CN102432679B - 水稻类伸展蛋白OsPEX1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开水稻类伸展蛋白OsPEX1及其应用。本发明利用水稻Ac/Ds突变体库分离克隆水稻类伸展蛋白基因OsPEX1，通过互补试验和株高测定试验证明基因OsPEX1具有调控水稻株高的功能。本发明克隆的基因OsPEX1属于类伸展蛋白基因家族，该基因家族在植物生长发育中具有重要作用，其功能众多，除了促进细胞生长外，还影响营养生长、形态发生、授粉受精等，而本发明克隆的OsPEX1基因具有调节水稻株高的能力，在利用基因工程技术有目的的调控水稻株高等方面具有重要的应用价值。

Description

水稻类伸展蛋白OsPEX1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻类伸展蛋白OsPEX1及其应用。本发明利用Ds转座子标签技术，通过正向遗传学方法，从水稻Ds插入突变体库中得到了一个控制水稻株高的基因OsPEX1，并通过转基因互补试验证明了OsPEX1基因的功能；本发明还涉及利用该基因或其功能类似基因来培育株高降低的水稻的方法。本发明的水稻类伸展蛋白基因OsPEX1与水稻植株矮化相关，对丰富水稻矮源具有重要意义。 

背景技术

类伸展蛋白(Extensin-like protein)基因家族是近几年鉴定的一类新的基因家族，它们编码的蛋白存在于多种植物的细胞壁中并可能在细胞壁形成过程中起调节作用，因其编码的蛋白含有1个富含亮氨酸的重复序列(LRR)和1个伸展蛋白结构域，这个家族又称为LRX家族(Leucine-Rich Repeats/Extensins)(Rubinstein A L，Broadwater A H，Lowrey K B，et al.Pex1，a pollen-specific gene with an extensin-like domain.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(8)：3086-3090；Baumberger N，Ringli C，Keller B.The chimeric leucine-rich repeat/extensin cell wall protein LRX1 is required forroot hair morphogenesis in Arabidopsis thaliana.Genes Dev，2001，15(9)：1128-1139.)。在结构上，LRR结构域高度保守，而伸展蛋白结构域在长度和氨基酸序列组成方面都是高度可变的。 

植物类伸展蛋白具有LRR结构域和伸展蛋白结构域，可能参与蛋白之间的相互作用或细胞相互作用的信号分子。在植物中，LRRs蛋白经常参与蛋白之间的相互作用。例如，信号转导，病原体识别和防御，酶抑制剂等。对拟南芥的研究也支持LRX蛋白家族的LRR结构域参与蛋白质相互作用的观点。伸展蛋白结构域是大部分细胞壁结构蛋白所具有的结构域，其中羟脯氨酸和色氨酸残基常被半乳糖或阿拉伯糖糖基化，属于富含羟脯氨酸糖蛋白家族(HRGPs)(Cassab  G I.Plant cell wall proteins.Annu Rev Plant Physio Plant Mol Biol，1998，49(1)：281)。在动物中，只有胶原质和弹性蛋白属于这个家族，它们在结构和发育中起着重要的作用。在植物中，它们可能作为结构蛋白或细胞相互作用的信号分子。对番茄的研究表明，类伸展蛋白LePEX1可能是信号分子的受体(Ringli C.The role of extracellular LRR-extensin(LRX)proteins in cell wall formation.Plant Biosyst，2005，139(1)：32-35)。鉴于LRX蛋白家族的保守作用，其他蛋白应该也有相似的功能，但有待于证明。 

根据系统发生关系和表达状况可以将LRX基因分为2类：在营养组织中特异表达的基因，通常用LRX表示；在繁殖器官中特异表达的基因，通常用PEX(Pollen extension-like)表示(鲁朝霞，苏磊，单雷，等.拟南芥LRR-Extensin蛋白家族的研究.安徽农业科学，2006，34(23)：6148-6150)。LRX蛋白的功能众多，除了促进细胞生长外，还影响营养生长、形态发生、授粉受精等，随细胞基质不同具有不同的功能，并表现出高度的组织、器官和细胞特异性。 

LRX蛋白同源比对表明，水稻类伸展蛋白有8个，第1染色体有2个，第2、5、6、7、11、12染色体各有1个(Baumberger N，Doesseger B，Guyot R，et al.Whole-genome comparison of leucine-rich repeat extensins in Arabidopsis and rice.A conserved family of cell wall proteins form a vegetative and a reproductive clade.Plant Physiol，2003，131(3)：1313-1326)。但是，水稻不同LRX基因的时空表达特性及确切的生物学功能尚不清楚。 

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是单子叶植物基因组研究的模式植物。鉴定和克隆重要农艺性状的基因对改良水稻的生产性能和品质具有重要意义。株高是水稻株型建成重要的农艺性状之一，直接影响水稻品种的丰产潜力和抗倒性能。目前，获得的矮秆和半矮秆基因已有70余个，其中有55个以d命名的矮秆基因及少数半矮秆基因；半矮秆基因以sd命名，目前已报导的有15个；其中30多个基因所在的染色体已被确定，用分子标记定位的水稻矮生基因有14个，其中部分基因已被克隆(于永红，斯华敏.水稻矮化相关基因的研究进展.植物遗传资源学报，2005，6(03)：344-347)。 

目前克隆的矮秆基因多属赤霉素(GA)信号传导途径或油菜素类固醇(BR)途 径，而植物激素与水稻株高的生理生化研究表明，除赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)外，其它激素例如，生长素(IAA)脱落酸(ABA)和乙烯均影响水稻茎的伸长(高奋明，姜勇，孔德伟，等.水稻株高的遗传控制及其在育种上的应用.分子植物育种，2005，3(1)：87-93)。要全面了解矮化作用机理，需要鉴定和克隆更多的矮秆基因。 

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种水稻类伸展蛋白OsPEX1。 

本发明的又一目的是提供上述水稻类伸展蛋白OsPEX1的应用。 

本发明的目的通过以下技术方案实现： 

水稻突变体是研究水稻基因功能的理想材料。本发明利用已有的水稻Ds插入突变体库筛选到一个矮杆突变体，所述突变体库的创建详见文献：刘芳，张向前，张泽民，等.水稻Ac/Ds系统的Ds转座行为.科学通报，2007，52(14)：1649-1655。Ds转座检测表明Ds转座与突变表型共分离。通过TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)(参见Liu Y G，Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insertend fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.Genomics，1995，25(3)：674-681)获得Ds旁邻的水稻DNA序列，生物信息学分析旁邻序列，确定该突变体候选基因位于水稻第11染色体，属于类伸展蛋白基因家族的PEX亚家族，命名为OsPEX1(Pollen extension-like)，目前尚没有关于该基因功能方面的研究。 

基于上述说明，本发明提供一种水稻类伸展蛋白OsPEX1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有控制株高功能的类似物。 

上述水稻类伸展蛋白OsPEX1由水稻类伸展蛋白基因OsPEX1编码，该基因为下列A、B、C三种核苷酸序列之一： 

A序列表SEQ ID：1所示的DNA序列； 

B编码与A编码蛋白质相同的蛋白质的DNA序列； 

C以上A和B通过碱基插入、缺失或替换而获得的仍具有控制株高功能的类似物。 

含有上述水稻株高相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。 

上述水稻类伸展蛋白OsPEX1的应用，是将编码该蛋白质的OsPEX1基因用于培育株高降低的水稻，方法是将含有OsPEX1基因的重组表达载体导入植物细胞，获得株高降低的转基因水稻；也可利用上述株高降低的转基因水稻作为供体亲本，通过回交选育法改良水稻株高，即通过将所获得的株高降低的水稻与拟改良的高杆水稻品种(轮回亲本)杂交，然后杂交后代经多次与轮回亲本杂交以选育株高降低的水稻。 

所述含有OsPEX1基因的重组表达载体可用现有的植物表达载体构建；所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCUbi1390等；含有OsPEX1基因的重组表达载体可通过基因枪、显微注射、原生质体介导、花粉管通道、农杆菌介导等各种物理、化学及生物学方法导入到宿主植物细胞或组织中；所述宿主植物包括但不限于水稻、小麦、玉米、高粱、谷子、甘蔗、棉花、番茄、苜蓿和象草；被导入的宿主植物优选为水稻。 

在构建含有OsPEX1基因的重组表达载体时，在OsPEX1基因的转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异性或诱导型启动子，如35S启动子、Ubi启动子等。 

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行改造后再使用，包括加入GUS、GFP等报告基因、抗生素抗性基因或其它抗化学试剂标记基因等。 

本发明通过Ds转座子标签技术首次从水稻突变体库分离克隆了OsPEX1基因，该基因编码一个水稻类伸展蛋白。突变体表型分析及互补分析表明OsPEX1基因在控制水稻株高方面起重要作用。另一方面，对该基因的研究有助于人们了解水稻生长发育的分子机制，利用现代基因工程方法，设计育种，对提高谷物产量具有重要作用。同时，利用该基因的功能特性，在水稻中进行分子设计 育种，选育适宜的水稻株高的品种具有很强的可操作性。 

本发明的突变体株高明显变矮，突变基因OsPEX1的克隆和功能分析有助于进一步理解水稻株高调控的分子遗传学机制。 

附图说明

图1为水稻OsPEX1突变体的表型。左图为野生型中花11，中图为突变杂合体；右图为突变体纯合体。 

图2为Ds转座与突变体的表型共分离的分子检测。M：100bp DNA ladder；1，6为转座纯合体；2，3，5为转座杂合体；4，7，8为Ds供体(Ds-T-DNA)。 

图3为水稻OsPEX1基因结构及Ds插入位点。 

表示Ds转座子，5′和3′分别表示Ds转座子的5′末端和3′末端。 

图4为水稻OsPEX1突变体Ds插入位点的基因型检测。 

图5为OsPEX1基因的表达分析图。 

图6为水稻OsPEX1基因过量表达载体示意图。 

图7为水稻OsPEX1基因过量表达转基因植株表型。 

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 

实施例1OsPEX1基因的分离克隆 

1.OsPEX1突变体的获得 

通过水稻Ds-T-DNA转化纯合体和Ac-T-DNA转化纯合体的杂交，构建了水稻的转座子插入突变体库，详见文献：刘芳，张向前，张泽民，等.水稻Ac/Ds系统的Ds转座行为.科学通报，2007，52(14)：1649-1655。利用上述材料，筛选Ds转座突变体，发现编号为D260的株系，其株高明显发生分离，见水稻OsPEX1突变体抽穗期及同期播种的野生型中花11的表型，如图1所示。其中野生型植株23株，株高87.1±2.3cm；半矮秆类型37株，株高61.4±3.8cm，较野生型矮约25 cm；矮秆类型20株，株高46.4±3.1cm，平均株高降低40.7cm，表型变异率46.7％。t测验结果表明，野生型、半矮秆与矮秆植株株高差异达极显著水准。卡方测验表明，株高分离比符合1∶2∶1(23∶37∶20；χ²＝0.68＜χ² _0.05，2＝5.99)，即该突变为不完全显性突变。为验证突变体的遗传特性，分别种植野生型、矮秆、半矮秆各2个株系。T₁代的2个野生型单株种植后，在T₂代全部表现为野生型。来自2个矮秆突变体单株的后代均为矮秆，而2个半矮秆株系发生了野生型、半矮秆与矮秆的分离，两株系共418株，其分离比符合1∶2∶1(114∶199∶105；χ²＝1.34＜χ² _0.05，2＝5.99)。以上结果表明突变体OsPEX1为不完全显性突变。 

2.分离OsPEX1突变体Ds插入位点旁邻序列 

采用TAIL-PCR方法扩增Ds转座子侧翼序列。左右边界的特异引物依据Ds转座子DNA序列，参照Kolesnik等(Kolesnik T，Szeverenyi L，Bachmann D，et al.Establishing an efficient Ac/Ds tagging system in rice：Large-scale analysis of Ds flanking sequence.Plant J，2004，37：301-314)的方法，采用Primer Premier5程序设计。随机简并引物及反应条件参照Liu等的方法进行，详见文献：Liu Y G，Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insertend fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.Genomics，1995，25(3)：674-681，特异扩增得到的第三轮PCR产物用于测序。反应所用引物见表1，特异扩增得到的第3轮PCR产物用来测序。本实施例的DNA合成、测序服务由北京奥科鼎盛生物科技有限公司提供。 

表1TAIL-PCR所用引物 

注：DsR-Primer表示Ds元件3′末端和，AD Primer表示熔解温度较低的随机简并引物。 

利用TAIL-PCR扩增Ds 3′末端旁邻序列，特异扩增的第三轮PCR产物用于测 序，有效测序长度674bp。BLAST比对结果显示，Ds旁邻序列与水稻第11染色体的PAC克隆P0485F09(GenBank Acc No.AC120888)相应序列具有高度的一致性。进一步分析表明，Ds插入位点对应于水稻基因组注释网站上的一个基因(登录号：LOC Os11g43640)，该突变体候选基因属于类伸展蛋白(Extensin-like protein)基因家族的PEX(Pollen extension-like)亚家族，命名为OsPEX1。该水稻OsPEX1基因全长2882bp，有2个外显子和1个内含子组成，其核苷酸序列为序列表SEQ NO：1所示的DNA序列；Ds插入在水稻OsPEX1基因的表达调控区，距OsPEX1基因3123bp，见图3。 

利用TAIL-PCR方法扩增得到的OsPEX1突变体Ds转座子插入位点侧翼序列如下： 

1    TGAGGTATTT TACCGACCGT TACCGACCGT TTTCATCCCTAACTAGGCAG TAGGCACATC 

61   AACACACATA TCAAGAAAGG AAAACCATGG TGTAATTTAATAGAATTTGA TATTCTTCCC 

121  AAATCATGCA GAACATGAAC AAGCATGTAC AGTTCCCATGTGGAAAGGCT AGGAGATTTT 

181  CACAATTGTT GGCACAAACA GGTTAGCTGG ACAGATAGTACAAGCATATG TTTCTGTTTT 

241  CCAGTGCTTA GGACAAAACA CAAACCCTGC CTGTTGGTAGCCGGTATCAA AGGATATCTG 

301  GAACAGGGAA GGCAAGAGTT CATGGATGGA TCTGTCATCATACCATGTTT GCTGGAAGTA 

361  ACGACCAGCG CAGGACGGAT CACACACTCA TCCATAGATCCTTCAACTTC ATTCCATCAG 

421  CGTTTTCCAA AATTCACTGC ACTACAACAT AGGGCGACCCAGCAGGTTGT ATTCCGGATG 

481  CCTCTCAAGG CCAACGGTAG TGCAACGAAT GCTCACTACATGAGTCTGCA TATATAGTTA 

541  GGCAAGAAGC ATCGTTCGTG TATTATATTA TACATGAATGTGATGATCTT GCTCATCTGT 

601  ACATTTGGCT GTTGCTTTGT TTATTTTCTT GAGCGTGGAATACTTCATTG GTTGCTCTCT 

661  GCTCCCCCGC CATA 

3.OsPEX1基因突变导致突变体表型分析 

为了证实突变体表型是由于OsPEX1内的Ds插入引起的，对突变体及其后代分离群体做了Ds转座的PCR检测，检测结果如图2所示。Ds转座的PCR检测参照刘芳等人的方法(刘芳，张向前，张泽民，等.水稻Ac/Ds系统的Ds转座行为.科学通报，2007，52(14)：1649-1655)。Ds转座的PCR检测的具体步骤为： 

(1)利用引物P10(5′-TCCCGTCCGATTTCGACTTTA-3′)、Tra4(5′-TAGCTCACTCATTAGGCACCC-3′)和 

P5(5′-AAGCTCAAGCTGCTCTAGCATTCG-3′)同时扩增。如果Ds未发生切离，称为满载供体位点(full donor site，FDS)，通过引物P10和P5可以扩增出约400bp的特异带(见图2，对应泳道4、7和8)；如果Ds从T-DNA上切离，称为空载供体位点(empty donor site，EDS)，引物Tra4和P5可以扩增出约870bp的特异带(见图2，对应泳道1和6)；如果既存在EDS又存在FDS，则利用3条引物可以同时扩增出两条特异带(见图2，对应泳道2、3和5)。 

(2)应用TPS法提取水稻基因组DNA作为模板，用(1)中引物进行PCR扩增。首先采用简易的TPS法提取水稻基因组DNA，步骤如下：(1)取3cm长的水稻叶片放入1.5μl离心管中，放入液氮，研碎，加TPS抽提液900μl，75℃水浴50分钟；(2)12000rpm，离心10分钟；(3)吸上清约500μl转入1.5μl离心管；(4)加入等体积异丙醇，放置，于12000rpm离心10分钟；(5)弃上清，干燥沉淀，加100μl灭菌水，4℃放置待用。其中，TPS抽提液组分为：100mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)，10Mm EDTA(pH＝8.0)，1M KCL。 

然后进行PCR扩增反应，配制PCR反应体系为20μl，具体包含：0.2μmol/L的引物，200μmol/L dNTP，1×PCR缓冲液(含有50mmol/L KCl，10mmol/L pH＝8.3的Tris-HCl缓冲液，1.5mmol/L MgCl₂，0.01％明胶)，1U的Taq酶，以上提取的水 稻基因组DNA 2μl。PCR反应程序设置如下：94℃预变性5min，循环(94℃/1min，55℃/1min，72℃/1.5min)35次，72℃延伸5min后，得到PCR扩增产物。 

(3)利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据带型判定各个单株基因型。对T₁代的检测表明，Ds未转座类型(EDS^-FDS⁺)23株，Ds转座杂合类型(EDS⁺FDS⁺)37株，Ds转座纯合类型(EDS⁺FDS^-)20株，三者之间的比率符合1∶2∶1(见表2)。进一步分析表明，T₁代中Ds未转座类型均为野生型植株，而Ds转座类型均为突变体植株。在T₂代的2个分离群体中，共检测418株，114株野生型植株均为Ds未转座类型；304株突变体植株中Ds转座纯合类型105株，均为矮秆突变类型，其余为Ds转座杂合类型，三者之间的比率同样符合1∶2∶1。T₃代的Ds转座检测也表明突变体表型与Ds转座之间的对应关系(见表2)。根据上述结果可以认为，该突变体的产生是由于转座的Ds插入所引起的。 

表2突变性状与Ds共分离实验数据表 

χ² _0.05，2＝5.99 

为了进一步证实Ds插入与突变表型的关系，检测Ds插入位点的基因型。为此，利用TAIL-PCR获得Ds插入位点后，设计了3条引物对Ds插入位点的基因型进行检测。具体步骤为： 

(1)依据Ds5′序列和Ds旁邻的水稻基因组序列，设计3条引物。其中一对引物LDs-L(5′-CACCATGGTTTTCCTTTCTTG-3′)和LDs-R(5′-GGATTCCAGATGCCTCACAT-3′)，它们的结合位点分别是转座子两侧的水稻基因组序列，可以扩增出295bp的特异带。另外在Ds转座子内部靠近末端处设计一条引物Ds5′-1a(5′-ACGGTCGGGAAACTAGCTCTAC-3′)，使其与引物LDs-R配对，可以扩增出426bp的特异带。引物合成服务由北京奥科鼎盛生物科技有限公司提供。 

(2)应用TPS法提取水稻基因组DNA作为模板，建立上述3个引物的PCR反应体系，即用(1)中引物进行PCR扩增反应。其中，TPS法提取水稻基因组DNA的操作过程与Ds转座的PCR检测中的步骤(2)的相应内容相同。获得水稻基因组DNA后，配制PCR扩增反应体系20μl，具体包含：0.2μmol/L的引物，200μmol/L dNTP，1×PCR缓冲液(含有50mmol/L KCl，10mmol/L pH＝8.3的Tris-HCl缓冲液，1.5mmol/L MgCl₂，0.01％明胶)，50ng的模板DNA，即TPS法提取的水稻基因组DNA，1U的Taq酶。PCR扩增反应所用的程序为：94℃预变性5min，循环(94℃1min，55℃1min，72℃1min)30次，72℃延伸5min，得到PCR扩增产物。 

(3)利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据带型判定各个单株基因型。 

结果表明，检测植株存在3种基因型，如图4所示，为Ds插入位点的基因型检测图；表明半矮秆突变类型植株能同时扩增出约295bp和约426bp的两条特异带，这些植株的一条染色体发生了Ds插入，但同时又保留了一个相应的野生型位点(见图4中的泳道1，4-6)；矮秆突变体只能扩增出约426bp的特异带(见图4的泳道2)，为Ds插入纯合类型植株，这些植株2条染色体均有Ds插入；野生型植株只能扩增出约295bp的特异带(见图4的泳道3)，这些植株的Ds仍然在T-DNA上，未发生转座。在T₂代的2个分离群体中，共检测418株，其中杂合型(Ds⁺Ds^-)199株，纯合型105(Ds⁺Ds⁺)株，无Ds(Ds^-Ds^-)插入的114株。对T₂代综合分析表明，无Ds插入的植株均为野生型；而杂合体与纯合体植株显著矮化。对T³代的分析表明，在所有被调查的586株中，野生型植株基因型检测表明均无Ds插入，共154株；而突变型植株中Ds插入杂合植株302株，Ds插入纯合植株130。三者之间的分离比符合1∶2∶1(表2)，其遗传行为符合1对基因的分离模式。进一步证实该突变表型与Ds插入共分离，其突变表型由Ds插入产生。 

通过以上Ds插入位点的基因型分析，进一步证实Ds插入与突变表型共分离关系，而且可获得突变后代中Ds插入突变纯合体，有利于解析被Ds插入基因的功能。 

实施例2OsPEX1基因的过量表达导致突变体表型 

1OsPEX1基因的表达分析 

生物信息学分析表明，Ds插入在OsPEX1基因的表达调控区，推测这可能造成目的基因表达的上调或下调。为此，检测了水稻野生型中花11、突变杂合体、突变纯合体中OsPEX1基因的表达情况。三叶期提取中花11、突变杂合体、突变纯合体叶片总RNA，样品总RNA提取及RT-PCR具体操作程序如下： 

1.1植株总RNA的抽提 

(1)取0.12g叶片放入1.5ml离心管中，加入液氮，研碎； 

(2)加TRIZOL 1000μl，摇匀，室温放置10分钟； 

(3)加200μl氯仿，剧烈振荡15秒； 

(4)13000rpm，离心10分钟，4℃； 

(3)吸上清约500μd转入1.5ml离心管； 

(5)加入等体积异丙醇，放置10min，12000rpm离心10min； 

(6)弃上清，干燥沉淀； 

(7)70％酒精洗涤沉淀； 

(8)离心干燥； 

(9)40μl DEPC处理的灭菌水溶解，-20℃放置待用。 

注：RNA提取用TRIZOL试剂购自TIANGEN公司。 

1.2目标基因的RT-PCR检测 

反转录采用SuperScriptIII反转录酶，具体操作步骤如下：

(1)DEPC处理的灭菌水             6μl 

(2)1.1中抽提的总RNA             5μl 

(3)10×Dnase I Buffer           1μl 

(4)Dnase I                      1μl 

(5)37℃                         15min 

(6)加入25m MEDTA                1μl 

(7)65℃                         15min 

(8)加入10pmol 9random primer    2μl 

(9)70℃                                     10min 

(10)加入5×RT Buffer                        4μl 

(11)加入dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)(10mM)      1μl 

(12)42℃                                    1min 

(13)加入SuperScriptIII逆转录酶(200U/μl)    1μl 

(14)42℃                                    1hour 

(15)70℃                                    15min 

注：反转录所用试剂均购自Invitrogenc公司 

检测基因转录的PCR特异引物为PEXRTF(TTCCCCAGAAAAGTCACCAC)和PEXRTR(GGGGACTTCTCTTTCCTCGT)，预期扩增长度451bp。每管加入18uL反应液(含有2μl 10×PCR Buffer，100μM dNTPs，300pM PCR特异引物，1U Taq酶，加灭菌水到18μl)，再加入cDNA第一链反应产物2μl，轻轻混匀并离心收集；进行PCR循环反应94℃/5min-(94℃/1min-55℃/1min-72℃/1min)30个循环，72℃延伸5min；反应结束后取8μl在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检查cDNA扩增结果，以水稻Actin1基因作为内对照。 

检测结果见图5，表明OsPEX1基因的表达在三者中由低到高依次为野生型中花11、突变杂合体、突变纯合体。但是三者的株高(图1)却呈现相反的趋势，这表明OsPEX1基因对水稻株高起负向调控作用。 

2功能互补试验 

为了进一步证实OsPEX1基因的过量表达对水稻株高的调控作用，构建过量表达质粒Ubi::OsPEX1，通过农杆菌介导的方法转化到中花11植株中，观察和分析植株表型的变化。涉及如下步骤： 

(1)PCR扩增出OsPEX1的全长开放阅读框(ORF)，与质粒pCUbi1390连接，构建过量表达质粒Ubi::OsPEX1；过量表达质粒Ubi::OsPEX1转化大肠杆菌DH5α，通过菌落PCR、酶切鉴定转化子，并测序验证后，再制备得到过量表达质粒Ubi::OsPEX1。 

(2)将构建的过量表达质粒Ubi::OsPEX1通过农杆菌(EHA105)介导，转 化水稻品种中花11，PCR检测转基因阳性植株；观察和分析植株表型的变化。 

具体实验过程如下： 

2.1目的基因过量表达质粒Ubi::OsPEX1的构建 

根据OsPEX1基因的序列，针对pCUbi1390质粒的多克隆位点，设计1对引物(含BamHI和SpeI酶切位点)： 

上游引物PEX1BF(下划线为BamHI酶切位点) 

5′-GGATCCATGGACCTCCGGCTCCTCCT-3′， 

下游引物PEX2841SR(下划线为SpeI酶切位点) 

5′-ACTAGTTCAGATGGTGGGGATGAGCT-3′。 

利用上游引物PEX1BF和下游引物PEX2841SR对OsPEX1基因进行扩增，将获得的PCR产物进行回收纯化后，克隆到pMD19-T载体上，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，筛选出含阳性克隆质粒pMD19-T-OsPEX1的阳性菌，送英俊公司进行基因序列测定，确定获得含双酶切位点OsPEX1基因。 

将OsPEX1基因从pMD19-T-OsPEX1克隆质粒上用BamHI和SpeI限制性内切酶切下后得到的双酶切后的OsPEX1基因DNA片段，重新连接到相同两种内切酶双切后表达载体pCUbi1390上，得到重组质粒pCUbi1390-OsPEX1，并将重组质粒pCUbi1390-OsPEX1转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。OsPEX1基因和双酶切后的表达载体pCUbi1390的连接用DNA Ligation Kit Ver.2.0试剂盒。 

上述过程的具体操作步骤为：1)将上述双酶切后的表达载体pCUbi1390与双酶切后的OsPEX1基因DNA片段混合和制备成体积为10μL的DNA溶液(双酶切后的表达载体pCUbi1390与双酶切后的OsPEX1基因DNA片段的摩尔数比为：0.1pmol∶0.3pmol)；2)向上述DNA溶液中加入等体积的SolutionI(DNA Ligation Kit Ver.2.0试剂盒自带)，充分混匀；3)16℃反应过夜；4)反应液直接加入细菌转化，即将20μL的反应液加入到100μL的感受态细胞中，42℃热激法转化(参照《分子克隆实验指南》(第三版)(中译版)黄培堂等译，科学出版社，2002年9月出版)。挑选阳性克隆菌落，并通过PCR技术进行阳性克隆的初步鉴定，再提取阳性克隆的质粒进行双酶切鉴定，确定重组质粒 pCUbi1390-OsPEX1构建成功。 

pMD19-T载体和DNA Ligation Kit Ver.2.0试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，质粒提取试剂盒购自北京TIANGEN公司。植物表达载体pCUbi1390为常规试剂，含潮霉素抗性基因Hyg、启动外源基因表达的Ubiquitin启动子和胭脂碱合成酶基因的终止子。 

2.2遗传转化 

将上述构建成功的重组质粒pCUbi1390-OsPEX1转化农杆菌EHA105。具体步骤如下：取1μg左右的重组质粒pCUbi1390-OsPEX1加入到100ml EHA105感受态细胞(自制，参照《分子克隆实验指南》(第三版)(中译版)黄培堂等译，科学出版社，2002年9月出版)中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min。再在42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800ml YM液体培养基(pH＝7.0，含KH₂PO₄ 0.5g/L，NaCl 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，甘露醇(Mannitol)10g/L，L-谷氨酰胺(L-Glutamine)2g/L，酵母膏(Yeast extract)0.3g/L，琼脂(Agar)15g/L)28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml卡那霉素(Kanamycin)的YM平板上。28℃培养至到形成单菌落。通过PCR技术进行阳性克隆的鉴定，挑选阳性克隆菌落，接种于YM液体培养基(同上)，-80℃保存，即得含重组质粒pCUbi1390-OsPEX1的农杆菌EHA105菌种，备用。 

将含重组质粒pCUbi1390-OsPEX1的农杆菌EHA105菌种转化到中花11的愈伤，经过预培养、浸染、共培养，筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽到大田得到转基因植株。按照相同的遗传转化方法，将空载体转到中花11的愈伤，得到的转基因植株作为阴性对照。 

具体步骤如下： 

1、将水稻种子去壳，消毒后接种于NB培养基，25℃暗培养4d，将幼胚长出芽去掉后，再次将幼胚接种于新鲜的NB培养基，暗培养4d，25℃。以愈伤组织为转化材料，将愈伤组织预培养于NB培养基4d，25℃，暗培养。NB培养基为水稻愈伤组织诱导与继代培养基，配方为：pH＝5.8，N₆大量元素，2，4-D 2mg/L，L-谷氨酰胺(L-Glutamine)500mg/L，B₅微量元素，酶解酪蛋白300mg/l，蔗糖30g/L，B₅维生素，脯氨酸(L-proline)500mg/l，琼脂(Agar)8g/L。 

2、将含重组质粒pCUbi1390-OsPEX1的农杆菌EHA105菌种(保存于-80℃)，先划平板活化之，再取该平板长出的菌涂布于新鲜的平板，28℃暗培养2d，收集农杆菌悬浮于MBAS农杆菌悬浮培养基，利用恒温摇床(28℃，100rpm)振荡培养至OD₆₀₀约0.6，用于转化。MBAS农杆菌悬浮培养基配方为：MS大量元素，2，4-D 2mg/l，蔗糖30g/L，B₅微量，酶解酪蛋白500mg/l，乙酰丁香酮(AS)100μmol/L，B₅有机，肌醇2g/L，pH＝5.2。 

3、将上述步骤1预培养后的植物材料浸入步骤2所获得农杆菌菌液15min，之后弃菌液，将材料放在无菌滤纸上吸干表面水分。 

4、在MBAS共培养基平板表面放一张无菌滤纸，将吸干水份的材料置于无菌滤纸上，(每皿培养基可以放40块2mm大小的材料)半敞开皿盖，在超净工作台内吹约30min，之后封皿，25℃暗培养3d。MBAS共培养基的配方是在MBAS农杆菌悬浮培养基配方基础上再加入琼脂(Agar)8g/L。 

5、将材料转至NBCCH筛选培养基，25℃暗培养15d。 

6、材料继代于NBCCH筛选培养基，25℃暗培养15d。5、6中的NBCCH筛选培养基一致，配方为：NB培养基(同1中的NB培养基)，羧苄青霉素(Carbenicilline)250mg/L，头孢菌素(Cefazollin)250mg/L，潮霉素(Hm)50mg/L。 

7、挑取色泽新鲜的愈伤组织接种于PRCCH预分化培养基，25℃，12h/d，光照约12d，得到乳白色或带绿点的结节状抗性愈伤。PRCCH预分化培养基配方为：pH＝5.8，N₆基本成分，脯氨酸(L-proline)500mg/L，羧苄青霉素(Carbenicilline)250mg/L，脱落酸(ABA)5mg/L，L-谷氨酰胺(L-Glutamine)500mg/l，头孢菌素(Cefazollin)250mg/L，6-苄氨基嘌呤(6-BA)6mg/L，蔗糖30g/L，潮霉素B(Hygromycin B)50mg/L，萘乙酸(NAA)2mg/L，琼脂(Agar)8g/L。 

8、将步骤7所获得的乳白色或带绿点的结节状抗性愈伤接入RCCH分化培养基，25℃，12h/d，光照约12d，得到抗性的绿色小芽。RCCH分化培养基：N₆大量，6-苄氨基嘌呤(6-BA)3mg/L，萘乙酸(NAA)1mg/L，MS微量，山梨醇(Sorbitol)18g/L，琼脂(Agar)8g/L，B₅有机，蔗糖20g/L，pH＝5.8；头孢菌素(Cefazollin)250mg/L，羧苄青霉素(Carbenicilline)250mg/L，潮霉素 (Hm)50mg/L。 

9、将步骤8所获得的抗性的绿色小芽接种于RTCCH生根培养基，25℃，12h/d，光照约20d，得到抗性植株。RTCCH生根培养基的配方为：N₆培养基，萘乙酸(NAA)1mg/L，蔗糖20g/L，琼脂(Agar)8g/L，pH＝5.8；头孢菌素(Cefazollin)250mg/L，羧苄青霉素(Carbenicilline)250mg/L，潮霉素(Hm)50mg/L。 

10、将步骤9所获得的抗性植株长至5-8cm以上，根健全时移至室外盆栽。 

其中：水稻成熟种子的消毒程序为： 

将种子去壳，用70％的乙醇浸约30s；去乙醇，加入0.2％HgCl，20min；去0.2％HgCl，加入1％NaClO，10min；去NaClO，用无菌水洗5次吸干水份后接种于NB培养基培养。AS：乙酰丁香酮，Sigma公司；Hm：潮霉素，Roche公司有售。 

实验结果见图7，其中，左图为pCUbil390空载体转到中花11得到的转基因植株，呈野生表型，作为阴性对照。右图为基因OsPEX1的过量表达载体pCUbi1390-OsPEX1转化到中花11得到转基因植株，呈突变体表型，植株明显矮化。将过量表达载体pCUbi1390-OsPEX1导入中花11的愈伤，共获得转化苗28株，其中17株阳性株，为突变体表型，株高矮化表型明显；11株阴性株为野生型表型。获得空载体转化株20株，均为野生类型。为了检测转基因植株的遗传稳定性，随机选取10份T₀转基因种子，大田种植T₁代植株，其中正常表型的植株均为转基因阴性株，而呈现株高矮化表型的均为转基因阳性株。 

以上研究结果表明，OsPEX1突变体的突变表型，确实是由于OsPEX1基因的过量表达突变造成的。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (1)

1.一种水稻类伸展蛋白OsPEX1的应用，是将编码该蛋白的OsPEX1基因应用于培育株高降低的水稻，其特征在于：将含有所述OsPEX1基因的重组表达载体导入植物细胞，获得株高降低的转基因水稻，或者利用上述株高降低的转基因水稻作为供体亲本，通过回交选育法改良水稻株高，即将所获得的株高降低的水稻与拟改良的高杆水稻品种杂交，然后杂交后代经多次与轮回亲本杂交，选育得到株高降低的水稻；所述含有OsPEX1基因的重组表达载体是用现有的植物表达载体构建；

所述水稻类伸展蛋白OsPEX1为序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述OsPEX1基因是序列表SEQ ID:1所示的DNA序列。

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