转基因植株。

图7.是本发明的实施例中PCR阳性株系的GFP荧光观察及明场下观察结果，其中图7A：GFP荧光观察结果，图7B：明场下的观察结果。

图8.是抗性植株在NPTII基因和GFP基因的PCR检测结果。其中图8A：是转NPTII基因PCR检测结果；

图8B：转GFP基因PCR检测结果。

图9.卡那霉素对柑橘叶片成活率的影响。

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1

1)外植体的准备

将柑橘品种伏令夏橙(一个夏季成熟的常用栽培甜橙品种，来自华中农业大学柑橘研究所果园)种子从果实中取出后，先用1M的氢氧化钠溶液处理20分钟，无菌水洗3次，再用有效氯为2.5％的次氯酸钠溶液消毒5-20分钟，将消毒后的柑橘种子播种在附加有30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MT(Murashige T and Tucker DPH.Growth factor requirements of Citrus tissue culture.Proc.First Intl.Citrus Symp，1969，3：1155-1161)培养基上(pH5.8)，光下(45μmol m^-2s^-1光照强度，每天光照时间16h)培养4-12周获得无菌苗。

2)农杆菌菌液的制备

转化前取一小管农杆菌菌液用灭菌的接种针刮拭培养皿，划线于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基(培养基成分及配比：5g/L Tryptone+10g/LNaCl+5g/L麦芽提取物+50mg/L卡那霉素)上，28℃培养2天，使菌种复苏并形成单菌落，此盘作为菌种盘。从菌种盘中挑取单菌落划线涂满新的LB固体培养基，28℃下培养2天，使农杆菌增殖，然后用灭菌小刀将菌体收集到含25mg/L乙酰丁香酮的液体MT液体培养基(王关林等，植物基因工程第三版，2002版，科学出版社，北京)中，180-200r/min悬浮菌体，待菌液OD600值达0.2-1后进行侵染。

3)侵染：将步骤1)中的柑橘无菌苗叶片切成1cm²的方块，每个小方块用手术刀片在叶背垂直主脉方向划伤3-4刀后，置于步骤2)中的农杆菌菌液中浸泡10分钟，期间每2-3分钟摇动一次。

4)共培养：将步骤3)中叶片从农杆菌液中取出，用无菌滤纸吸干，接入共培养培养基(成分及配比见表1)中；在26±1℃黑暗条件下培养3d。

5)选择培养：将步骤4)中叶片转入选择培养基(成分见表1)上，先暗培养4周，然后转入光照条件(45μmol m^-2s^-1)进行不定芽的诱导，此后，每隔3-4周换一次新鲜的选择培养基直至不定芽分化。

6)抗性芽进一步筛选及芽伸长培养：将步骤5)中再生出小芽的叶片从培养基中取出，转移至芽伸长培养基(见表1)中进行抗性芽进一步筛选和促进芽伸长。

7)抗性苗的生根：将步骤6)中经过筛选后、苗高1-3厘米的抗性苗切下转入生根培养基(见表1)中进行生根培养，从而获得候选转基因抗性植株。

上述培养基按照报道的方法灭菌，即在高压蒸汽121℃下灭菌20min，备用。

8)抗性植株的PCR检测：将步骤7)中抗性植株进行PCR检测，利用报道的PCR分子鉴定技术(具体程序参见：梁国栋主编，最新分子生物学实验技术，科学出版社，2001)，同时参照Liu等(Liu JH，Pang XM，Cheng YJ，Meng HJ，and Deng X X.Molecular characterization of the nuclear and cytoplasmic genomes ofintergeneric diploid plants from cell fusion between Microcitrus papuana and rough lemon.Plant Cell Rep，2002，21：327-332.)报道的提取总DNA的方法，根据选择标记基因(基因nptII，登录号：gi|1842446)和报告基因(GFP，登录号：AF485783.1)的序列资料设计特异引物：其中克隆nptII基因的引物序列为：

正向引物，5’-TGCGCTGCGAATCGGGAGCG-3，

反向引物，5’-GAGGCTATTCGGCT-ATGACT-3’；

PCR扩增nptII基因的特异DNA片段，其片段长度为740bp(见SEQ ID NO：1所示)。

扩增GFP基因的引物序列为：正向引物，TGGCCAACACTTGTCA-CTAC-3’，

反向引物，5’-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3’；

PCR扩增GFP基因得到特异DNA片段，其片段长度为491bp(见SEQ ID NO：2所示)。

PCR循环反应参数：94℃变性4分钟，然后依次在94℃变性40秒，55℃复性40秒，72℃延伸40秒，循环30次后在72℃保温5分钟。

PCR扩增产物在含溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。

9)GFP荧光观察：对在农杆菌侵染后的叶片及PCR检测呈阳性的株系进行GFP荧光观察。荧光观察在Leica荧光显微镜(MZFLIII)下完成，具有480/40nm激发光滤片、505nm LP双色束分离器和510nm LP阻断滤片。

表1本发明用于柑橘叶片转基因植株培育的各类培养基配方：

实施例2：柑橘叶片转化获得转基因植株

1、转化受体材料及培养方法

在中国湖北省武汉市华中农业大学国家柑橘育种中心采集伏令夏甜橙果实，种子从果实中取出后，用1M氢氧化钠处理20分钟，无菌水洗3次，再用有效氯为2.5％的次氯酸钠溶液消毒5-20分钟，无菌水洗2-3次，播种在附加有30g/L蔗糖和8g/L琼脂的MT(Murashige T，Tucker D P H.Growth factor requirements ofCitrus tissue culture.Proc.First Intl.Citrus Symp，1969，3：1155-1161)培养基(pH5.8)上，在光下培养4-12周获得无菌苗。

除特别说明外，本发明的培养基成分如表1所示。

培养基按常规方法灭菌。

2、转化载体材料及培养方法

包含报道质粒pBI121(见Genbank，基因登录号：AF485783.1，该质粒的物理图谱参见附图2)的根癌农杆菌菌株为EHA105由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室郭文武教授惠赠，该质粒携带GFP报告基因和NPTII选择基因。

(1)菌株的活化

从-70℃冰箱取出所保存的菌种，用接种环划取后直接划平板，平板为LB培养基(成分：蛋白胨10g/L；酵母浸膏5g/L；氯化钠10g/L；琼脂粉13g/L；补足蒸馏水至1L；调pH至7.0-7.2(王关林和方宏筠，1998)，培养农杆菌时附加卡那霉素(Kan)50mg/L。将平板放入28℃温箱每，培养至单菌落产生。

(2)菌株的保存

将平板放入4℃冰箱保存，每半个月活化一次。若要在-70℃下保存，则从平板上挑单菌落于附加相应100mg/L Kan的液体LB培养基中，放入恒温摇床上28℃150rpm/min摇菌至OD₆₀₀＝1.0，在己灭菌的1.5mLEppendorf管中加入0.85mL农杆菌菌液和0.15mL甘油，放入冰箱长期保存。

3、农杆菌介导的遗传转化方法

1)转化受体准备：取上述培养的柑橘无菌苗叶片切成1cm²的方块，每个小方块用手术刀片在叶背垂直主脉方向划伤3-4刀后，作为转化受体用于侵染。

2)菌液的制备：从菌种盘中挑取单菌落划线涂满新的LB固体培养基，28℃下培养2天，使农杆菌增殖，然后用灭菌小刀将菌体收集到含25mg/L乙酰丁香酮的液体MT液体培养基中，180-200r/min悬浮菌体，待菌液OD600值达0.2-1后进行侵染。

3)侵染：将步骤1)中叶片置于2)中的农杆菌菌液中浸泡10min。

4)共培养：将步骤3)中叶片取出并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液，叶背面向下接入共培养培养基(成分见表1)中，26±1℃条件下黑暗培养3天。

5)选择培养：将步骤4)的叶片转入选择培养基(成分见表1)上，先暗培养4周，然后转至光照条件下(45μmol m^-2s^-1)进行不定芽的诱导。此后，每隔3-4周更换一次新鲜选择培养基直至不定芽分化

6)抗性芽进一步筛选及芽伸长培养：将步骤5)中再生出小芽的叶片从培养基中取出，转移至芽伸长培养基(成分见表1)中进行抗性芽进一步筛选和促进芽伸长。

7)抗性苗的生根：将步骤6)中经过筛选后、苗高1-3厘米抗性苗切下转入生根培养基(成分见表1)中进行生根培养，获得候选转基因抗性植株。

转化中设接种未经农杆菌侵染的叶片和经农杆菌侵染但不加选择两种处理作对照。

3、GFP基因瞬间表达观察

取共培养过的叶片，用无菌滤纸吸干表面液体后，然后置于一干净的载玻片上，在Leica荧光显微镜(MZFLIII)下观察荧光，该显微镜具有480/40nm激发光滤片、505nm LP双色束分离器和510nm LP阻断滤片。GFP瞬间表达情况见图3。图3表明，在叶片上能看到GFP荧光，因此，从瞬间表达的结果看来，叶片转化能有瞬间表达。

4、植株再生

放置于选择培养基上的叶片(图4A)在培养一段时间后，在切口片先出现凸起，随着时间的延长，凸起继续长大直至成芽(图4B)，部分芽在选择培养基上生长一段时间后会慢慢死去，而具有抗性的芽则存活下来并不断长大(图4B)，在选择培养基上生长(多长时间？)后转入伸长培养基(多长时间？)后，芽就会逐渐生长正常(图4C)，将一部分芽切下后再转入新鲜芽伸长培养基会有大量的芽增殖(图4D)。将3厘米左右的芽切下，转入生根培养基(成分见表1)，1个月左右就能形成完整的根(图5)。等植株有2-3条根时，揭开试管盖进行驯化，然后移入小塑料杯中，置于温室中培养(图6A)，等生长正常后，移入更大体积的容器中生长(图6B)。

5、对在选择培养基上再生抗性植株的GFP观察

随机选取部分在选择培养基上继代多次的抗性植株，观察GFP荧光，所用方法同GFP瞬间表达。其中一个植株的荧光观察如图7所示，从图7可以看出，在明场视野中的植株(图7A)在UV激发下可以清楚地看到植株中有绿色荧光，但荧光分布并不是在整个植株是均匀的(图7B)。

6、转基因植株的PCR检测

参照Liu等(Liu J H，Pang X M，Cheng Y J，Meng H J，and Deng X X.Molecular characterization of thenuclear and cytoplasmic genomes of intergeneric diploid plants from cell fusion between Microcitrus papuana andrough lemon.Plant Cell Rep，2002，21：327-332.)报道提取叶片总DNA的方法，提取转化后再生植株和未转化植株的叶片总DNA。根据选择标记基因(nptII)和报告基因GFP的序列设计引物如下的引物序列。

扩增nptII基因的引物序列为：

正向引物，5’-TGCGCTGCGAATCGGGAGCG-3，

反向引物，5’-GAGGCTATTCGGCT-ATGACT-3’。

扩增GFP基因引物的序列如下为：

正向引物，TGGCCAACACTTGTCA-CTAC-3’，

反向引物，5’-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3’；

反应体系为：

去离子水                 19μl；

dNTP(2mM)                0.5μl；

Primerl(10mM)            0.5ul；

Primer2(10mM)            0.5μl；

10XBuffer                2.5μl；

Taq酶(5U/L)              1μl；

模板DNA(20ng/μl)        1μl；

总体积                   25μl；

PCR循环反应参数：94℃变性4分钟，然后依次在94℃变性40秒，55℃复性40秒，72℃延伸40秒，循环30次后在72℃保温5分钟。PCR扩增产物在含溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，紫外荧光下观察结果并照相。

将转化叶片再生植株和未转化植株中提取植物基因组DNA作为模板，以农杆菌质粒DNA作为阳性对照，以未转化的无菌苗DNA作为阴性对照，进行PCR扩增，结果如图8所示，质粒DNA扩增出现预期大小的片段，未转化的植株基因组未出现PCR特异扩增片段，转基因植株经PCR扩增，均得到与质粒DNA扩增产物大小一样的片段，其中NPTII基因片段大小为740bp(见序列表SEQ ID NO：1，图8A)，GFP基因片段大小为491bp(见序列表SEQ ID NO：2，图8B)。

实施例2：对比试验的实施例

1、伏令夏橙叶片对卡那霉素的敏感性比较

本实施例所用质粒为pBI121(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室郭文武惠赠)，该质粒携带有选择标记基因为nptII，对卡那霉素具有抗性。由于伏令夏橙叶片用于转化以前未见报道，对较适合的用于转化选择压力的卡那霉素浓度并没有报道，因此，本发明将未转化的无菌苗叶片、试管苗分别接入含不同浓度的卡那霉素的培养基中，观察并统计不同浓度的选择剂对不同外植体生长的影响，以确定不同外植体在不同选择剂中相应的选择浓度。

以伏令夏橙无菌苗叶片为外植体，确定卡那霉素对其再生的影响，以选择相应的卡那霉素选择压力用于转化。将1cm²大小的小叶片接种于附加不同浓度卡那霉素的叶片再生培养基(MT培养基+0.1mg/LNAA+0.5mg/L BAP+0.5mg/L KT+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8)上，设0、50、100、200和250mg/L五种卡那霉素浓度梯度(卡那霉素过滤灭菌后加入培养基至相应浓度)。每15天更换一次新鲜培养基，60天后统计外植体的褐化率，计算成活率。

本发明中发现，伏令夏橙叶片接种在含有卡那霉素的培养基上，生长会受到抑制。成活率随卡那霉素浓度增大而逐渐降低，当有50mg/L卡那霉素存在时，成活率就由对照的100％降低到60％左右，100mg/L和200mg/L卡那霉素存在时的成活率分别为40％和30％左右(图9)。为了保证有较大数量的阳性转化子，因此本发明的选择培养基中卡那霉素的最适浓度为50mg/L。

2、叶龄对农杆菌侵染后GFP瞬间表达、再生率和转化效率的影响

取生长不同时间(1、2、3、4个月)的叶片作为外植体，在相同转化条件下进行农杆菌侵染试验，经共培养、脱菌培养，每15天换一次脱菌培养基，观察叶龄对农杆菌侵染后GFP瞬间表达的影响；2个月后统计抗性芽再生比例，计算转化效率(GFP观察有荧光的外植体数量＊100/总的转化外植体数)。

本实施例中将叶片用OD值为0.6的根癌农杆菌菌液进行侵染试验，共培养3天后，用无菌蒸馏水洗净表面菌体，用无菌滤纸吸干，接入脱菌培养基中。然后，对叶片GFP瞬间表达情况进行观察，实验结果表明，叶龄对瞬间表达影响较大(表2)。从表2中可以看出，3个月叶龄的叶片转化后，能观察到GFP荧光的叶片点34.43％，而且此类叶片的再生频率也最高。1-2个月的叶片转化后，有GFP荧光的叶片所占比例和再生频率均最低，因此，本实施例中将播种后自第一片真叶出现后3个月的叶片用于最终转化。

表2、叶龄对农杆菌侵染后GFP瞬间表达、再生率和和转化效率的影响

3、农杆菌菌液浓度对GFP瞬间表达、再生率和转化效率的影响

设置OD值分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0五种不同浓度的农杆菌菌液，在其他转化参数相同的情况下，通过比较共培养过后叶片GFP瞬间表达率和再生率，选择最适合的OD值最为侵染的最佳浓度。

本实施例中用不同浓度的菌液在相同条件下对甜橙3个月龄的无菌苗叶片进行侵染，时间为10分钟，共培养时间为3天。试验结果表明(表3)，菌液浓度为0.2-0.6时，随着浓度的提高，瞬间表达率、再生率和转化效率也增加，OD值为0.6时三个参数的值最大。但当OD值增加到0.8时，三个参数又下降。因此，本实施例选择OD值为0.6的菌液用于叶片转化。

表3、OD值对农杆菌侵染后GFP瞬间表达、再生率和转化效率的影响

4、农杆菌侵染时间对GFP瞬间表达、再生率和转化效率的影响

在转化过程中，叶片在菌液中侵染时间对转化效率有一定影响，因此，本实施例将叶片用相同浓度的农杆菌菌液侵染，侵染时间设置成不同梯度，分别为5、10、15、20、25、30分钟。观察不同侵染时间对GFP瞬间表达、再生率和转化效率的影响，以确定最佳农杆菌侵染时间。。

研究结果见表4，由表4可以看出，侵染时间为10分钟时，能观察到GFP荧光的叶片比例最高，而且此浓度下再生率和转化效率均最高，当侵染时间延长时，三个参数逐渐下降，还观察到在长时间的侵染叶片培养过程中，有大量菌体包围无菌苗叶片生长，甚至覆盖整片叶，即使多次清洗仍然有农杆菌存在。因此，我们确定10分钟为适宜的侵染时间。

表4、侵染时间对农杆菌侵染后GFP瞬间表达、再生率和转化效率的影响

5、共培养时间对GFP瞬间表达、再生率和转化效率的影响

将经过相同条件的农杆菌转化的叶片外植体，分别经过1、2、3、4、5天共培养，比较不同共培养时间对GFP瞬间表达、再生率和转化效率的影响，以确定最佳共培养时间。

实验结果表明(表5)，所用的5个共培养时间中均能检测到GFP荧光，但不同共培养时间后GFP荧光叶片所占比例不一样，对再生率和转化效率影响也不相同。随着共培养时间由1天增加到3天，三个参数均增加达到最大值，共培养时间再延长，三个参数又下降。因此，申请人认为共培养3天为农杆菌介导甜橙叶片转化的最佳时间。

表5、OD值对农杆菌侵染后GFP瞬间表达、再生率和转化效率的影响

本说明书用到的一些化学或生物化学物质的简称的详细信息见表6。

表6本发明应用的化学或生物化学物质的缩略表

Claims (2)

1.一种利用农杆菌介导的柑橘叶片转化培育转基因植株的方法，其步骤包括遗传转化及植株鉴定，其特征在于，采用离体柑橘无菌苗叶片作为遗传转化的受体材料，经农杆菌侵染、共培养、恢复培养、选择和生根培养，将GFP报告基因导入受体，利用卡那霉素作为选择剂对转化后的受体细胞进行筛选，通过GFP荧光观察和PCR检测筛选得到转基因植株；其步骤如下： 

1)将柑橘种子在离体培养基上播种，获得柑橘无菌苗叶片； 

2)侵染：将步骤1)中的柑橘无菌苗叶片切成1cm²的方块，每个小方块用手术刀片在叶背垂直主脉方向划伤3-4刀后，置于OD₆₀₀为0.2～1的农杆菌菌液中浸泡10分钟，期间每2-3分钟摇动一次； 

3)共培养：将步骤2)中的叶片从农杆菌液中取出，用无菌滤纸吸干，接入共培养培养基中，在26±1℃黑暗条件下培养3d； 

4)选择培养：将步骤3)中叶片转入选择培养基上，先暗培养4周，然后转入45μmolm^-2s^-1的光照下进行不定芽的诱导，此后，每隔3-4周换一次新鲜的选择培养基直至不定芽分化； 

5)抗性芽进一步筛选及芽伸长培养：将步骤4)中再生出小芽的叶片从选择培养基中取出，将其转移至芽伸长培养基中进行抗性芽进一步筛选和促进芽伸长； 

6)抗性苗的生根：将步骤5)中1-3厘米高的抗性苗切下转入生根培养基中进行生根培养，获得候选转基因抗性植株；

7)对候选转基因植株进行PCR检测，对检测为阳性的株系进行GFP荧光观察，验证获得转基因植株； 

培养基的组分及其配比如下： 

离体培养基：MS培养基的无机盐大量成分和无机盐微量成分，8g/L琼脂；pH5.8； 

共培养培养基：MT培养基+0.1mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.5mg/L细胞激动素+25mg/L乙酰丁香酮；蔗糖30g/L；琼脂8g/L；pH5.8； 

选择培养基：MT培养基+0.1mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.5mg/L细胞激动素+50mg/L卡那霉素+250mg/L头孢霉素；蔗糖30g/L；琼脂8g/L；pH5.8； 

芽伸长培养基：MT培养基+0.2mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.2mg/L萘乙酸+0.2mg/L赤霉素+50mg/L卡那霉素+250mg/L头孢霉素；蔗糖30g/L；琼脂8g/L；pH5.8 

生根培养基：1/2MT培养基+0.5mg/L萘乙酸+0.1mg/L吲哚丁酸；蔗糖25g/L；0.5g/L活性碳；琼脂8g/L；pH5.8。 

2.权利要求1所述的方法在培育柑橘转基因植株上的应用。 

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