CN104611362A - 一种木本植物的活体表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木本植物的活体表达方法，该方法包括：植物样品的制备，超表达载体的构建，农杆菌的侵染转化以及植物超表达载体的遗传转化等步骤。通过构建超表达载体pCAMBIA1304-CmKAO和干扰载体CmKAO-RNAi，在野生和芽变短雄花序的雄花序原基形成期，以农杆菌介导携带有KAO基因载体菌液，分别在雄花序上进行注射和涂抹，建立了板栗花序的瞬时超表达和干扰体系。板栗雄花序活体-瞬时转化系统的建立对于童期长、再生体系不完善的植物来讲，使得在其亲本上验证基因功能得以实现，且大大缩短了转化周期，对于其它植物尤其是木本植物活体-瞬时系统的转化提供了有价值的参考。

Description

一种木本植物的活体表达方法

技术领域

本发明涉及一种本本植物的活体表达方法，特别是涉及板栗的活体快速表达方法。

背景技术

随着大量植物基因组的测序完成，越来越多的同源基因和未知基因信息被发掘出来,这些基因的功能企待验证。以突变体为主导的反向遗传学技术是最有效的验证基因功能的手段。这种技术首先需要获得突变体的来源，通过T-DNA插入和转座子插入等可以获得人工突变体，而对于难以通过人工修饰改变基因获得突变体的植物来讲，自然突变是获得突变体的重要来源。对于有突变体而没有完整再生体系的植物来说，可以借助于模式植物如拟南芥、烟草等的同源基因突变体进行验证，但对于与特定性状有关的基因功能的验证则难以利用模式植物突变体来完成，如根瘤、菌根、雄花序发育性状等。即便对于有突变体、转基因再生体系又较完善的木本植物来说，因其为多年生植物，生长周期长，因此通过果实和花的表型变化来验证基因的功能时也面临着漫长的等待过程。

基于此，一些瞬时、快速的验证基因功能的转化方法被发展出来。原生质体瞬时转化法是利用新鲜组织的原生质体研究基因功能和调控的一种方法，原生质体(拟南芥)可以达到90％的转化效率(Sheen J.Signal transduction in maizeand Arabidopsis mesophyll protoplasts.Plant Physiology,2001,127:1466–1475)。优点是原生质体易于获得、操作，来源不同的原生质体保留了原生质体的同质性和分化状态的特异性。缺点是缺乏细胞之间的互作，只能看到单细胞下基因的表达。病毒介导的基因转化法(Fu DQ，Zhu BZ，Zhu HL，et al.Virus-induced genesilencing in tomato fruit.Plant J，2005，43(2)：299-308)，这是一种利用TRV(tobaccorattle virus)病毒介导转化的方法，可以侵染叶片和果实等部位，可以高效地验证基因的功能，但这种技术主要依赖于TRV对宿主的侵染敏感性。发根农杆菌介导的毛状根发生的转化方法(Cao QQ,Camp ROD,Kalhor MS,Bisseling T,Geurts R.Efficiency of Agrobacterium rhizogenes–mediated root transformation ofParasponia and Trema is temperature dependent.Plant Growth Regulation,2012,68:459-465)是利用发根农杆菌rol基因(root inducing locus)整合到植物体中诱导毛状根的发生，大约一个月左右就可以产生转化的根系。目的基因可以和rol基因共转化，其结果是产生了复合植物，即未转化的茎梢和已转基因的根系。这种技术被广泛地应用于研究根系的发育、根系与微生物互作的研究，如根瘤共生和菌根共生等。但是其特点也是它的局限性，仅限于在根系方面的研究。以上技术的特点是时间周期短、不依赖于再生转基因体系的建立，操作简单、方便、直观。

前期研究中本项目组发现了一株自然实生板栗芽变，雄花序短小(Feng YQ,Shen YY,Cao QQ,Qin L,Han ZH.Short catkin1,a novel mutant of Castaneamollissima,is associated with programmed cell death during chestnut staminateflower differentiation.Sci Hortic,2011,130:434-435)。芽变雄花序在生长发育过程中，中上部发生细胞程序性死亡(PCD)，花序变黄，弯曲，最后枯死脱落，而基部的花序发育正常，雄花序的平均长度2.2cm，只有普通板栗雄花序长度的1/6-1/8。前期研究还发现，该雄花序的短化与赤霉素密切相关，在芽变雄花序发育的整个过程贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)基因表达量显著低于野生型，且活性赤霉素含量也低于野生型(Guo XP,Li XL，Duan XW,Shen YY,Xing Y,Cao QQ,Qin L.Characterization of sck1,a novel Castanea mollissima mutant with theextreme short catkins and decreased gibberellin.Plos One,2012)。鉴于KAO基因与板栗短雄花序发育的紧密关系，迫切需要验证KAO基因的功能。但中国板栗生长周期长，且目前中国板栗转基因再生体系还未建立，因而急需一种有效的方法来验证KAO基因的功能。

发明内容

本发明借助于自然突变的板栗短雄花序芽变介绍一种木本植物板栗的活体快速表达方法。通过构建超表达载体pCAMBIA1304-CmKAO和干扰载体CmKAO-RNAi，在野生和芽变短雄花序的雄花序原基形成期，以农杆菌介导携带有KAO基因载体菌液，分别在雄花序上进行注射和涂抹，建立了板栗花序的瞬时超表达和干扰体系。板栗雄花序活体-瞬时转化系统的建立对于童期长、再生体系不完善的植物来讲，使得在其亲本上验证基因功能得以实现，且大大缩短了转化周期，对于其它植物尤其是木本植物活体-瞬时系统的转化提供了有价值的参考。

本发明的木本制备的活体表达方法包括以下步骤：

(1)植物样本的制备

提供植物的RNA样本，加入无RNA活性的DNA酶，消化总RNA中的DNA，测定RNA的完整性和浓度，检测特征吸光度的比值达到要求，得到总RNA样品；使用反转录酶对所述总RNA样品进行反转录得到cDNA，冷冻保存。

(2)超表达载体的构建

以步骤(1)所述的cDNA为模板进行PCR扩增，对CmKAO基因进行克隆；回收目的DNA片段后，连接T载体；通过蓝白斑(α-互补)筛选和菌液PCR鉴定，获得阳性克隆产物；通过序列分析提取含有T载体的CmKAO重组质粒DNA；选取pCAMBIA1304载体上多克隆位点的酶切位点，对含有T载体的CmKAO重组质粒DNA及载体质粒DNA进行酶切和连接，培养筛选重组子pCAMBIA1304-CmKAO，通过相同的双切酶检测获得pCAMBIA 1304-CmKAO超表达载体。

(3)农杆菌的侵染转化

选取一定量的LGV3101农杆菌感受态细胞，加入步骤(2)所述的pCAMBIA1304-CmKAO超表达载体，进行细胞培养，挑取菌落，PCR检测后保存菌种；将菌种在培养基上划线培养，检测OD，用侵染液调节OD值，活化后，用1ml的注射器对活体植物组织进行侵染，毛笔涂抹组织，完成对活体植物的侵染。

(4)植物超表达载体的遗传转化

含有CmKAO超表达载体的农杆菌分别侵染突变体组织和野生型组织，侵染后采样提取DNA，以1304J为引物进行鉴定，实时荧光定量和半定量PCR检测，完成植物的活体表达。

进一步，所述步骤(1)中的测定RNA的完整性和浓度为通过1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性以及利用核酸测定仪检测总RNA的浓度；所述特征吸光度比为OD260/280和OD260/230。

进一步，所述步骤(1)中的反转录包括如下步骤：

配置2-20μL反应体系I，其中所述反应体系I包括1-10μL的Oligo(dT)18，1-10μg的总RNA，采用RNase free dH₂O补足溶液总体积，PCR仪中70℃反应5-15min，冰上骤冷3-8min并短暂离心；再在冰上配置2-20μL反应体系II，所述反应体系II包括上述反应体系I 2-20μL，1-6μL缓冲溶液，0.2-2μL dNTP,0.1-0.5μL RNase inhibiter,0.2-2μL的反转录酶RTase M-MLV，上述反应体系II在PCR仪中30-50℃下保温0.5-1.5h，70℃喜爱保温10-20min，冰上冷却后，-20℃下保存。

进一步，所述步骤(2)中的PCR扩增包括使用引物CmKAO-BP，例如用LA Taq酶对cDNA进行扩增，所述引物CmKAO-BP为F：5’-GGAAGATCTGATGGAGTTGGGTCCTATCTGCAACG-3，R：5’-GGATCCACGTGTTAGAGAGAAGAAGAGGGACATTTC-3’。

进一步，所述PCR扩增包括如下步骤：

配置1-5μL的PCR缓冲液，0.2-2μL的cDNA，0.2-2μL的上游引物，0.2-2μL的下游引物，0.2-2μL的dNTPs，0.1-0.5μL的LA Taq DNA聚合酶，7-20μL的ddH₂O，混匀离心后，在PCR仪中80-98℃下预变性3-8min，按以下程序进行PCR扩增：80-98℃变性20-60s，60-70℃退火20-60s，70-75℃延伸60-100s，共35个循环，最后70-75℃延伸10min结束反应，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

进一步，所述步骤(2)中的T载体为pMD19-T载体；连接T载体和蓝白斑筛选包括如下步骤：

5-20μL反应体系：纯化的DNA片段，2-10μL，pMD19-T载体，0.2-1μL，16℃连接过夜；将过夜连接产物5-10μL加入30-80μL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上20-40min。30-50℃水浴热激80-120s，冰上2-5min。加入300-700μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃震荡培养60min；吸取200-400μL菌液涂布于LB/Amp(r)/IPTG/X-Gal平板上，37℃培养12-16h，观察菌落生长情况，利用蓝白班初筛转化体；挑取平板上的白色单克隆，分别接种1mL含Amp的LB液体培养基中，25-40℃振荡下培养5-10h。

进一步，所述步骤(2)中的多克隆酶切位点为BglⅡ和PmlI酶切位点；

所述酶切体系为：质粒DNA或载体质粒DNA，5-15μL，BglⅡ，0.5-2μL，PmlI 0.5-2μL，T Buffer，1-4μL，BSA，1-4μL，ddH₂O 2-6μL，37℃酶切2-5h，电泳分析酶切产物；回收目标酶切产物，利用T4连接酶连接；

所述连接体系为：PMD-19T-CmKAO质粒酶切后CmKAO基因片段，2-8μL；pCAMBIA1304载体DNA酶切大片段，2-5μL；T4DNA Ligase，0.2-1μL；T4DNALigase Buffer，0.5-2μL，16℃连接过夜。

进一步，所述步骤(2)中的培养筛选重组子的培养基为含有卡那霉素的LB固体培养基。

进一步，所述步骤(3)中的细胞培养包括如下步骤：

取100-300μL GV3101农杆菌感受态细胞，加入0.5-2μg重组pCAMBIA1304-CmKAO质粒DNA，冰浴30min，之后与液氮中冻3-5min，25-40℃水浴融合3-8min，再加入0.5-2mL YEB培养基，25-30℃震荡3-6h，离心去上清，加入100-300μL YEB液体培养基悬浮细胞，涂布含有利福平和卡那霉素的YEB固体平板上，25-30℃培养2d。

进一步，所述步骤(3)中的培养液为利福平、卡那霉素、2-吗啉乙磺酸和乙酰丁香酮的LB液体培养液；所述侵染液为MgCl₂、2-吗啉乙磺酸、乙酰丁香酮于去离子水组成的液体。

本发明的另外一种木本制备的活体表达方法包括以下步骤：

(1)植物样本的制备

提供植物的RNA样本，加入无RNA活性的DNA酶，消化总RNA中的DNA，测定RNA的完整性和浓度，检测特征吸光度的比值达到要求，得到总RNA样品；使用反转录酶对所述总RNA样品进行反转录得到cDNA，冷冻保存。

(2)干扰载体的构建

以步骤(1)所述的cDNA为模板进行PCR扩增，对CmKAO基因进行克隆；回收目的DNA片段后，连接T载体；通过蓝白斑(α-互补)筛选和菌液PCR鉴定，获得阳性克隆产物；通过序列分析提取含有T载体的CmKAO重组质粒DNA；选取RNAi载体pFGC5941上多克隆位点的酶切位点，对含有T载体的CmKAO重组质粒DNA及载体质粒DNA进行酶切和连接，培养筛选重组子CmKAO-RNAi，通过双切酶检测获得CmKAO-RNAi干扰载体。

(3)农杆菌的侵染转化

选取一定量的根癌农杆菌EHA105中，加入步骤(2)所述的CmKAO-RNAi干扰载体，进行细胞培养，挑取菌落，PCR检测后保存菌种；将菌种在培养基上划线培养，检测OD，用侵染液调节OD值，活化后，用1ml的注射器对活体植物组织进行侵染，毛笔涂抹组织，完成对活体植物的侵染。

(4)植物干扰载体的遗传转化

含有CmKAO-RNAi干扰载体的农杆菌分别侵染突变体组织和野生型组织，侵染后采样提取DNA，以105J为引物进行鉴定，实时荧光定量和半定量PCR检测，完成植物的活体表达。

本发明还包括一种木本植物活体-瞬时转化体系，所述体系采用前述任一项所述的木本植物的活体表达方法建立。

进一步，上述体系中的所述木本植物为板栗雄花序。

本发明的有益效果是：

本发明的木本植物的活体表达方法具有如下优点：

1.活体、直观。本发明技术是直接在母体板栗花序上进行农杆菌侵染，侵染的部位为花序分生组织。转化之后的植物实际上也是嵌合的，包括转基因的花序和未转基因的其它器官，这同病毒介导的基因转化法和毛状根转化法相似。外源基因表达与器官发生直接联系起来，获得转基因表型，因此结果更为直观。

2.操作简单。本发明中没有复杂的抗生素筛选过程，也没有繁琐的不同培养基的更新问题，只在雄花序分生组织上注射和涂抹农杆菌。

3.快速。本发明二十天左右就可以观察到转基因后表型的明显变化，时间短。本发明中依赖专一组织转基因技术的建立对于多年生木本植物转基因，尤其是木本植物生殖器官花、果等发育过程功能基因的研究具有潜在的应用价值。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1为pCAMBIA1304-CmKAO植物表达载体构建图；

图2为CmKAO-RNAi植物干扰载体构建图；

图3A为MT、MT+EV和MT+KAO花序实物照片；

图3B为1304J检测条带(5000marker，第一条带为3968bp，第二条带为2888bp，第三条带为二聚体)；

图3C为MT、MT+EV和MT+KAO荧光定量和半定量检测图；

图4中A为WT、WT+EV和WT+KAO花序；B和C为WT、WT+EV和WT+KAO荧光定量和半定量检测图；

图5为105J检测条带(2000marker，第一条带为1185bp，第二条带为415bp，第三条带为二聚体)；

图6为WT、WT+EV和WT+KAOi花序实物照片；

图7为WT、WT+EV和WT+KAOi荧光定量和半定量检测图。

具体实施方式

本发明分别建立了超表达载体pCAMBIA1304-CmKAO和干扰载体CmKAO-RNAi，在野生和芽变短雄花序的雄花序原基形成期，以农杆菌介导携带有KAO基因载体菌液，分别在雄花序上进行注射和涂抹，建立了板栗花序的瞬时超表达和干扰体系。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

一种木本植物的活体表达方法，包括如下步骤：

(1)雄花序总RNA提取及纯化

板栗遗传转化试验在北京市密云县板栗产区2000年嫁接的板栗树上进行。采样后液氮速冻，于-80℃冰箱保存。雄花序RNA由EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取。并加入RNase-FREE DNaseⅠ消化总RNA中的DNA。通过1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，利用核酸测定仪测定总RNA浓度，并检测OD260/280、OD260/230比值是否符合要求。其余样品暂存于冰盒中用于随后的cDNA合成；或液氮速冻后于-80℃冰箱长期保存。

(2)cDNA的合成

使用Reverse transcriptase M-MLV(RNase H-)对总RNA进行反转录。先配制6μL反应体系：Oligo(dT)18(10μM)，1μL；总RNA，1μg；RNase free dH₂O补足至6μL。PCR仪中70℃反应10min，冰上骤冷3min并短暂离心。再在冰上配制10μL反应体系：上述总RNA(引物变性液)，6μL；5×M-MLV Buffer，2μL；dNTP Mixture(各10mM)，0.5μL；RNase Inhibiter(40U/μL)，0.25μL；RTaseM-MLV(RNase H-，200U/μL)，0.75μL。PCR仪中42℃保温1h，70℃保温15min，之后冰上冷却，-20℃保存。

(3)CmKAO基因的克隆

利用Primer5.0设计带BglII和PmlI酶切位点和保护碱基的引物扩增CmKAO整个开放阅读框。引物为CmKAO-BP，F：5’-GGAAGATCTGATGGAGTTGGGTCCTATCTGCAACG-3，R：5’-GGATCCACGTGTTAGAGAGAAGAAGAGGGACATTTC-3’。利用LA Taq酶，以板栗cDNA为模板进行PCR扩增，20μL的PCR反应体系：10×PCR缓冲液，2μL；cDNA，1μL；上游引物(10mM)，1μL；下游引物(10mM)，1μL；dNTPs(10mM)，0.8μL；LA Taq DNA聚合酶(2U)，0.2μL；ddH₂O 14μL，混匀离心。在PCR仪中94℃预变性5min后，按以下程序进行PCR扩增：94℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35个循环，最后72℃延伸10min结束反应。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

(4)DNA片段回收、T载体连接、转化以及阳性克隆的鉴定

利用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收目的DNA。将目的片段与pMD19-T载体连接，10μL反应体系：纯化的PCR产物，5μL；pMD19-T vector，0.5μL；SolutionI，4.5μL。16℃连接过夜。将过夜连接产物10μL加入50μL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上30min。42℃水浴热激90s，冰上3min。加入500μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃震荡培养60min(180rpm)。吸取300μL菌液涂布于LB/Amp(r)/IPTG/X-Gal平板上，37℃培养12-16h，观察菌落生长情况，利用蓝白班初筛转化体。蓝白斑(α-互补)筛选：挑取平板上的白色单克隆，分别接种1mL含Amp(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡(210rpm)培养5-10小时。菌液PCR鉴定：以菌液为模板，通用引物M13为引物进行PCR扩增，10μL的PCR反应体系：10×PCR缓冲液，1μL；菌液，1μL；上游引物(10mM)，0.5μL；下游引物(10mM)，0.5μL；dNTPs(10mM)，0.4μL；LA Taq DNA聚合酶(2U)，0.1μL；ddH₂O 6.5μL，混匀离心。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸1min30s；共33个循环：最后72℃延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，选出阳性克隆。

利用DNAMAN分析测序结果，并在NCBI中进行同源性分析，挑选出无突变位点的CmKAO菌液，提取重组质粒PMD-19T-CmKAO DNA。

(5)植物表达超载体pCAMBIA1304-CmKAO的构建

选取pCAMBIA1304载体上多克隆位点的BglⅡ和PmlI酶切位点，对PMD-19T-CmKAO质粒DNA及载体质粒DNA进行酶切。20μL酶切体系：质粒DNA或载体质粒DNA，10μL；BglⅡ，1μL；PmlI 1μL；10×T Buffer，2μL；BSA，2μL；ddH₂O 4μL。37℃酶切3h，电泳分析酶切产物。回收目标酶切产物，利用T4连接酶连接。10μL连接体系：PMD-19T-CmKAO质粒酶切后CmKAO基因片段，5μL；pCAMBIA1304载体DNA酶切大片段，3.5μL；T4DNA Ligase，0.5μL；10×T4DNA Ligase Buffer，1μL。16℃连接过夜。用含有50μg·mL^-1卡那霉素的LB固体培养基过夜培养筛选重组子pCAMBIA1304-CmKAO。并利用BglⅡ和PmlI双酶切检测pCAMBIA1304-CmKAO质粒。整个质粒构建过程如附图1所示。

(6)pCAMBIA1304-CmKAO质粒转化农杆菌

取200μLGV3101农杆菌感受态细胞，加入1μg重组pCAMBIA1304-CmKAO质粒DNA，冰浴30min，之后与液氮中冻3-5min，37℃水浴融合5min，再加入1mL YEB培养基，28℃震荡4h，10000rpm离心30s，去上清，加入200μL YEB液体培养基悬浮细胞，涂布含有利福平(50mg/L)和卡那霉素(Kan，50mg/L)的YEB固体平板上，28℃培养2d观察菌落生长情况。挑取菌落，并进行PCR检测。检测后对菌种进行保存。用含有pCAMBIA1304质粒转化农杆菌作为空载体对照。

(7)植物超表达载体pCAMBIA1304-CmKAO遗传转化

将保存的菌种划线于添加利福平(50mg/L)、Kan(50mg/L)的YEB固体培养基平板上，在28℃倒置培养2-3天，待长出单菌落后，挑取单菌落放于附加利福平(50mg/L)、Kan(50mg/L)1mL LB液体培养基中，28℃180rpm振荡培养6h至对数生长期，检测菌液是否有目的片段。换含有利福平(50mg/L)、Kan(50mg/L)、2-吗啉乙磺酸(10mmol/L)和乙酰丁香酮(20μmmol/L)100mLLB液体培养基于250mL的三角瓶内，28℃180rpm振荡12h，检测OD值，当OD值达到0.8时，离心重悬，用侵染液(10mmol/L MgCl₂、10mmol/L 2-吗啉乙磺酸、200μmmol/L乙酰丁香酮于去离子水)调至OD值为1.5，在室温条件下振荡3h进行活化，之后用1mL注射器进行侵染板栗雄花序分生组织，之后用毛笔进行涂抹，参照Fu等(2005)方法。

实施例2

采用实施例1所用的板栗雄花序，与实施例1不同的是步骤(5)构建的是CmKAO-RNAi干扰载体，所述干扰载体的构建如附图2所示。采用RNAi载体pFGC5941替代pCAMBIA1304，构建CmKAO-RNAi干扰载体；步骤(6)中在根癌土壤杆菌EHA105中代替LGV3101农杆菌进行CmKAO-RNAi质粒转化以及后续的板栗雄花序活体侵染。

对比例1

参照实施例1的超载体pCAMBIA1304-CmKAO农杆菌侵染方法，采用含有pCAMBIA1304空载体的农杆菌分别侵染的芽变和野生型花序，作为对比例；以及以侵染缓冲液处理作为空白对照例。

对比例2

参照实施例2的干扰载体CmKAO-RNAi农杆菌侵染方法，采用含有EHA105的农杆菌侵染野生型花序，作为对比例；以及以侵染缓冲液处理作为空白对照例。

其中将含CmKAO超表达载体的农杆菌分别浸染突变体花序和野生花序，其编号分别为Mutant(MT)+KAO和Wild Type(WT)+KAO。将含pCAMBIA1304空载体的农杆菌侵染的芽变和野生型花序分别为MT+EV和WT+EV。以侵染缓冲液处理分别作为芽变和野生型侵染的空白对照MT和WT。

其中将含有CmKAO-RNAi农杆菌侵染的花序编号为WT+KAOi，将含有EHA105的农杆菌侵染的花序为WT+EV，以侵染缓冲液处理作为对照WT。

对于超载体在突变型板栗雄花序中的表达参见附图3。可以看到，在雄蕊原基形成期，对照(MT)和空载体(MT+EV)侵染的花序中上部发生细胞程序性死亡，花序变黄，弯曲，最后枯死脱落，而基部的花序发育正常。而通过CmKAO基因超表达(MT+KAO)的雄花序则没有发生(附图3-A)。对MT，MT+EV和MT+KAO进行取样。通过提取三种样品的DNA，以1304J为引物进行PCR扩增(附图3-B)，说明MT+EV和MT+KAO受到了农杆菌的侵染。对MT，MT+EV和MT+KAO雄花序进行实时荧光定量分析(附图3-C)，结果表明MT+KAO雄花序的KAO相对表达量极显著高于MT和MT+EV，且MT+KAO相对表达量比MT高6倍左右，而MT和MT+EV无显著差异。对三者进行了半定量分析后的结果显示(附图3-C)，MT+KAO的表达量明显高于MT和MT+EV。荧光定量和半定量研究结果一致。以上结果表明，通过农杆菌介导KAO基因瞬时表达，在芽变雄花序中提高了KAO的表达量，且延迟了雄花序的细胞程序性死亡。

对于超表达载体在野生型雄花序中的表达参见附图4。可以看到，在野生雄花序的雄花序原基形成期，对照(WT)、空载体(WT+EV)侵染和野生型超表达(WT+KAO)的雄花序发育正常。附图4-A表明野生型超表达CmKAO(WT+KAO)后，雄花序的长度与WT和WT+EV相比无明显差异。对WT，WT+EV和WT+KAO雄花序进行荧光定量分析(附图4-B)，结果表明WT+KAO雄花序的KAO相对表达量稍高于WT和WT+EV，WT+KAO相对表达量比WT高1.5倍左右，而WT和WT+EV无显著差异。对三者进行了半定量分析后的结果显示(附图4-C)，WT+KAO的表达量高于WT和WT+EV。荧光定量和半定量研究结果较为一致。以上结果表明，通过农杆菌介导KAO瞬时表达，野生雄花序中KAO的表达量高于对照和空载体，但在表型上与对照和空载体雄花序无明显差异。

在雄蕊原基形成期CmKAO-RNAi(WT+KAOi)将干扰载体转化到野生型雄花序中，在雄蕊原基发育期进行检测。对WT，WT+EV和WT+KAOi进行取样。通过提取三种样品的DNA，以1304J为引物进行PCR扩增(附图5)，说明WT+EV和WT+KAOi受到了农杆菌的侵染。进一步观察了雄花序表型变化，结果发现RNA干扰后(WT+KAOi)雄花序长度仅为空载体(WT+EV)和野生型(WT)的一半(附图6所示)。通过实时荧光定量PCR和半定量RT-PCR分析检测RNA干扰后(WT+KAOi)、空载体(WT+EV)和野生型(WT)雄花序中KAO基因的表达，结果表明与空载体(WT+EV)和野生型(WT)相比，野生型干扰后(WT+KAOi)CmKAO基因表达水平显著降低(P<0.01)(附图7所示)。这些结果表明CmKAO基因在快速转化的雄花序中表达水平显著降低。结合雄花序表型变化，证据表明KAO基因对于板栗雄花序的伸长发育是必需的。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照最佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）植物样本的制备

提供植物的RNA样本，加入无RNA活性的DNA酶，消化总RNA中的DNA，测定RNA的完整性和浓度，检测特征吸光度的比值达到要求，得到总RNA样品；使用反转录酶对所述总RNA样品进行反转录得到cDNA，冷冻保存；

（2）超表达载体的构建

以步骤（1）所述的cDNA为模板进行PCR扩增，对CmKAO基因进行克隆；回收目的DNA片段后，连接T载体；通过蓝白斑（α-互补）筛选和菌液PCR鉴定，获得阳性克隆产物；通过序列分析提取含有T载体的CmKAO 重组质粒DNA；选取pCAMBIA1304载体上多克隆位点的酶切位点，对含有T载体的CmKAO重组质粒DNA及载体质粒DNA进行酶切和连接，培养筛选重组子pCAMBIA1304-CmKAO，通过相同的双切酶检测获得pCAMBIA 1304-CmKAO超表达载体；

（3）农杆菌的侵染转化

选取一定量的LGV3101农杆菌感受态细胞，加入步骤（2）所述的pCAMBIA 1304-CmKAO超表达载体，进行细胞培养，挑取菌落，PCR检测后保存菌种；将菌种在培养基上划线培养，检测OD，用侵染液调节OD值，活化后，对活体植物组织进行侵染；

（4）植物超表达载体的遗传转化

将含有步骤（3）所述的CmKAO超表达载体的农杆菌分别侵染突变体组织和野生型组织，侵染后采样提取DNA，以1304J为引物进行鉴定，实时荧光定量和半定量PCR检测，完成植物的活体表达。

2.根据权利要求1所述的木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述步骤（1）中的测定RNA的完整性和浓度为通过1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性以及利用核酸测定仪检测总RNA的浓度；所述特征吸光度比为OD260/280和OD260/230。

3.根据权利要求1所述的木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述步骤（1）中的反转录包括如下步骤：

配置2-20μL反应体系I，其中所述反应体系I包括1-10μL的Oligo(dT)18，1-10μg的总RNA，采用RNase free dH₂O补足溶液总体积，PCR仪中70℃反应5-15min，冰上骤冷3-8min并短暂离心；再在冰上配置2-20μL反应体系II，所述反应体系II包括上述反应体系I 2-20μL，1-6μL缓冲溶液，0.2-2μL dNTP, 0.1-0.5μL RNase inhibiter, 0.2-2μL的反转录酶RTase M-MLV，上述反应体系II在PCR仪中30-50℃下保温0.5-1.5h，70℃保温10-20min，冰上冷却后，-20℃下保存。

4.根据权利要求1所述的木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述步骤（2）中的PCR扩增包括使用引物CmKAO-BP，用LA Taq酶对cDNA进行扩增，所述引物CmKAO-BP为F：5’-GGAAGATCTGATGGAGTTGGGTCCTATCTGCAACG-3，R：5’-GGATCCACGTGTTAGAGAGAAGAAGAGGGACATTTC-3’。

5.根据权利要求4所述的木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述PCR扩增包括如下步骤：

配置1-5μL的PCR缓冲液，0.2-2μL的cDNA，0.2-2μL的上游引物，0.2-2μL的下游引物，0.2-2μL的dNTPs，0.1-0.5μL的LA Taq DNA聚合酶，7-20μL的ddH₂O，混匀离心后，在PCR仪中80-98℃下预变性3-8min，按以下程序进行PCR扩增：80-98℃变性20-60s，60-70℃退火20-60s，70-75℃延伸60-100s，共35个循环，最后70-75℃延伸10 min结束反应，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

6.根据权利要求1所述的木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述步骤（2）中的T载体为pMD19-T 载体；连接T载体和蓝白斑筛选包括如下步骤：

5-20μL反应体系：纯化的DNA片段，2-10 μL，pMD19-T 载体，0.2-1 μL，16℃连接过夜；将过夜连接产物5-10 μL加入30-80 μL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上20-40 min；30-50℃水浴热激80-120s，冰上2-5 min；加入300-700 μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃震荡培养60min；吸取200-400 μL菌液涂布于LB/Amp(r)/IPTG/X-Gal平板上，37℃培养12-16h，观察菌落生长情况，利用蓝白班初筛转化体；挑取平板上的白色单克隆，分别接种1mL含Amp的LB液体培养基中，25-40 ℃振荡下培养5-10 h。

7.根据权利要求1所述的木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述步骤（2）中的多克隆酶切位点为BglⅡ和PmlI酶切位点；

所述酶切体系为：质粒DNA或载体质粒DNA，5-15 μL，BglⅡ，0.5-2 μL，PmlI 0.5-2 μL，T Buffer，1-4 μL，BSA，1-4 μL，ddH₂O 2- 6 μL，37℃酶切2-5 h，电泳分析酶切产物；回收目标酶切产物，利用T4连接酶连接；

所述连接体系为：PMD-19T-CmKAO质粒酶切后CmKAO基因片段，2-8 μL；pCAMBIA1304载体DNA酶切大片段，2-5 μL；T4 DNA Ligase，0.2-1 μL；T4 DNA Ligase Buffer，0.5-2 μL，16℃连接过夜。

8.根据权利要求1所述的木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述步骤（3）中的细胞培养包括如下步骤：

取100-300μL GV3101农杆菌感受态细胞，加入0.5-2 μg重组pCAMBIA1304-CmKAO质粒DNA，冰浴30min，之后与液氮中冻3-5min，25-40℃水浴融合3-8 min，再加入0.5-2 mL YEB培养基，25-30℃震荡3-6 h，离心去上清，加入100-300 μL YEB液体培养基悬浮细胞，涂布含有利福平和卡那霉素的YEB固体平板上，25-30℃培养2d。

9.一种木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）植物样本的制备

提供植物的RNA样本，加入无RNA活性的DNA酶，消化总RNA中的DNA，测定RNA的完整性和浓度，检测特征吸光度的比值达到要求，得到总RNA样品；使用反转录酶对所述总RNA样品进行反转录得到cDNA，冷冻保存；

（2）干扰载体的构建

以步骤（1）所述的cDNA为模板进行PCR扩增，对CmKAO基因进行克隆；回收目的DNA片段后，连接T载体；通过蓝白斑（α-互补）筛选和菌液PCR鉴定，获得阳性克隆产物；通过序列分析提取含有T载体的CmKAO 重组质粒DNA；选取RNAi载体pfgc5941上多克隆位点的酶切位点，对含有T载体的CmKAO重组质粒DNA及载体质粒DNA进行酶切和连接，培养筛选重组子CmKAO-RNAi，通过双切酶检测获得CmKAO-RNAi干扰载体；

（3）根癌土壤杆菌的侵染转化

选取一定量的根癌农杆菌EHA105中，加入步骤（2）所述的CmKAO-RNAi干扰载体，进行细胞培养，挑取菌落，PCR检测后保存菌种；将菌种在培养基上划线培养，检测OD，用侵染液调节OD值，活化后，对活体植物组织进行侵染；

（4）植物干扰载体的遗传转化

将含有步骤（3）所述的CmKAO-RNAi干扰载体的农杆菌分别侵染突变体组织和野生型组织，侵染后采样提取DNA，以105J为引物进行鉴定，实时荧光定量和半定量PCR检测，完成植物的活体表达。

10.一种木本植物活体-瞬时转化体系，所述体系采用前述任一项所述的木本植物的活体表达方法建立。