CN105950633B

CN105950633B - 基因OsARF4在控制水稻粒长和千粒重中的应用

Info

Publication number: CN105950633B
Application number: CN201610430815.2A
Authority: CN
Inventors: 刘建祥; 陆孙杰
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2016-06-16
Filing date: 2016-06-16
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2036-06-16
Also published as: CN105950633A

Abstract

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为基因OsARF4在控制水稻粒长和千粒重中的应用。本发明对水稻中表达的生长素应答因子编码基因OsARF4，利用基因工程技术敲除OsARF4，改良水稻粒长及千粒重性状，从而提高产量。本发明通过设计针对OsARF4基因编码区的sgRNA，利用CRISPR‑CAS9技术破坏OsARF2基因编码区，并通过分离去除T‑DNA，获得非转基因水稻，此基因改良水稻植株仅在粒长和千粒重方面有明显的提高和改善，基本不改变其它农艺性状。通过比较，基因改良水稻在粒长和千粒重方面都高于其对照。本发明提供的基因及操作技术在提高作物产量方面具有明显的作用，具有很高的应用价值。

Description

基因OsARF4在控制水稻粒长和千粒重中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及在水稻中敲除一种生长素应答因子OsARF4基因，以提高水稻的粒长和千粒重性状。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界有30多亿的人口以稻米为主食¹。在耕地面积逐渐减少的情况下，为了满足日益增长的人口对粮食的需求，提高水稻单位产量具有重要意义。水稻产量性状属于数量性状(QTL)，由许多效应不同的基因所控制²。以籼型栽培稻PA64与特种大粒稻CW23杂交并与PA64回交构建的产量QTL近等基因系为材料，通过染色体片段叠代定位与基因组序列分析相结合的方法分离克隆了来自CW23基因组的一个控制水稻粒长及千粒重的QTL qTGW3，研究表明粒型qTGW3编码一个功能缺失型GSK5基因（Glycogen synthase kinase）³。以野生型GSK5蛋白为诱饵，在水稻cDNA文库中筛选与之有互作的蛋白，筛选到一个生长素应答基因OsARF4（Auxin Reponse Factor 4）。植物生长素应答因子是调节生长素响应基因表达的一类转录因子，ARFs特异性地与生长素响应基因启动子区域的生长素应答元件（Auxin Response Element，AuxRE）TGTCTC或TGTCNN序列结合，并通过与Aux/IAA蛋白（Auxin/Indole Acetic Acid proteins）和/或ARFs相互作用，调节下游基因的转录⁴。

水稻基因组中含有25个ARFs基因，分别位于水稻的10条染色体上⁵，根据ARFs 蛋白中间功能域（Middle Region，MR）中氨基酸组成的分析，可以将ARFs分成两类：MR区富含谷氨酰胺（Glutamine，Q）、丝氨酸（Serine，S）和亮氨酸（Leucine，L）的ARFs大多为转录激活因子；而MR区富含脯氨酸（Proline，P)，甘氨酸（Glycine，G）、丝氨酸和苏氨酸（Threonine，T）的ARFs大多为转录抑制因子⁵。ARFs在生长素信号转导通路中起着重要作用，从而调控植物生长和发育的多个方面。

发明内容

本发明提供一种水稻生长素响应基因OsARF4改良水稻粒长及千粒重性状方面的应用。

本发明提供的OsARF4基因是水稻第1号染色体上的一个生长素响应基因，基因编号为Os01g0927600（NCBI编号），LOC_Os01g70270（MSU编号）。OsARF4的基因组DNA全长4264bp，共含有14个外显子，序列如SEQ ID NO.1所示（其中红色字体（加粗的）表示外显子（exon），黑色字体表示内含子（intron）），其结构图见图1。OsARF4基因编码区CDS全长为2427bp，序列如SEQ ID NO.2所示，还包括与OsARF4基因编码序列相似度在90%以上的基因；OsARF4基因编码808个氨基酸，具体序列如SEQ ID NO.3所示，还包括与OsARF4蛋白相似度在90%以上的蛋白。OsARF4蛋白含有一个B3 DNA结合结构域（B3 DNA binding domain），一个生长素响应因子域（Auxin response factor domain），一个具有转录调控功能的中间区域（Middle Region）和一个Aux/IAA蛋白超家族域（Aux/IAA superfamily domain），具体见图2所示。

本发明提供一种利用OsARF4基因改良水稻粒长及千粒重性状方面的应用，具体为：设计针对OsARF4基因的sgRNA，采用CRISPR-CAS9基因组编辑技术，在OsARF4基因组特定位置造成碱基突变、缺失或插入；利用孟德尔分离定律在T1代种子中通过分离而去除插入的含有CRISPR-CAS9和潮霉素筛选标记的T-DNA序列，从而获得没有外源T-DNA插入，但基因组改变的基因改良水稻植株。

本发明提供设计并合成sgRNA所需的前导序列（Guide Sequence），其序列碱基为：

CC-ARF2-F2 5- GTGTGCCACCCACACAGGAGCTCG-3 24mer（SEQ ID NO.8）

CC-ARF2-R2 5- AAACCGAGCTCCTGTGTGGGTGGC-3 24mer（SEQ ID NO.9）

将CC-ARF2-F2和CC-ARF2-R2等量混合后，合成双链。具体为：在94℃加热5min，在60℃保持30min。将此合成的双链插入到CRISPR-CAS9载体中。

本发明提供含有以上设计的sgRNA的CRISPR-CAS9载体。

本发明提供含有以上CRISPR-CAS9载体的大肠杆菌和农杆菌工程菌。

本发明提供利用农杆菌将设计的CRISPR-CAS9载体转化到水稻品种日本晴中，并筛选得到基因改良水稻植株。具体方法如下：

（1）构建工程菌：将构建的CRISPR-CAS9载体通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105中，通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此CRISPR-CAS9载体的基因工程菌；

（2）CRISPR-CAS9载体转化水稻愈伤并获得水稻再生苗：用含有CRISPR-CAS9载体的EHA105侵染水稻愈伤组织，并于22℃培养室中共培养3天，再用液体培养基洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养。经过3-4周培养后，可获得抗性愈伤，将抗性愈伤分化成小苗，种植于水稻田；

（3）鉴定位点突变情况：设计引物将CRISPR-CAS9的编辑位点区域扩增出来，引物序列为：

CC-ARF2-F4: 5-GTGGAGAAGACGACTCCTACG-3 21mer（SEQ ID NO.10）

CC-ARF2-R4: 5-AAGGAGATGCCTCCTCGGTTG-3 21mer（SEQ ID NO.11）

PCR产物为620bp。用SacI 酶切此PCR产物，若为野生型，则得到290bp和330bp两条条带；若为基因编辑过的植株，假如酶切后得到一条620bp的条带，则为纯和突变体，假如得到290bp、330bp和620bp三条条带，则为杂合突变体。进一步将620bp的PCR产物委托公司测序，确定突变类型；并在后代中筛选没有T-DNA插入，并且突变类型稳定遗传的植株。

本发明提供OsARF4基因改良水稻在粒长和千粒重方面的应用。敲除水稻OsARF4基因后，其籽粒长度和重量都比对照提高，具体见图8。OsARF4基因突变体和对照日本晴稻谷粒长的统计比较见图9，千粒重见图10所示。本发明可显著提高水稻产量，具有很大的应用价值。

附图说明

图1 OsARF4基因组结构图。

图2 OsARF4蛋白结构图。

图3 酵母双杂交验证OsARF4与OsGSK5的相互作用。

图4 体外pulldown实验验证OsARF4与OsGSK5的相互作用。

图5 荧光素酶互补实验验证OsARF4与OsGSK5的相互作用。

图6 SacI酶切鉴定OsARF4基因突变情况。泳道1是没用SacI酶切的对照，泳道2-9为SacI酶切的情况。其中ARF4-CC5的泳道9为全部切开，泳道2、3、4、6、7、8为部分切开，泳道5为没有切开；ARF4-CC8的泳道2、7为全部切开，泳道4、5、6、8、9为部分切开，泳道3为没有切开。

图7 在ARF4-CC5和ARF4-CC8的子代中筛选没有T-DNA插入的植株。其中ARF4-CC5是第12、22、25、32为没有T-DNA插入的个体；ARF4-CC8的第3、20、26、27为没有T-DNA插入的个体。

图8 对照日本晴和ARF4-CC5、ARF4-CC8的稻谷长度的比较。其中从上至下依次为日本晴、ARF4-CC5和ARF4-CC8。

图9野生型日本晴对照和OsARF4突变体稻谷长度的统计比较。

图10野生型日本晴对照和OsARF4突变体稻谷千粒重的统计比较。

图11 对照日本晴和ARF4-CC5、ARF4-CC8的株型比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，所用材料和试剂均为市售商品。

实施例1：OsARF4蛋白与OsGSK5相互作用的验证

控制水稻粒长及千粒重的QTL TGW3是一个功能缺失型GSK基因（Glycogensynthase kinase），本发明称之为OsGSK5。以野生型OsGSK5为诱饵，在水稻cDNA文库中筛选与之有互作的蛋白，筛选到一个生长素应答基因OsARF4（Auxin Reponse Factor 4）。OsARF4蛋白含有一个B3 DNA结合结构域（B3 DNA binding domain），一个生长素响应因子域（Auxin response factordomain），一个具有转录调控功能的中间区域（Middle Region）和一个Aux/IAA蛋白超家族域（Aux/IAA superfamily domain），具体见图2所示。为了验证OsARF4蛋白与OsGSK5的相互作用，并进一步研究OsARF4蛋白与OsGSK5相互作用的具体位置，我们将OsARF4全长或从N端或C端截短的片段，分别构建在pGADT7载体上，形成AA1-808全长、AA1-336、AA341-808、AA463-808、AA593-808等多个载体（图3）。把以上载体和pGBKT7-GSK5共转化到酵母菌AH109后，打点到营养缺陷培养基上。全长的OsARF4与OsGSK5有相互作用，截短的OsARF4中，AA341-808和AA463-808与GSK5也具有相互作用（图3）。

为了验证OsARF4与OsGSK5是否具有直接相互作用，我们把全长OsARF4克隆到pET28a原核表达载体上，将全长OsGSK5克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上。转化到原核表达菌株Rosetta(DE3)中，用0.5 mM IPTG诱导表达蛋白。用Ni-NTA Agarose（Qiagen）纯化His-OsARF4，用Glutathione-Superflow Resin（Clontech）纯化GST-GSK5。把His-ARF4和GST-GSK5体外孵育做pulldown，结果如图4所示，从结果可以看到，单独GST不能与His-ARF4共沉淀，而GST-GSK5与His-ARF4共沉淀。这个实验说明GSK5和OsARF4具有直接相互作用。

为了验证GSK5和OsARF4在植物细胞中是否具有相互作用，我们用荧光素酶互补实验（split Firefly Luciferase Complementation Assay）验证。将全长OsARF4克隆到JW771 (35S LUC-N)和JW772 (35S LUC-C)载体上，将全长OsGSK5克隆到JW771 (35S LUC-N)和JW772 (35S LUC-C)载体上，分别将以上载体和空载体转化到农杆菌EHA105中，在含卡那霉素和利福平的5 mL LB培养基中震荡培养过夜。设置合适的组合，取0.5个OD₆₀₀的菌液混合，注射到烟草叶片中，2-3天后在LB985植物活体成像系统观察荧光，结果如图5所示。空载体组合nLUC和cLUC，以及空载体和OsARF2或OsGSK5的组合都没有荧光信号，只有含有OsARF4和OsGSK5的组合才有荧光信号。这个实验说明OsARF4和OsGSK5在植物细胞中也具有相互作用。

实施例2：用CRISPR-CAS9敲除OsARF4基因改良水稻粒长和千粒重方面的应用

以下实施例采用水稻粳稻品种日本晴（Oryza sativa L. japonica. cv.Nipponbare）为例。利用农杆菌将设计的CRISPR-CAS9载体转化到日本晴基因组中，并筛选得到基因改良水稻植株。具体方法如下：

（1） CRISPR-CAS9载体构建

设计并合成sgRNA所需的前导序列（Guide Sequence），其序列碱基为：

CC-ARF2-F2 5- GTGTGCCACCCACACAGGAGCTCG-3 24mer（SEQ ID NO.12）

CC-ARF2-R2 5- AAACCGAGCTCCTGTGTGGGTGGC-3 24mer（SEQ ID NO.13）

将CC-ARF2-F2和CC-ARF2-R2等量混合后，合成双链。具体为：在94℃加热5min，在60℃保持30min。将此合成的双链插入到CRISPR-CAS9中间载体中⁶，并通过酶切连接到双元载体pCAMBIA1300上。

（2） CRISPR-CAS9载体转化农杆菌

将构建的CRISPR-CAS9载体通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105中，在LB平板上通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此CRISPR-CAS9载体的基因工程菌。

（3）水稻转基因

A：培养基配方：

N6D固体培养基：N6基本培养基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L 水解酪蛋白+30g/L 蔗糖+3g/L Phytagel + 2 mg/L 2,4-D，pH5.8

N6I固体培养基：N6基本培养基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L 水解酪蛋白+40g/L 蔗糖+10 g/L 葡萄糖+3g/L Phytagel + 2 mg/L 2,4-D，pH5.2

N6CH固体培养基：N6基本培养基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L 水解酪蛋白+30g/L 蔗糖+3g/L Phytagel + 2 mg/L 2,4-D + 50 mg/L潮霉素B+300 mg/L 头孢霉素，pH5.8

N6R固体培养基：N6基本培养基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L 水解酪蛋白+30g/L 蔗糖+3g/L Phytagel + 2 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA + 50 mg/L潮霉素B+300 mg/L 头孢霉素，pH5.8。

B：水稻愈伤组织诱导：

去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2min，然后用15% NaClO（v/v）浸泡并摇晃30min，进行表面灭菌（可在摇床上进行），然后在超净工作台上用无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基N6D上，28℃暗培养。约10-15天后，可见到从胚的位置生长出愈伤组织。

Ｃ：水稻愈伤组织的继代培养

剥下从成熟胚上长出的愈伤组织，转入同样的N6D固体培养基上，在28℃下继代培养。以后每两周继代培养一次。

D：农杆菌介导的水稻转基因方法

农杆菌的培养：在转化前一天将含有目的载体的农杆菌加入到50 mL LB + 50mg/L卡那霉素+ 25 mg/L利福平的液体培养基中，28℃，200 rpm 震荡培养12-16h 至OD600=0.4-0.6。

水稻愈伤的收集：将培养的水稻愈伤组织在超净工作台上收集到一个灭过菌的容器中待用。

侵染菌液的准备：将新鲜培养的农杆菌加入到50 mL 离心管中，5000 rpm，10 min收集农杆菌。用10 mM MgSO4洗一次。沉淀悬浮于N6I液体培养基（成分同N6I固体培养基，但不加phytagel）中，调整菌体浓度至OD₆₀₀为0.5，加入AS（乙酰丁香酮），使AS终浓度为100mΜ。

侵染和共培养：在收集的水稻愈伤组织中加入适量体积的农杆菌悬浮液，使菌液没过水稻愈伤组织，室温放置20min，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基，固体培养基为加入100 mM AS的N6I固体培养基，24℃黑暗培养2-3天。

除菌：将共培养后的愈伤转移至50mL的灭菌离心管，用无菌水清洗3次以上，直至洗脱液体比较清亮。倒出洗脱液后，用加入300 mg/L 头孢霉素的N6D液体培养基再洗一次，倒去洗脱液后，将洗净后的水稻愈伤组织倒在一张无菌滤纸上，吸干多余的水分。

筛选：将洗过的水稻愈伤转移至N6CH固体培养基上，在28℃暗室中培养。每2周继代一次。约4周后，可看到新鲜长出来的抗性愈伤，将这些抗性愈伤转移到新鲜的N6CH培养基上继代。

分化：将抗性愈伤转移至N6R固体培养基上，在光照培养室16h光/8h暗培养。一般经过7-10天左右有绿点出现。30-40天后绿点进一步分化出小苗。将小苗种植于水稻田。

（4）鉴定目的位置突变情况

设计引物将CRISPR-CAS9的编辑位点区域扩增出来，引物序列为：

CC-ARF2-F4: 5-GTGGAGAAGACGACTCCTACG-3 21mer（SEQ ID NO.14）

CC-ARF2-R4: 5-AAGGAGATGCCTCCTCGGTTG-3 21mer（SEQ ID NO.15）

PCR产物为620bp。用SacI 酶切此PCR产物，若得到290bp和330bp两条条带，则为野生型；若为基因编辑过的植株，假如酶切后得到一条620bp的条带，则为纯和突变体，假如得到290bp、330bp和620bp三条条带，则为杂合突变体。在本实施例中，SacI酶切后的结果如图6所示，其中ARF4-CC5的第5泳道和ARF4-CC8的第3泳道是完全没有切开的。进一步将这两个样品的PCR产物委托上海杰李生物技术有限公司测序，确定突变类型，其中ARF4-CC5的突变为在目标区域少了一个T，引起移码突变，突变后的CDS序列如SEQ ID NO.4所示（ARF4-CC5的DNA序列，其中红色字体（加粗的）表示ARF4-CC5的编码区域），其编码的氨基酸序列如SEQID NO. 5所示；ARF4-CC8的突变为在目标区域多了一个T，也引起移码突变，突变后的CDS序列如SEQ ID NO. 6所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。在ARF4-CC5和 ARF4-CC8这两个植株的后代中通过分离去除T-DNA。利用T-DNA上的潮霉素筛选基因（Hygromycin）设计引物，引物序列如下所示：

Hyg-F: GCTGTTATGCGGCCATTGTC （SEQ ID NO.16）

Hyg-R: GACGTCTGTCGAGAAGTTTC （SEQ ID NO.17）

提取ARF4-CC5和 ARF4-CC8这两个植株后代的基因组DNA，用以上引物PCR扩增，若有T-DNA插入，则可得到一条615bp的条带，若没有T-DNA插入，则不能扩出条带。具体实施例如图7所示。通过筛选，我们得到ARF4-CC5和 ARF4-CC8子代中没有T-DNA插入，但OsARF4基因突变的植株。

（5）基因改良水稻在粒长和千粒重方面的考察

本发明提供的OsARF4基因在改良水稻粒长和千粒重方面具有很高的应用价值。敲除水稻OsARF4基因后，其籽粒长度和千粒重都比对照提高，具体见图8所示。OsARF4基因突变体和对照日本晴稻谷粒长的比较见图9，千粒重见图10所示。本发明提供的基因和基因工程技术手段在不影响水稻其他农艺性状（图11）的前提下，可显著提高水稻产量，具有很大的应用价值。

参考文献：

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2.Zuo, J. & Li, J. Molecular genetic dissection of quantitative traitloci regulating rice grain size. Annual Review of Genetics, 48, 99-118(2014).

3.Yoo, M.J., Albert, V.A., Soltis, P.S. & Soltis, D.E. Phylogeneticdiversification of glycogen synthase kinase 3/SHAGGY-like kinase genes inplants. BMC Plant Biology6(2006).

4.Guilfoyle, T.J. The PB1 domain in auxin response factor and Aux/IAAproteins: A versatile protein interaction module in the auxin response. Plant Cell27, 33-43 (2015).

5.Wang, D. et al. Genome-wide analysis of the auxin response factors(ARF) gene family in rice (Oryza sativa). Gene394, 13-24 (2007).

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<130> 001

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4264

<212> DNA

<213> OsARF4基因组序列（Genomic DNA）

<400> 1

atgccgccgg ccgccatggc tccccctccc ccgccgcagg gctcctccac aggtacgcgc 60

gcgcgcgacc cgccccgcgc ggtcagatct ggtcaacaca gctctcctcg cttgcgagct 120

tcgttggggt tgggtttcga ggttgttaat ggttttggtg gtggtgcagg ggatccgctc 180

tacgacgagc tgtggcacgc ctgcgcgggg ccgctcgtca ccgtgccgcg ggtgggcgac 240

ctcgtcttct acttcccgca ggggcacatc gagcaggtgg ggtgaagctt ccccttctga 300

ttcggcaatt ttcggcttga gaggttgctt tttcgagcgc tgattttggt tttttgattt 360

gattgattgt gctgggttgc tgcaggtgga ggcgtccatg aaccaggttg ccgacagcca 420

gatgcgcctc tacgatctgc cctccaagct gctttgccgt gtcctcaacg tcgagctcaa 480

ggtgtgcttc ctacttcccc tttgatttgc ttgctcttca attccggagc tcaccgacgc 540

gacccctctc tgcttcatct gtttgtttgt ttgttctgct tcgattttga ctctgttgct 600

ttgttatttt tttttgttgg ggaattttgt aggcggagca agacaccgac gaggtctacg 660

cgcaggtcat gctcatgccg gagcccgagg taaatttccc gcgtgaattc ttcggaggat 720

gagtaatttt tgccgtctcg gtgaagttgt ttaatttctt tctctgtttg aatttgttta 780

atttctttct ctgtttgttc ctgcagcaaa atgagatggc ggtggagaag acgactccta 840

cgtccggccc tgtgcaggca aggccgccgg tgaggtcctt ctgcaagacg ctcaccgcgt 900

ctgacaccag cacgcacggc ggcttctctg tactccgccg ccacgctgat gagtgcctcc 960

ctcccctggt atgtgtgtct tttaaccctg gagtagatga tcctattaat gttcttcatt 1020

tgaagtgtgt ttaagttgta attgatctgt gctactagct gacctgatct gcttgcttgt 1080

caggatatga cccagtcgcc acccacacag gagctcgtgg ccaaggatct gcacagcatg 1140

gactggcgct tccgtcacat ctttcgcggt aagttgtgtg cccctttgct taccatggtt 1200

catgccattt ttacaccgtc ttgcatacac ctgcggctct gcagaccact agttgtaatt 1260

gctgttagtt ctttgtcaat tgattagacc actgtaccat tcaagcattt ctggcaatgt 1320

tacacatcaa atctttcaat gaatcgcaaa agttttttct ttctgtactt gatgttgacg 1380

atgatgatga ttattgtgtt attgctgttg aatatcatca gggcaaccga ggaggcatct 1440

ccttcagagt ggttggagtg tgtttgtcag ttccaaaagg cttgttgctg gggatgcttt 1500

cattttcctc aggtctgttg tggtaccctc tctgcccagc atttcaattc cttgatcaag 1560

tgttaacttt gctgtgctct acgcagagga gagaatggtg aactccgtgt tggtgttaga 1620

cgagctatga ggcagctgtc caatgtgcct tcttcagtca tatctagcca aagcatgcac 1680

ctgggagtcc ttgctactgc atggcatgct atcaacacga agagtatgtt caccgtctac 1740

tacaaaccta ggtatgttga gatgtccact acaaatctat tgttttatct ggctgttagg 1800

ctattcttgc atagttgcat gatctgtaac atatcgaagc tgttcctgcc actgtgatcc 1860

catctaatta aacttctctg aatgatgatg ataggacgag cccttcagag ttcattatac 1920

catatgatca gtatatggag tccgtcaaaa acaattactc tgttgggatg aggttcagga 1980

tgaggtttga aggagaagag gcaccagagc agaggtatct gttgtcttga tattctatgt 2040

aaatatggtt ttatgtggat tattccaagt gattgcttga ttaaacttat ttccattatg 2100

taggtttact ggtactataa ttggcagtga gaatctcgac ccagtgtggc ctgaatcaag 2160

ttggagatcc ctgaaggtag gttcttgttt actactggca ttttatgtgg ctggagaagt 2220

tatgtattga tgggaggagt ttttcaataa tgtaggtgcg gtgggatgaa ccatcaacta 2280

ttccgcggcc agatagagtc tctccttgga aaatagagcc tgcttcatca cctcctgtta 2340

acccccttcc tctttctagg gttaaaagac ctaggccaaa tgctcctcca gcatctcctg 2400

aatctcctat tcttacgaaa gaaggtaact acacaatctt atagatctta agaggaaggg 2460

tgatgataat gcgtgttcaa ttaatcctct gaaaactgtt ggtgccattt gcagctgcta 2520

ctaaggttga cactgatcct gctcaagcac aacgaagtca aaacagtacg gtcttgcaag 2580

gtcaagaaca aatgaccttg aggagcaacc ttactgagag taatgactct gatgtcactg 2640

ctcataagcc aatgatgtgg tctccatccc caaatgctgc aaaagcccac cccttgacat 2700

ttcagcagag accccctatg gataattgga tgcagttggg aaggcgtgaa actgacttta 2760

aggatgtccg ttctggctct caatcttttg gtgattcccc aggcttcttt atgcagaatt 2820

ttgatgaggc tcctaaccgt cttacttctt tcaagaacca gtttcaggat caaggttctg 2880

ctcggcactt ctctgaccca tactactatg tatctccaca gccttcccta actgttgaat 2940

caagcacaca gatgcacaca gacagtaagg agttacattt ctggaatggc cagagtactg 3000

tgtatggtaa ttcgagagac cgaccacaga atttcagatt cgaacagaac tcatcaagtt 3060

ggttaaatca gtcatttgcc cgacctgaac agccaagagt gattagaccg catgcatcaa 3120

tagctccagt tgagttggaa aaaacagaag gcagtgggtt taagattttt gggtttaaag 3180

ttgatacaac caatgctcct aacaatcact tgagctcccc gatggctgca acacatgagc 3240

ctatgcttca aactccatca tcattgaatc agttgcaacc tgtacaaact gattgcattc 3300

ctgaggtatc agtaagcaca gctggaacgg cgactgagaa tgagaaaagc ggtcagcaag 3360

ctcaacagag ttcaaaagat gttcaaagca agactcaggt tgcttcgacg aggagttgta 3420

caaaggtata gtattgtttt cttgatggtc atgacaatgt gcatgtcttt tctgttgcac 3480

aattttcttt tacttaagaa ttactgaatg tttgttgtct agattatgct agctgttgag 3540

aacaaactat ccagtcatat cagagtgaat tgattctggt ggtgttaaag cacatattgt 3600

tcttttattc agcacatgaa gttttttctt ctcgtagttg acatgctgaa gttctcgttt 3660

tgtaaatttc ttgcaaaatc tcagttttat cccctttgtg gtatggtaaa cccaattttg 3720

ctatttcttg tcccaaaaaa aaatcatgag caatattatt cagtgcagca tgagtgtgtc 3780

aagtttgact attggtctgc actatgtaat aacatcatgt cattgattct tcatgcaggt 3840

ccataagcaa ggcgttgcac ttggcagatc tgtggatctt tcaaagttca gtaactatga 3900

tgaactcaaa gctgagctag acaagatgtt tgaattcgat ggtgaattgg tgtcttcaaa 3960

caaaaactgg caaattgttt atactgataa tgagggtgat atgatgcttg ttggagacga 4020

cccatgggag taaggcttct atcttgggta cctgcttgat gttttgttaa gctttccttc 4080

ctaatactga ttctagctgg ttcattttat gagcagagaa ttctgcagca ttgtgcggaa 4140

gatttatatt tacaccaagg aggaggtcca gaagatgaat tcgaaatcaa atgccccaag 4200

gaaagatgac tcttcagaaa atgagaaagg tcatctgccg atgcccaaca aatcagataa 4260

ctag 4264

<210> 2

<211> 2427

<212> DNA

<213> OsARF4基因编码区（CDS）

<400> 2

atgccgccgg ccgccatggc tccccctccc ccgccgcagg gctcctccac aggggatccg 60

ctctacgacg agctgtggca cgcctgcgcg gggccgctcg tcaccgtgcc gcgggtgggc 120

gacctcgtct tctacttccc gcaggggcac atcgagcagg tggaggcgtc catgaaccag 180

gttgccgaca gccagatgcg cctctacgat ctgccctcca agctgctttg ccgtgtcctc 240

aacgtcgagc tcaaggcgga gcaagacacc gacgaggtct acgcgcaggt catgctcatg 300

ccggagcccg agcaaaatga gatggcggtg gagaagacga ctcctacgtc cggccctgtg 360

caggcaaggc cgccggtgag gtccttctgc aagacgctca ccgcgtctga caccagcacg 420

cacggcggct tctctgtact ccgccgccac gctgatgagt gcctccctcc cctggatatg 480

acccagtcgc cacccacaca ggagctcgtg gccaaggatc tgcacagcat ggactggcgc 540

ttccgtcaca tctttcgcgg gcaaccgagg aggcatctcc ttcagagtgg ttggagtgtg 600

tttgtcagtt ccaaaaggct tgttgctggg gatgctttca ttttcctcag aggagagaat 660

ggtgaactcc gtgttggtgt tagacgagct atgaggcagc tgtccaatgt gccttcttca 720

gtcatatcta gccaaagcat gcacctggga gtccttgcta ctgcatggca tgctatcaac 780

acgaagagta tgttcaccgt ctactacaaa cctaggacga gcccttcaga gttcattata 840

ccatatgatc agtatatgga gtccgtcaaa aacaattact ctgttgggat gaggttcagg 900

atgaggtttg aaggagaaga ggcaccagag cagaggttta ctggtactat aattggcagt 960

gagaatctcg acccagtgtg gcctgaatca agttggagat ccctgaaggt gcggtgggat 1020

gaaccatcaa ctattccgcg gccagataga gtctctcctt ggaaaataga gcctgcttca 1080

tcacctcctg ttaaccccct tcctctttct agggttaaaa gacctaggcc aaatgctcct 1140

ccagcatctc ctgaatctcc tattcttacg aaagaagctg ctactaaggt tgacactgat 1200

cctgctcaag cacaacgaag tcaaaacagt acggtcttgc aaggtcaaga acaaatgacc 1260

ttgaggagca accttactga gagtaatgac tctgatgtca ctgctcataa gccaatgatg 1320

tggtctccat ccccaaatgc tgcaaaagcc caccccttga catttcagca gagaccccct 1380

atggataatt ggatgcagtt gggaaggcgt gaaactgact ttaaggatgt ccgttctggc 1440

tctcaatctt ttggtgattc cccaggcttc tttatgcaga attttgatga ggctcctaac 1500

cgtcttactt ctttcaagaa ccagtttcag gatcaaggtt ctgctcggca cttctctgac 1560

ccatactact atgtatctcc acagccttcc ctaactgttg aatcaagcac acagatgcac 1620

acagacagta aggagttaca tttctggaat ggccagagta ctgtgtatgg taattcgaga 1680

gaccgaccac agaatttcag attcgaacag aactcatcaa gttggttaaa tcagtcattt 1740

gcccgacctg aacagccaag agtgattaga ccgcatgcat caatagctcc agttgagttg 1800

gaaaaaacag aaggcagtgg gtttaagatt tttgggttta aagttgatac aaccaatgct 1860

cctaacaatc acttgagctc cccgatggct gcaacacatg agcctatgct tcaaactcca 1920

tcatcattga atcagttgca acctgtacaa actgattgca ttcctgaggt atcagtaagc 1980

acagctggaa cggcgactga gaatgagaaa agcggtcagc aagctcaaca gagttcaaaa 2040

gatgttcaaa gcaagactca ggttgcttcg acgaggagtt gtacaaaggt ccataagcaa 2100

ggcgttgcac ttggcagatc tgtggatctt tcaaagttca gtaactatga tgaactcaaa 2160

gctgagctag acaagatgtt tgaattcgat ggtgaattgg tgtcttcaaa caaaaactgg 2220

caaattgttt atactgataa tgagggtgat atgatgcttg ttggagacga cccatgggaa 2280

gaattctgca gcattgtgcg gaagatttat atttacacca aggaggaggt ccagaagatg 2340

aattcgaaat caaatgcccc aaggaaagat gactcttcag aaaatgagaa aggtcatctg 2400

ccgatgccca acaaatcaga taactag 2427

<210> 3

<211> 808

<212> PRT

<213> OsARF4蛋白序列

<400> 3

Met Pro Pro Ala Ala Met Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gly Ser Ser

1 5 10 15

Thr Gly Asp Pro Leu Tyr Asp Glu Leu Trp His Ala Cys Ala Gly Pro

20 25 30

Leu Val Thr Val Pro Arg Val Gly Asp Leu Val Phe Tyr Phe Pro Gln

35 40 45

Gly His Ile Glu Gln Val Glu Ala Ser Met Asn Gln Val Ala Asp Ser

50 55 60

Gln Met Arg Leu Tyr Asp Leu Pro Ser Lys Leu Leu Cys Arg Val Leu

65 70 75 80

Asn Val Glu Leu Lys Ala Glu Gln Asp Thr Asp Glu Val Tyr Ala Gln

85 90 95

Val Met Leu Met Pro Glu Pro Glu Gln Asn Glu Met Ala Val Glu Lys

100 105 110

Thr Thr Pro Thr Ser Gly Pro Val Gln Ala Arg Pro Pro Val Arg Ser

115 120 125

Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly Phe

130 135 140

Ser Val Leu Arg Arg His Ala Asp Glu Cys Leu Pro Pro Leu Asp Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Pro Thr Gln Glu Leu Val Ala Lys Asp Leu His Ser

165 170 175

Met Asp Trp Arg Phe Arg His Ile Phe Arg Gly Gln Pro Arg Arg His

180 185 190

Leu Leu Gln Ser Gly Trp Ser Val Phe Val Ser Ser Lys Arg Leu Val

195 200 205

Ala Gly Asp Ala Phe Ile Phe Leu Arg Gly Glu Asn Gly Glu Leu Arg

210 215 220

Val Gly Val Arg Arg Ala Met Arg Gln Leu Ser Asn Val Pro Ser Ser

225 230 235 240

Val Ile Ser Ser Gln Ser Met His Leu Gly Val Leu Ala Thr Ala Trp

245 250 255

His Ala Ile Asn Thr Lys Ser Met Phe Thr Val Tyr Tyr Lys Pro Arg

260 265 270

Thr Ser Pro Ser Glu Phe Ile Ile Pro Tyr Asp Gln Tyr Met Glu Ser

275 280 285

Val Lys Asn Asn Tyr Ser Val Gly Met Arg Phe Arg Met Arg Phe Glu

290 295 300

Gly Glu Glu Ala Pro Glu Gln Arg Phe Thr Gly Thr Ile Ile Gly Ser

305 310 315 320

Glu Asn Leu Asp Pro Val Trp Pro Glu Ser Ser Trp Arg Ser Leu Lys

325 330 335

Val Arg Trp Asp Glu Pro Ser Thr Ile Pro Arg Pro Asp Arg Val Ser

340 345 350

Pro Trp Lys Ile Glu Pro Ala Ser Ser Pro Pro Val Asn Pro Leu Pro

355 360 365

Leu Ser Arg Val Lys Arg Pro Arg Pro Asn Ala Pro Pro Ala Ser Pro

370 375 380

Glu Ser Pro Ile Leu Thr Lys Glu Ala Ala Thr Lys Val Asp Thr Asp

385 390 395 400

Pro Ala Gln Ala Gln Arg Ser Gln Asn Ser Thr Val Leu Gln Gly Gln

405 410 415

Glu Gln Met Thr Leu Arg Ser Asn Leu Thr Glu Ser Asn Asp Ser Asp

420 425 430

Val Thr Ala His Lys Pro Met Met Trp Ser Pro Ser Pro Asn Ala Ala

435 440 445

Lys Ala His Pro Leu Thr Phe Gln Gln Arg Pro Pro Met Asp Asn Trp

450 455 460

Met Gln Leu Gly Arg Arg Glu Thr Asp Phe Lys Asp Val Arg Ser Gly

465 470 475 480

Ser Gln Ser Phe Gly Asp Ser Pro Gly Phe Phe Met Gln Asn Phe Asp

485 490 495

Glu Ala Pro Asn Arg Leu Thr Ser Phe Lys Asn Gln Phe Gln Asp Gln

500 505 510

Gly Ser Ala Arg His Phe Ser Asp Pro Tyr Tyr Tyr Val Ser Pro Gln

515 520 525

Pro Ser Leu Thr Val Glu Ser Ser Thr Gln Met His Thr Asp Ser Lys

530 535 540

Glu Leu His Phe Trp Asn Gly Gln Ser Thr Val Tyr Gly Asn Ser Arg

545 550 555 560

Asp Arg Pro Gln Asn Phe Arg Phe Glu Gln Asn Ser Ser Ser Trp Leu

565 570 575

Asn Gln Ser Phe Ala Arg Pro Glu Gln Pro Arg Val Ile Arg Pro His

580 585 590

Ala Ser Ile Ala Pro Val Glu Leu Glu Lys Thr Glu Gly Ser Gly Phe

595 600 605

Lys Ile Phe Gly Phe Lys Val Asp Thr Thr Asn Ala Pro Asn Asn His

610 615 620

Leu Ser Ser Pro Met Ala Ala Thr His Glu Pro Met Leu Gln Thr Pro

625 630 635 640

Ser Ser Leu Asn Gln Leu Gln Pro Val Gln Thr Asp Cys Ile Pro Glu

645 650 655

Val Ser Val Ser Thr Ala Gly Thr Ala Thr Glu Asn Glu Lys Ser Gly

660 665 670

Gln Gln Ala Gln Gln Ser Ser Lys Asp Val Gln Ser Lys Thr Gln Val

675 680 685

Ala Ser Thr Arg Ser Cys Thr Lys Val His Lys Gln Gly Val Ala Leu

690 695 700

Gly Arg Ser Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Asn Tyr Asp Glu Leu Lys

705 710 715 720

Ala Glu Leu Asp Lys Met Phe Glu Phe Asp Gly Glu Leu Val Ser Ser

725 730 735

Asn Lys Asn Trp Gln Ile Val Tyr Thr Asp Asn Glu Gly Asp Met Met

740 745 750

Leu Val Gly Asp Asp Pro Trp Glu Glu Phe Cys Ser Ile Val Arg Lys

755 760 765

Ile Tyr Ile Tyr Thr Lys Glu Glu Val Gln Lys Met Asn Ser Lys Ser

770 775 780

Asn Ala Pro Arg Lys Asp Asp Ser Ser Glu Asn Glu Lys Gly His Leu

785 790 795 800

Pro Met Pro Asn Lys Ser Asp Asn

805

<210> 4

<211> 2426

<212> DNA

<213> ARF4-CC5的DNA序列

<400> 4

atgccgccgg ccgccatggc tccccctccc ccgccgcagg gctcctccac aggggatccg 60

ctctacgacg agctgtggca cgcctgcgcg gggccgctcg tcaccgtgcc gcgggtgggc 120

gacctcgtct tctacttccc gcaggggcac atcgagcagg tggaggcgtc catgaaccag 180

gttgccgaca gccagatgcg cctctacgat ctgccctcca agctgctttg ccgtgtcctc 240

aacgtcgagc tcaaggcgga gcaagacacc gacgaggtct acgcgcaggt catgctcatg 300

ccggagcccg agcaaaatga gatggcggtg gagaagacga ctcctacgtc cggccctgtg 360

caggcaaggc cgccggtgag gtccttctgc aagacgctca ccgcgtctga caccagcacg 420

cacggcggct tctctgtact ccgccgccac gctgatgagt gcctccctcc cctggatatg 480

acccagtcgc cacccacaca ggagccgtgg ccaaggatct gcacagcatg gactggcgct 540

tccgtcacat ctttcgcggg caaccgagga ggcatctcct tcagagtggt tggagtgtgt 600

ttgtcagttc caaaaggctt gttgctgggg atgctttcat tttcctcaga ggagagaatg 660

gtgaactccg tgttggtgtt agacgagcta tgaggcagct gtccaatgtg ccttcttcag 720

tcatatctag ccaaagcatg cacctgggag tccttgctac tgcatggcat gctatcaaca 780

cgaagagtat gttcaccgtc tactacaaac ctaggacgag cccttcagag ttcattatac 840

catatgatca gtatatggag tccgtcaaaa acaattactc tgttgggatg aggttcagga 900

tgaggtttga aggagaagag gcaccagagc agaggtttac tggtactata attggcagtg 960

agaatctcga cccagtgtgg cctgaatcaa gttggagatc cctgaaggtg cggtgggatg 1020

aaccatcaac tattccgcgg ccagatagag tctctccttg gaaaatagag cctgcttcat 1080

cacctcctgt taaccccctt cctctttcta gggttaaaag acctaggcca aatgctcctc 1140

cagcatctcc tgaatctcct attcttacga aagaagctgc tactaaggtt gacactgatc 1200

ctgctcaagc acaacgaagt caaaacagta cggtcttgca aggtcaagaa caaatgacct 1260

tgaggagcaa ccttactgag agtaatgact ctgatgtcac tgctcataag ccaatgatgt 1320

ggtctccatc cccaaatgct gcaaaagccc accccttgac atttcagcag agacccccta 1380

tggataattg gatgcagttg ggaaggcgtg aaactgactt taaggatgtc cgttctggct 1440

ctcaatcttt tggtgattcc ccaggcttct ttatgcagaa ttttgatgag gctcctaacc 1500

gtcttacttc tttcaagaac cagtttcagg atcaaggttc tgctcggcac ttctctgacc 1560

catactacta tgtatctcca cagccttccc taactgttga atcaagcaca cagatgcaca 1620

cagacagtaa ggagttacat ttctggaatg gccagagtac tgtgtatggt aattcgagag 1680

accgaccaca gaatttcaga ttcgaacaga actcatcaag ttggttaaat cagtcatttg 1740

cccgacctga acagccaaga gtgattagac cgcatgcatc aatagctcca gttgagttgg 1800

aaaaaacaga aggcagtggg tttaagattt ttgggtttaa agttgataca accaatgctc 1860

ctaacaatca cttgagctcc ccgatggctg caacacatga gcctatgctt caaactccat 1920

catcattgaa tcagttgcaa cctgtacaaa ctgattgcat tcctgaggta tcagtaagca 1980

cagctggaac ggcgactgag aatgagaaaa gcggtcagca agctcaacag agttcaaaag 2040

atgttcaaag caagactcag gttgcttcga cgaggagttg tacaaaggtc cataagcaag 2100

gcgttgcact tggcagatct gtggatcttt caaagttcag taactatgat gaactcaaag 2160

ctgagctaga caagatgttt gaattcgatg gtgaattggt gtcttcaaac aaaaactggc 2220

aaattgttta tactgataat gagggtgata tgatgcttgt tggagacgac ccatgggaag 2280

aattctgcag cattgtgcgg aagatttata tttacaccaa ggaggaggtc cagaagatga 2340

attcgaaatc aaatgcccca aggaaagatg actcttcaga aaatgagaaa ggtcatctgc 2400

cgatgcccaa caaatcagat aactag 2426

<210> 5

<211> 230

<212> PRT

<213> ARF4-CC5编码的氨基酸序列

<400> 5

Met Pro Pro Ala Ala Met Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gly Ser Ser

1 5 10 15

Thr Gly Asp Pro Leu Tyr Asp Glu Leu Trp His Ala Cys Ala Gly Pro

20 25 30

Leu Val Thr Val Pro Arg Val Gly Asp Leu Val Phe Tyr Phe Pro Gln

35 40 45

Gly His Ile Glu Gln Val Glu Ala Ser Met Asn Gln Val Ala Asp Ser

50 55 60

Gln Met Arg Leu Tyr Asp Leu Pro Ser Lys Leu Leu Cys Arg Val Leu

65 70 75 80

Asn Val Glu Leu Lys Ala Glu Gln Asp Thr Asp Glu Val Tyr Ala Gln

85 90 95

Val Met Leu Met Pro Glu Pro Glu Gln Asn Glu Met Ala Val Glu Lys

100 105 110

Thr Thr Pro Thr Ser Gly Pro Val Gln Ala Arg Pro Pro Val Arg Ser

115 120 125

Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly Phe

130 135 140

Ser Val Leu Arg Arg His Ala Asp Glu Cys Leu Pro Pro Leu Asp Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Pro Thr Gln Glu Pro Trp Pro Arg Ile Cys Thr Ala

165 170 175

Trp Thr Gly Ala Ser Val Thr Ser Phe Ala Gly Asn Arg Gly Gly Ile

180 185 190

Ser Phe Arg Val Val Gly Val Cys Leu Ser Val Pro Lys Gly Leu Leu

195 200 205

Leu Gly Met Leu Ser Phe Ser Ser Glu Glu Arg Met Val Asn Ser Val

210 215 220

Leu Val Leu Asp Glu Leu

225 230

<210> 6

<211> 2428

<212> DNA

<213> ARF4-CC8的DNA序列

<400> 6

atgccgccgg ccgccatggc tccccctccc ccgccgcagg gctcctccac aggggatccg 60

ctctacgacg agctgtggca cgcctgcgcg gggccgctcg tcaccgtgcc gcgggtgggc 120

gacctcgtct tctacttccc gcaggggcac atcgagcagg tggaggcgtc catgaaccag 180

gttgccgaca gccagatgcg cctctacgat ctgccctcca agctgctttg ccgtgtcctc 240

aacgtcgagc tcaaggcgga gcaagacacc gacgaggtct acgcgcaggt catgctcatg 300

ccggagcccg agcaaaatga gatggcggtg gagaagacga ctcctacgtc cggccctgtg 360

caggcaaggc cgccggtgag gtccttctgc aagacgctca ccgcgtctga caccagcacg 420

cacggcggct tctctgtact ccgccgccac gctgatgagt gcctccctcc cctggatatg 480

acccagtcgc cacccacaca ggagcttcgt ggccaaggat ctgcacagca tggactggcg 540

cttccgtcac atctttcgcg ggcaaccgag gaggcatctc cttcagagtg gttggagtgt 600

gtttgtcagt tccaaaaggc ttgttgctgg ggatgctttc attttcctca gaggagagaa 660

tggtgaactc cgtgttggtg ttagacgagc tatgaggcag ctgtccaatg tgccttcttc 720

agtcatatct agccaaagca tgcacctggg agtccttgct actgcatggc atgctatcaa 780

cacgaagagt atgttcaccg tctactacaa acctaggacg agcccttcag agttcattat 840

accatatgat cagtatatgg agtccgtcaa aaacaattac tctgttggga tgaggttcag 900

gatgaggttt gaaggagaag aggcaccaga gcagaggttt actggtacta taattggcag 960

tgagaatctc gacccagtgt ggcctgaatc aagttggaga tccctgaagg tgcggtggga 1020

tgaaccatca actattccgc ggccagatag agtctctcct tggaaaatag agcctgcttc 1080

atcacctcct gttaaccccc ttcctctttc tagggttaaa agacctaggc caaatgctcc 1140

tccagcatct cctgaatctc ctattcttac gaaagaagct gctactaagg ttgacactga 1200

tcctgctcaa gcacaacgaa gtcaaaacag tacggtcttg caaggtcaag aacaaatgac 1260

cttgaggagc aaccttactg agagtaatga ctctgatgtc actgctcata agccaatgat 1320

gtggtctcca tccccaaatg ctgcaaaagc ccaccccttg acatttcagc agagaccccc 1380

tatggataat tggatgcagt tgggaaggcg tgaaactgac tttaaggatg tccgttctgg 1440

ctctcaatct tttggtgatt ccccaggctt ctttatgcag aattttgatg aggctcctaa 1500

ccgtcttact tctttcaaga accagtttca ggatcaaggt tctgctcggc acttctctga 1560

cccatactac tatgtatctc cacagccttc cctaactgtt gaatcaagca cacagatgca 1620

cacagacagt aaggagttac atttctggaa tggccagagt actgtgtatg gtaattcgag 1680

agaccgacca cagaatttca gattcgaaca gaactcatca agttggttaa atcagtcatt 1740

tgcccgacct gaacagccaa gagtgattag accgcatgca tcaatagctc cagttgagtt 1800

ggaaaaaaca gaaggcagtg ggtttaagat ttttgggttt aaagttgata caaccaatgc 1860

tcctaacaat cacttgagct ccccgatggc tgcaacacat gagcctatgc ttcaaactcc 1920

atcatcattg aatcagttgc aacctgtaca aactgattgc attcctgagg tatcagtaag 1980

cacagctgga acggcgactg agaatgagaa aagcggtcag caagctcaac agagttcaaa 2040

agatgttcaa agcaagactc aggttgcttc gacgaggagt tgtacaaagg tccataagca 2100

aggcgttgca cttggcagat ctgtggatct ttcaaagttc agtaactatg atgaactcaa 2160

agctgagcta gacaagatgt ttgaattcga tggtgaattg gtgtcttcaa acaaaaactg 2220

gcaaattgtt tatactgata atgagggtga tatgatgctt gttggagacg acccatggga 2280

agaattctgc agcattgtgc ggaagattta tatttacacc aaggaggagg tccagaagat 2340

gaattcgaaa tcaaatgccc caaggaaaga tgactcttca gaaaatgaga aaggtcatct 2400

gccgatgccc aacaaatcag ataactag 2428

<210> 7

<211> 221

<212> PRT

<213> ARF4-CC8编码的氨基酸序列

<400> 7

Met Pro Pro Ala Ala Met Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gly Ser Ser

1 5 10 15

Thr Gly Asp Pro Leu Tyr Asp Glu Leu Trp His Ala Cys Ala Gly Pro

20 25 30

Leu Val Thr Val Pro Arg Val Gly Asp Leu Val Phe Tyr Phe Pro Gln

35 40 45

Gly His Ile Glu Gln Val Glu Ala Ser Met Asn Gln Val Ala Asp Ser

50 55 60

Gln Met Arg Leu Tyr Asp Leu Pro Ser Lys Leu Leu Cys Arg Val Leu

65 70 75 80

Asn Val Glu Leu Lys Ala Glu Gln Asp Thr Asp Glu Val Tyr Ala Gln

85 90 95

Val Met Leu Met Pro Glu Pro Glu Gln Asn Glu Met Ala Val Glu Lys

100 105 110

Thr Thr Pro Thr Ser Gly Pro Val Gln Ala Arg Pro Pro Val Arg Ser

115 120 125

Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly Phe

130 135 140

Ser Val Leu Arg Arg His Ala Asp Glu Cys Leu Pro Pro Leu Asp Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Pro Thr Gln Glu Leu Arg Gly Gln Gly Ser Ala Gln

165 170 175

His Gly Leu Ala Leu Pro Ser His Leu Ser Arg Ala Thr Glu Glu Ala

180 185 190

Ser Pro Ser Glu Trp Leu Glu Cys Val Cys Gln Phe Gln Lys Ala Cys

195 200 205

Cys Trp Gly Cys Phe His Phe Pro Gln Arg Arg Glu Trp

210 215 220

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213>

<400> 8

gtgtgccacc cacacaggag ctcg 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213>

<400> 9

aaaccgagct cctgtgtggg tggc 24

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213>

<400> 10

gtggagaaga cgactcctac g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213>

<400> 11

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<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213>

<400> 12

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<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213>

<400> 13

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<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213>

<400> 14

gtggagaaga cgactcctac g 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213>

<400> 15

aaggagatgc ctcctcggtt g 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 16

gctgttatgc ggccattgtc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 17

gacgtctgtc gagaagtttc 20

Claims

1.水稻OsARF4基因在改良水稻粒长及千粒重性状方面的应用，其特征在于，利用基因工程技术敲除水稻OsARF4基因，以提高水稻的粒长和千粒重性状；

水稻OsARF4的基因组DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，OsARF4基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO. 3所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，设计针对OsARF4基因的sgRNA，采用CRISPR-CAS9基因组编辑技术，在OsARF4基因组特定位置造成碱基突变、缺失或插入；利用孟德尔分离定律在T1代种子中通过分离而去除插入的含有CRISPR-CAS9和潮霉素筛选标记的T-DNA序列，从而获得没有外源T-DNA插入、但基因组改变的基因改良水稻植株；

其中，设计并合成sgRNA所需的前导序列为：SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9，将两者等量混合后，合成双链；将此合成的双链插入到CRISPR-CAS9载体中。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用农杆菌将设计的CRISPR-CAS9载体转化到水稻品种日本晴中，并筛选得到基因改良水稻植株，具体方法如下：

（2）CRISPR-CAS9载体转化水稻愈伤并获得水稻再生苗：用含有CRISPR-CAS9载体的EHA105侵染水稻愈伤组织，并于22℃培养室中共培养3天，再用液体培养基洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养；经过3-4周培养后，获得抗性愈伤，将抗性愈伤分化成小苗，种植于水稻田；

（3）鉴定位点突变情况：设计引物将CRISPR-CAS9的编辑位点区域扩增出来，引物序列为： SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11， PCR产物为620bp；用SacI 酶切此PCR产物，若为野生型，则得到290bp和330bp两条条带；若为基因编辑过的植株，假如酶切后得到一条620bp的条带，则为纯和突变体，假如得到290bp、330bp和620bp三条条带，则为杂合突变体；

进一步，将620bp的PCR产物测序，确定突变类型；并在后代中筛选没有T-DNA插入、并且突变类型稳定遗传的植株。