CN104561090A - 一套提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一套提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化效率的方法。本发明所提供的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括M1)和M2)：M1)用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树外植体得到转染外植体；M2)培养转染外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株；外植体的制备方法如下：将杨树组培苗的叶片从垂直主脉方向一分为二，得到近叶柄端半叶片和远叶柄端半叶片；将近叶柄端半叶片的叶边缘去除得到外植体。实验证明，本发明的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，适用于杨树以及其他木本植物的根癌农杆菌遗传转化，该方法重复性强，不受基因型限制，外源基因能够得到稳定表达，转化效率能够得到很大提高，转化效率能达到40％。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一套提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化效率的方法。
背景技术
杨树分布广，适应性强，是具有重要经济价值的优良阔叶树种。杨树生长快，容易繁殖，易于基因工程操作，被认为是林木基因工程中的理想模式树种。根癌农杆菌介导法是目前杨树遗传转化中应用最广泛且结果较为理想、技术较为成熟的一种外源基因转化方法。根癌农杆菌介导法具有以下优点：操作简便；外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝；转移DNA片段明确，可转移大片段DNA；可直接用不同的植物组织进行基因转移等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化的转化效率。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法。
本发明所提供的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括M1)和M2)：
M1)用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树的外植体得到转染的外植体；
M2)培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株；
所述外植体的制备方法如下：将杨树组培苗的叶片从垂直主脉方向一分为二，得到近叶柄端半叶片和远叶柄端半叶片；将所述近叶柄端半叶片的叶边缘去除得到所述外植体。
上述方法中，所述近叶柄端半叶片可为所述叶片的主叶脉清晰部分。
上述方法中，所述用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树的外植体得到转染的外植体可包括H1)和H2)：
H1)用MS侵染液重悬所述重组根癌农杆菌的菌体得到农杆菌侵染液；
H2)用所述农杆菌侵染液转染杨树的外植体得到所述转染的外植体。
上述方法中，所述MS侵染液可为向MS液体培养基中加入MES、葡萄糖和AS得到的液体，其中所述MES、所述葡萄糖和所述AS的浓度分别为500mg/L、10g/L、200μM。
上述方法中，所述转染的时间可为10-30分钟。所述10-30分钟具体可为15分钟。
上述方法中，所述杨树组培苗按照如下方法获得：将无菌杨树顶芽接入生根培养基在光照下培养15-30天得到所述杨树组培苗。
其中，所述生根培养基为向MS培养基中加入NAA得到的固体培养基，其中NAA的浓度为0.1mg/L。
上述方法中，所述杨树组培苗也可按照如下方法获得：将无菌杨树叶片接入分化培养基在光照下进行培养得到无根组培苗；将所述无根组培苗接入所述生根培养基在光照下培养15-30天得到所述杨树组培苗。
其中，所述分化培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA和TDZ得到的固体培养基，其中所述NAA、所述6-BA和所述TDZ的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L。
上述方法中，所述15-30天具体可为18-22天。所述18-22天具体可为20天。
上述方法中，所述培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株包括A1)-A5)：
A1)共培养所述转染的外植体，得到共培养的外植体；
A2)将所述共培养的外植体进行恢复培养，得到恢复培养的外植体；
A3)将所述恢复培养的外植体进行分化培养得到抗性丛生芽；
A4)将所述抗性丛生芽进行增殖培养得到抗性幼芽；
A5)将所述抗性幼芽进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。
上述方法中，所述共培养所述转染的外植体为将所述转染的外植体在共培养基上于24-25℃下黑暗中培养3天。所述共培养基为向MS培养基中加入MES、葡萄糖、NAA、6-BA和AS得到的固体培养基，其中，所述MES、所述葡萄糖、所述NAA、所述6-BA和所述AS的浓度分别为500mg/L、10g/L、0.1mg/L、0.2mg/L、200μM。
所述恢复培养为将所述共培养的外植体在恢复培养基上于25℃、16h光照/8h黑暗下培养。所述恢复培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA、所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、250mg/L。
A3)所述分化培养为将所述恢复培养的外植体于25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养。A3)所述分化培养的时间可为四周。A3)所述分化培养的培养基可为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ、抗生素和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA、所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、250mg/L。
所述增殖培养为将所述抗性丛生芽在增殖培养基上于25℃、16h光照/8h黑暗下培养。所述增殖培养基为向MS培养基中加入抗生素和特美汀得到的固体培养基，其中所述特美汀的浓度为250mg/L。
上述方法中，所述恢复培养的时间可为5-10天。所述5-10天具体可为7天(一周)。
上述方法中，所述将所述抗性幼芽进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株包括B1)、B2)和B3)：
B1)将所述抗性幼芽进行生根培养得到抗性植株；
B2)将所述抗性植株的顶芽进行二次生根培养得到根成放射状生长的杨树转基因植株；
B3)将所述根成放射状生长的杨树转基因植株进行二次分化培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。
其中，B1)所述生根培养和B2)所述二次生根培养的培养基均可为向MS培养基中加入NAA、抗生素和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA和所述特美汀的浓度分别为0.1mg/L、250mg/L。
B1)所述生根培养为将所述抗性幼芽在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养15-20天；B2)所述二次生根培养为将所述抗性植株的顶芽在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养15-20天。
上述方法中，所述将所述根成放射状生长的杨树转基因植株进行二次分化培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株，包括D1)和D2)：
D1)将所述根成放射状生长的杨树转基因植株的叶片进行二次分化培养得到二次分化无根组培苗；
D2)将所述二次分化无根组培苗进行生根培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。
其中，D2)所述生根培养的培养基可为向MS培养基中加入NAA、抗生素和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA和所述特美汀的浓度分别为0.1mg/L、250mg/L。
D2)所述生根培养可为将所述二次分化无根组培苗在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养15-20天。
所述二次分化培养的培养基可为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ、抗生素和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA、所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、250mg/L。
所述二次分化培养为将所述根成放射状生长的杨树转基因植株的叶片在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养四周。
上述方法中，所述根成放射状生长的杨树转基因植株的叶片可为所述根成放射状生长的杨树转基因植株的叶片的主脉清晰部分。
上述方法中，所述方法还包括将所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株进行炼苗和移栽的步骤。
上述方法中，所述炼苗包括H1)、H2)、H3)和H4)：
H1)将盛有所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株的容器松口，保持一天；
H2)在无阳光直射处将所述容器的盖打开，保持一天；
H3)在阳光下培养所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株一天，得到炼苗后的杨树转基因植株；
H4)将所述炼苗后的杨树转基因植株的根部洗净后放在锥形瓶中室温下水培5-7天，1-2天换一次水，直至长出新根长约1cm。
所述移栽包括将所述炼苗后长出新根的杨树转基因植株移栽至土中(灭菌营养土和蛭石比例为1：1)的步骤。
上述方法中，所述杨树具体可为山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)。所述杨树也可为欧美杨107(P.euramericana)或毛白杨(P.tomentosa)。
上述方法中，所述根癌农杆菌具体可为EHA105。
在本发明的一个实施方式中，所述重组根癌农杆菌为将pCAMBIA-3301载体导入根癌农杆菌EHA105中得到的重组根癌农杆菌。
本发明中，所述抗生素可为卡那霉素。所述卡那霉素的浓度可为30mg/L。
实验证明，本发明的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，适用于杨树以及其他木本植物的根癌农杆菌遗传转化，该方法重复性强，不受基因型限制，侵染效率能够得到很大提高，转化效率能达到40％。用本发明的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法可以提高杨树的转化率，并且利用本发明的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法可使目的基因在转基因植株中稳定表达。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)(李健，王有菊，姜静等.山新杨转eIF1A基因及耐盐性分析.东北林业大学学报，2010,38:12-27.)公众可从北京市农林科学院(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的欧美杨107(P.euramericana)(杨艳丽，刘兴菊，刘桂林等.双抗虫基因转化欧美杨107的研究.生物技术，2012,07:120-122.)公众可从北京市农林科学院(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的毛白杨(P.tomentosa)(郝贵霞，朱祯，朱之悌.毛白杨遗传转化系统优化的研究.植物学报，1999,41(9)：936-940.)公众可从北京市农林科学院(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的根癌农杆菌均为根癌农杆菌EHA105(Benedict C,Skinner JS,Meng R,Chang Y,Bhalerao R,Huner NP,Finn CE,Chen TH,Hurry V(2006).TheCBF1-dependent low temperature signalling pathway，regulon and increase infreeze tolerance are conserved in Populus spp.Plant,Cell Environ.,29:1259-1272)。
下述实施例中的载体A均为pCAMBIA 3301(李慧，武天龙.CaCl2诱导大豆花粉管通道农杆菌转基因研究.大豆科学，2007,26(1):55-59.)。
下述实施例中的MS侵染液为向MS液体培养基中加入MES、葡萄糖和AS得到的液体，其中MES、葡萄糖和AS的浓度分别为500mg/L、10g/L、200μM。
下述实施例中的共培养基为向MS培养基中加入MES、葡萄糖、NAA、6-BA和AS得到的固体培养基，其中，MES、葡萄糖、NAA、6-BA和AS的浓度分别为500mg/L、10g/L、0.1mg/L、0.2mg/L、200μM。
下述实施例中的恢复培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ和特美汀(Timentin)得到的固体培养基，其中NAA、6-BA、TDZ和Timentin的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、250mg/L。
下述实施例中的增殖培养基为向MS培养基中加入卡那霉素(Kan)和特美汀(Timentin)得到的固体培养基，其中Kan和Timentin的浓度分别为30mg/L、250mg/L。
其中，NAA为萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid)，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)，TDZ为噻二唑苯基脲(Thidiazuron)。MS培养基由溶剂和溶质组成的固体培养基，其中溶剂为水，溶质如表1。MS液体培养基是将该MS培养基中的琼脂去除，其它成分不变得到的培养基。
表1、MS培养基溶质及其浓度
实施例1、根癌农杆菌介导的杨树遗传转化
根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括M1)和M2)：
M1)用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树的外植体得到转染的外植体；
M2)培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株。
本实施例中的杨树均为山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)，具体方法如下：
1、农杆菌侵染液的制备
1.1将载体A导入根癌农杆菌，得到含有目的DNA的重组根癌农杆菌。其中，载体A含有GUS基因，表达GUS蛋白。
1.2将步骤1.1的含有目的DNA的重组根癌农杆菌涂在含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP固体培养基上，28℃下黑暗培养2天，得到重组根癌农杆菌单菌落。将重组根癌农杆菌单菌落接种于10ml含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃、220rpm下培养至OD600为1.5(约培养18小时)，得到农杆菌培养液A；将农杆菌培养液A按照农杆菌培养液A：YEP液体培养基为1：100的体积比接种于不含抗生素的YEP液体培养液中，于28℃、220rpm下培养至OD600在0.5-0.6之间(约培养5-6小时)，得到农杆菌培养液。
1.3将80mL步骤1.2的农杆菌培养液于室温、6300rpm下离心9min得到农杆菌菌体，重悬农杆菌菌体于80mL MS侵染液中，得到农杆菌悬浮液，将农杆菌悬浮液在室温、80rpm下孵育1h，得到农杆菌侵染液。
2、外植体的制备
2.1杨树组培苗的制备
杨树组培苗按照如下方法获得：
将无菌杨树叶片接入分化培养基(该分化培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA和TDZ得到的固体培养基，其中NAA、6-BA和TDZ的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L)在光照下进行培养得到无根组培苗；将所述无根组培苗接入生根培养基(该生根培养基为向MS培养基中加入NAA得到的固体培养基，其中NAA的浓度为0.1mg/L)在光照下培养15-30天得到所述杨树组培苗。具体方法如下：
2.1.1对移栽到温室一个月后的杨树叶片(叶片鲜绿、健壮)按照下述方法进行消毒：(1)70％(体积百分比浓度)乙醇消毒30s，无菌水洗3次；(2)3％(有效氯的质量分数)的次氯酸钠，消毒20min，无菌水洗5次，得到消毒后的无菌杨树叶片；
2.1.2将消毒后的无菌杨树叶片接入分化培养基(该分化培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA和TDZ得到的固体培养基，其中NAA、6-BA和TDZ的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L)在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养30天得到无根组培苗；将无根组培苗接入生根培养基(该生根培养基为向MS培养基中加入NAA得到的固体培养基，其中NAA的浓度为0.1mg/L)在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养20天(将无根组培苗接入生根培养基的当天记为培养第1天)，在培养第20天得到杨树组培苗。
2.2外植体的制备
从垂直主脉方向将步骤2.1的杨树组培苗的叶片一分为二，得到主叶脉清晰的近叶柄端半叶片和远叶柄端半叶片，取近叶柄端半叶片，将近叶柄端半叶片的叶边缘去除得到外植体(即外植体a)。
3、杨树转基因植株的获得
3.1转染：
将60个步骤2的外植体a置于盛有80mL步骤1得到的农杆菌侵染液的锥形瓶(150ml规格)中，于23-24℃、80rpm下转染15min。将外植体取出并将其周围多余的菌液用滤纸吸干净，得到转染的外植体。
3.2共培养
将步骤3.1的转染的外植体放入共培养基上，在24-25℃下黑暗中培养3天，得到共培养后的外植体。将共培养后的外植体用无菌蒸馏水清洗三次，再用浓度为250mg/L的特美汀(Timentin)无菌水溶液清洗两次，并用滤纸吸干外植体上多余的水分，得到共培养的外植体。
3.3恢复培养
将步骤3.2的共培养的外植体放入恢复培养基上，在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养一周，得到恢复培养的外植体。
3.4分化培养
将步骤3.3的恢复培养的外植体放入分化培养基(该分化培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ、卡那霉素和Timentin得到的固体培养基，其中NAA、6-BA、TDZ、卡那霉素和Timentin的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、30mg/L、250mg/L)上，在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养四周，完成外植体的筛选与分化，得到抗性丛生芽。
3.5增殖培养
将步骤3.4的抗性丛生芽放入增殖培养基上，在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养，当转基因丛生芽长至芽高为0.5-1.5厘米时，在每丛丛生芽中选取形态好、健壮的幼芽，得到抗性幼芽。
3.6生根培养
将步骤3.5的抗性幼芽放入生根培养基(该生根培养基为向MS培养基中加入NAA、卡那霉素和Timentin得到的固体培养基，其中NAA、卡那霉素和Timentin的浓度分别为0.1mg/L、30mg/L、250mg/L)上，在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养15-20天，选择已生出根的幼苗得到抗性植株。
3.7二次生根培养
将步骤3.6抗性植株的顶芽放入生根培养基(该生根培养基为向MS培养基中加入NAA、卡那霉素和Timentin得到的固体培养基，其中NAA、卡那霉素和Timentin的浓度分别为0.1mg/L、30mg/L、250mg/L)上，在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养15-20天，得到24株根成放射状生长的转基因植株。
分别用引物对：GUS-F：CATGGAGTCAAAGATTCAAAT；GUS-R：CCCGATCTAGTAACATAGATG对步骤3.7的转基因植株中的目的DNA进行PCR鉴定。结果表明，步骤3.7的24株杨树转基因植株均含有目的条带。
上述实验设三次重复实验，每次重复实验的转染的外植体数为60个。结果显示，这三次重复实验得到的转基因杨树分别为21株、24株、27株，得到的杨树转基因植株平均为24株，转基因杨树的转化率为40％。转基因杨树的转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染的外植体总数×100％。
按照下述方法进行GUS活性的组织化学染色鉴定，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
GUS活性的组织化学染色鉴定步骤3.7的转基因植株，按Jefferson的方法进行，具体方法如下：
(1)将步骤3.7的转基因植株的三片幼叶放入2ml离心管中，向离心管中加入GUS染液，使叶片全部浸在GUS染液中，37℃避光过夜，得到染色后的转基因植株叶片；用山新杨组培苗叶片作为阴性对照；
(2)用70％乙醇脱色步骤(1)的染色后的转基因植株叶片3次，至阴性对照叶片呈无色。
结果显示，30株转基因植株的叶片均出现蓝色，其中60％的步骤3.7的转基因植株的叶片全部变为蓝色，40％的步骤3.7的转基因植株的叶片部分变为蓝色，阴性对照的叶片均为无色，表明此时得到的转基因植株中均有GUS基因的表达。
4、二次分化培养
4.1二次分化培养
将步骤3的转基因植株的主叶脉清晰的近叶柄端的叶片沿边缘剪一圈并放入分化培养基(该分化培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ、卡那霉素和Timentin得到的固体培养基，其中NAA、6-BA、TDZ、卡那霉素和Timentin的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、30mg/L、250mg/L)上(每一株系的叶片放入一个盛有分化培养基的培养瓶中)，在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养四周，得到二次分化无根组培苗；将该二次分化无根组培苗放入生根培养基(该生根培养基为向MS培养基中加入NAA、卡那霉素和Timentin得到的固体培养基，其中NAA、卡那霉素和Timentin的浓度分别为0.1mg/L、30mg/L、250mg/L)上，在25℃、16h光照/8h黑暗、光照强度2000-3000lux下培养15-20天，得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株。
4.2移栽
将步骤4.1的杨树转基因植株，室温(22-25度)炼苗三天：第一天将培养瓶的封口处的皮筋松掉，第二天在阴凉处把盖打开，第三天让阳光照射转基因幼苗。炼苗结束后将转基因植株的根部培养基洗净后放在锥形瓶中室温水培5-7天，1-2天换一次水，直至长出新根长约1cm，然后将转基因幼苗移栽到土里(灭菌营养土与蛭石土比列为1:1)，得到盆栽的转基因杨树。
4.3GUS活性的组织化学染色鉴定
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
GUS活性的组织化学染色鉴定步骤4中4.2的杨树转基因植株，按Jefferson的方法进行，具体方法如下：
(1)将步骤4中4.2的盆栽的杨树转基因植株的三片幼叶放入2ml离心管中，向离心管中加入GUS染液，使叶片全部浸在GUS染液中，37℃避光过夜，得到染色后的转基因叶片；用山新杨组培苗叶片作为阴性对照；
(2)用70％乙醇脱色步骤(1)的染色后的转基因叶片3次，至阴性对照叶片呈无色。
结果表明，步骤4中4.2的盆栽的杨树转基因植株的叶片全部变为蓝色，阴性对照的叶片均为无色，表明经二次分化得到的杨树转基因植株为GUS基因成功转入杨树基因组中并稳定表达的转基因杨树。
上述实验结果表明，用本发明的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法可以提高杨树的转化率，转基因杨树的转化率达40％，并且利用本发明的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法可使目的基因在转基因植株中稳定表达。
实施例2、不同基因型对杨树转基因效率的影响
一、欧美杨107(P.euramericana)的转基因效率
按照实施例1步骤1-3的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，将杨树替换为欧美杨107(P.euramericana)，其他步骤均不变，得到10株杨树转基因植株。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的杨树转化率为16.7％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染的外植体总数×100％。
二、毛白杨(P.tomentosa)的转基因效率
按照实施例1步骤1-3的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，将杨树替换为毛白杨(P.tomentosa)，其他步骤均不变，得到12株杨树转基因植株。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的杨树转化率为20％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染外植体总数×100％。
实验结果表明，用本发明的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法可以提高杨树的转化率，且不同基因型杨树的转化率均较高。
对比例1、不同外植体对杨树转化效率的影响
一、以叶柄为外植体的杨树转化效率
1、农杆菌侵染液的制备
农杆菌侵染液的制备同实施例1步骤1。
2、外植体的制备
将实施例1步骤2.1的杨树组培苗的叶柄剪下，并分成1cm长的叶柄段。
3、杨树转基因植株的获得
按照实施例1步骤3杨树转基因植株获得的方法，将“步骤2的外植体a”替换为本对比例1步骤一中步骤2的叶柄段，其他步骤均不变，得到3株杨树转基因植株甲。
4、杨树转基因植株的鉴定
分别用引物对GUS-F：CATGGAGTCAAAGATTCAAAT和GUS-R：CCCGATCTAGTAACATAGATG对步骤3的杨树转基因植株甲中的目的DNA进行PCR鉴定。结果显示，3株杨树转基因植株甲中均含有目的基因。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的杨树转化率为5％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率％＝二次生根后获得的转基因植株数/转染外植体总数×100％。
二、以茎段为外植体的杨树转化效率
1、农杆菌侵染液的制备
农杆菌侵染液的制备同实施例1步骤1。
2、外植体的制备
将实施例1步骤2.1的杨树组培苗的茎剪下，并分成1cm长的茎段。
3、杨树转基因植株的获得
按照实施例1步骤3杨树转基因植株获得的方法，将“步骤2的外植体a”替换为本对比例1步骤二中步骤2的茎段，其他步骤均不变，得到5株杨树转基因植株乙。
4、转基因杨树的鉴定
分别用引物对GUS-F：CATGGAGTCAAAGATTCAAAT和GUS-R：CCCGATCTAGTAACATAGATG对步骤3的杨树转基因植株乙中的目的DNA进行PCR鉴定。结果显示，5株杨树转基因植株乙中均含有目的基因。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的杨树转化率为8.3％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染外植体总数×100％。
三、以全叶片为外植体的杨树转化效率
1、农杆菌侵染液的制备
农杆菌侵染液的制备同实施例1步骤1。
2、外植体的制备
将实施例1步骤2.1的杨树组培苗的全叶随机剪成长宽均约为1cm的叶块。
3、杨树转基因植株的获得
按照实施例1步骤3杨树转基因植株获得的方法，将“步骤2的外植体a”替换为本对比例1步骤三中步骤2的叶块，其他步骤均不变，得到3株杨树转基因植株丙。
4、杨树转基因植株的鉴定
分别用引物对GUS-F：CATGGAGTCAAAGATTCAAAT和GUS-R：CCCGATCTAGTAACATAGATG对步骤3的杨树转基因植株丙中的目的DNA进行PCR鉴定。结果显示，3株杨树转基因植株丙中均含有目的基因。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的杨树转化率为5％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染外植体总数×100％。
四、主脉有伤口的外植体a的杨树转化效率
1、农杆菌侵染液的制备
农杆菌侵染液的制备同实施例1步骤1。
2、外植体的制备
将实施例1步骤2中外植体a的主脉切几刀造成伤口，得到主脉有伤口的外植体a。
3、杨树转基因植株的获得
按照实施例1步骤3杨树转基因植株获得的方法，将“步骤2的外植体a”替换为本对比例1步骤四中步骤2的主脉有伤口的外植体a，其他步骤均不变，得到9株杨树转基因植株丁。
4、杨树转基因植株的鉴定
分别用引物对GUS-F：CATGGAGTCAAAGATTCAAAT和GUS-R：CCCGATCTAGTAACATAGATG对步骤3的杨树转基因植株丁中的目的DNA进行PCR鉴定。结果显示，9株杨树转基因植株丁中均含有目的基因。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的杨树转化率为15％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染外植体总数×100％。
结果表明，以叶柄、茎段、全叶片和主脉有伤口的外植体a作为外植体，转化效率均没有用本发明中的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法外植体a作为外植体的转化效率高。
对比例2、无根组培苗接入生根培养基的时间对杨树转化效率的影响
1、农杆菌侵染液的制备
农杆菌侵染液的制备同实施例1步骤1。
2、外植体的制备
按照实施例1步骤2的2.1杨树组培苗的制备方法，将步骤2.1.2中20天替换为15天，其他步骤均不变，得到15天杨树组培苗。按照实施例1步骤2的2.2外植体的制备方法，将步骤2.1的杨树组培苗替换为该15天杨树组培苗，其他步骤均不变，得到15天组培苗外植体a。
按照实施例1步骤2的2.1杨树组培苗的制备方法，将步骤2.1.2中20天替换为30天，其他步骤均不变，得到30天杨树组培苗。按照实施例1步骤2的2.2外植体的制备方法，将步骤2.1的杨树组培苗替换为该30天杨树组培苗，其他步骤均不变，得到30天组培苗外植体a。
3、杨树转基因植株的获得
按照实施例1步骤3杨树转基因植株的获得的方法，将“步骤2的外植体a”替换为本对比例2步骤2的15天组培苗外植体a，其他步骤均不变，没有得到杨树转基因植株。
按照实施例1步骤3杨树转基因植株的获得的方法，将“步骤2的外植体a”替换为本对比例2步骤2的30天组培苗外植体a，其他步骤均不变，得到17株30天组培苗杨树转基因植株。
4、杨树转基因植株的鉴定
分别用引物对GUS-F：CATGGAGTCAAAGATTCAAAT和GUS-R：CCCGATCTAGTAACATAGATG对步骤3的30天组培苗杨树转基因植株中的目的DNA进行PCR鉴定。结果显示，17株30天组培苗杨树转基因植株中均含有目的基因。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的15天组培苗杨树转基因植株的转化率为0；三次重复试验的30天组培苗的杨树转化率为28.3％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染外植体总数×100％。
结果表明，无根组培苗接入生根培养基15天和30天的转化效率均没有本发明的无根组培苗接入生根培养基20天的转化效率高。
对比例3、MS侵染液和共培养基中外源添加物对杨树转化效率的影响
1、MES和葡萄糖对杨树转化效率的影响
按照实施例1步骤1-3的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，将MS侵染液替换为MS侵染液A(MS侵染液A为向MS液体培养基中加入AS得到的液体，其中AS的浓度为200μM)，并将共培养基替换为共培养基A(共培养基A为向MS培养基中加入NAA、6-BA和AS得到的固体培养基，其中，NAA、6-BA和AS的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、200μM)，其他步骤均不变，得到11株杨树转基因植株。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的杨树转基因植株的转化率为18.3％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染的外植体总数×100％。
2、AS及其浓度对杨树转化效率的影响
2.1AS对杨树转化效率的影响
按照实施例1步骤1-3的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，将MS侵染液替换为MS侵染液B(MS侵染液B为向MS液体培养基中加入MES和葡萄糖得到的液体，其中MES和葡萄糖的浓度分别为500mg/L、10g/L)，并将共培养基替换为共培养基B(共培养基B为向MS液体培养基中加入MES、葡萄糖、NAA和6-BA得到的固体培养基，其中，MES、葡萄糖、NAA和6-BA的浓度分别为500mg/L、10g/L、0.1mg/L、0.2mg/L)，其他步骤均不变，得到3株杨树转基因植株。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的杨树转化率为5.0％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染的外植体总数×100％。
2.2AS浓度对杨树转化效率的影响
按照实施例1步骤1-3的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，将MS侵染液替换为MS侵染液C(MS侵染液C为向MS液体培养基中加入AS得到的液体，其中AS的浓度为100μM)，并将共培养基替换为共培养基C(共培养基C为向MS液体培养基中加入MES、葡萄糖、NAA、6-BA和AS得到的固体培养基，其中，MES、葡萄糖、NAA、6-BA和AS的浓度分别为500mg/L、10g/L、0.1mg/L、0.2mg/L、100μM)，其他步骤均不变，得到19株杨树转基因植株。
上述实验设三次重复，结果显示，三次重复试验的杨树转化率为31.7％。每次重复试验的转染的外植体数为60个，杨树转化率的计算公式为转化率(％)＝二次生根后获得的转基因植株数/转染的外植体总数×100％。
Claims (10)
1.根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括M1)和M2)：
M1)用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树的外植体得到转染的外植体；
M2)培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株；
所述外植体的制备方法如下：将杨树组培苗的叶片从垂直主脉方向一分为二，得到近叶柄端半叶片和远叶柄端半叶片；将所述近叶柄端半叶片的叶边缘去除得到所述外植体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述杨树组培苗按照如下方法获得：将无菌杨树顶芽接入生根培养基在光照下培养15-30天得到所述杨树组培苗。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述15-30天为20天。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株包括A1)-A5)：
A1)共培养所述转染的外植体，得到共培养的外植体；
A2)将所述共培养的外植体进行恢复培养，得到恢复培养的外植体；
A3)将所述恢复培养的外植体进行分化培养得到抗性丛生芽；
A4)将所述抗性丛生芽进行增殖培养得到抗性幼芽；
A5)将所述抗性幼芽进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述恢复培养为将所述共培养的外植体在恢复培养基上于25℃、16h光照/8h黑暗下培养；所述恢复培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA、所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、250mg/L；
所述增殖培养为将所述抗性丛生芽在增殖培养基上于25℃、16h光照/8h黑暗下培养；所述增殖培养基为向MS培养基中加入抗生素和特美汀得到的固体培养基，其中所述特美汀的浓度为250mg/L。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述恢复培养的时间为5-10天。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述将所述抗性幼芽进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株包括B1)、B2)和B3)：
B1)将所述抗性幼芽进行生根培养得到抗性植株；
B2)将所述抗性植株的顶芽进行二次生根培养得到根成放射状生长的杨树转基因植株；
B3)将所述根成放射状生长的杨树转基因植株进行二次分化培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述将所述根成放射状生长的杨树转基因植株进行二次分化培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株，包括D1)和D2)：
D1)将所述根成放射状生长的杨树转基因植株的叶片进行二次分化培养得到二次分化无根组培苗；
D2)将所述二次分化无根组培苗进行生根培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法还包括将所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株进行炼苗和移栽的步骤。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述杨树为山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)或欧美杨107(P.euramericana)或毛白杨(P.tomentosa)。
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