CN116445482A - 一种启动子及其在增强基因表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种启动子及其在增强基因表达中的应用。本发明通过使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对基因启动子区域进行饱和突变，获得一种具有增强基因表达效果的新型启动子。该启动子可以用于增强基因表达。另一方面，本发明还提供了一种提高玉米籽粒中维生素E含量的方法。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种启动子及其在增强基因表达中的应用。
背景技术
启动子是决定基因表达模式的重要元件。启动子包括转录起始位点，TATA框和上游启动子元件，分为组成型、组织特异型和诱导型等几个种类。具有特定特性的启动子在基因工程领域具有很大的价值，例如CaMV 35S、Actin、ubiquitin等组成型启动子常用于超量表达目的基因；而rbcs等各种组织特异型启动子可用于目的基因的组织特异性表达。然而，受到研究手段的限制，可用的功能明确的启动子仍然相对较少，不能满足需求。
利用报告基因测定启动子活性以及通过不同长度的启动子片段活性测试确定启动子中的顺式元件是全面研究启动子功能的常用手段，然而这种方法获得的结果并不能直接反映启动子在“原位”上的功能，从而影响结果的可靠性。
基因编辑是对物种进行性状改良的有效工具。除了能够对基因进行编辑外，也可以对启动子进行编辑，通过改变启动子特性改变基因的表达，从而实现性状改良的效果。例如，修饰水稻OsSWEET基因启动子可以提高水稻对白叶枯病的抗性(Oliva,R.,Ji,C.,Atienza-Grande,G.et al.Broad-spectrum resistance to bacterial blight in riceusing genome editing[J].Nat Biotechnol.,2019,37,1344-1350)；编辑番茄中的SlCLV3等启动子可以获得连续变化的表型，从而可以对表型进行微调(Rodríguez-Leal D,LemmonZ H,Man J,et al.Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvementby Genome Editing[J].Cell,2017,171:470-480.e8.)。
因此，在“原位”上鉴定启动子中的顺式元件功能，获得能改变基因表达模式的启动子变异对于性状的遗传改良具有重要意义。由于启动子结构的复杂性(影响基因表达的区域可能分布在转录起始位点前的2kb甚至是5kb范围内)和不可预测性(虽然可以初步预测常用顺式元件的位置，但是预测结果并不可靠)，一种在“原位”上高通量鉴定启动子顺式元件和创制有功能的启动子变异的方法就具有很大的价值。
CN113061602A专利公开了一种高通量启动子变异创制方法。本发明采用类似的方法获得了一种具有增强基因表达效果的新型启动子。该启动子可以用于增强基因表达。另一方面，本发明还提供了一种提高玉米籽粒中维生素E含量的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型启动子。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种启动子，其特征在于：所述启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种表达盒，其特征在于：由上述的启动子、编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子、SEQ ID NO.3所示序列的终止子顺序连接而成。其中SEQ ID NO.2是VTE4基因编码的氨基酸序列。SEQ ID NO.3是nos终止子序列。
在一些实施方案中，上述编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。SEQ ID NO.4是VTE4基因组序列，SEQ ID NO.5是VTE4基因CDS编码区序列。
本发明还提供一种提高玉米籽粒中维生素E含量的方法，其特征在于：包括如下任一种：
(1)使用基因工程手段同时靶向修改SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的玉米基因组区域序列，选择玉米籽粒中维生素E含量提高的植株；
(2)将含有上述的表达盒插入玉米基因组，选择玉米籽粒中维生素E含量提高的植株。
在一些实施方案中，上述的基因工程手段采用CRISPR/Cas9基因编辑方法。
本发明还提供一种提高玉米籽粒中维生素E含量的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)能够同时识别SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示靶标序列的RNA分子；该RNA分子可以是包含gRNA、crRNAs和tracrRNA结构的sgRNA分子，也可以是gRNA、crRNAs和tracrRNA单独形成的复合体，或包括gRNA、crRNAs的复合体；在一些实施方案中，上述的RNA分子为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示序列的组合。
(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述RNA的载体。
本发明还提供上述的启动子在增强基因表达中的应用。
上述的表达盒、方法、试剂盒在提高玉米籽粒中维生素E含量中的应用。
本发明的创新性及有益效果如下：在启动子结构的复杂性和不可预测性的背景下，本发明获得了一种新型的启动子。该启动子具有增强基因表达的功能。另一方面，本发明还提供了一种新型的提高玉米籽粒维生素E含量的方法。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。
在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。
本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。
在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。
在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
实施例1具有增强基因表达效果的启动子
本发明采用CN113061602A专利公开的方法对VTE4基因的启动子区域进行饱和突变。其中靶标序列如CN113061602A专利中的表1所示。玉米基因编辑受体选用自交系KN5585。在设计的25个靶标中任意3个临近靶标组合所形成的16种不同的基因编辑技术方案，共获得了235份基因编辑材料。
表1 VTE4启动子基因编辑方案
通过测定各种不同的靶标区域的编辑后玉米中VTE4基因的表达量以及维生素E(以α生育酚/总生育酚指标衡量)含量，发明人意外发现T21、T22、T23三个靶标组合编辑后获得的一个玉米材料中的VTE4基因表达量和种子(或称籽粒)中的维生素E含量(α生育酚/总生育酚)均提高了。具体结果如表2所示。
表2基因表达量和维生素E含量提升的编辑材料信息
VTE4基因表达量和种子(或称籽粒)中的生育酚含量的测定方法如下：
1、VTE4基因表达量检测，具体步骤如下。
取苗期叶片组织的样品至少三个生物学重复，用于RNA提取，提取方法用RNA提取试剂盒Quick RNA isolation Kit(Huayueyang,China)。提取过程中加入DNA酶去除基因组DNA，随后利用反转录试剂盒cDNA Synthesis kit(TransGen Biotech,China)将RNA反转录为cDNA，得到20μL cDNA，一般可稀释至50μL,然后利用Bio-Rad CFX96 real-time system(Bio-Rad,USA)仪器进行实时定量PCR来检测每个样品中该基因的表达量，引物为55qp-1。每个样品含有三个技术重复，且将ZmActin(GRMZM2G126010)作为内参用2-ΔΔCt方法校正基因的表达量(引物为5’-TACGAGATGCCTGATGGTCAGGTCA-3’和5’-TGGAGTTGTACGTGGCCTCATGGAC-3’)，VTE4基因表达量鉴定的引物对为5’-GTACTACCTCCCGGACTGG-3’和5’-CTGGATCATTAGCGGCATCAC-3’。
2、生育酚含量鉴定，具体步骤如下。
(1)磨粉。将烘干的种子取～2.0g(～6-8粒)用Retsch公司(Haan,Germany)MM400球磨仪配合原装25mL钢瓶及12mm钢珠磨成粉末(～90sec)，并存于自封袋避光保存于干燥器中，尽快提取。
(2)称样。用万分之一天平称取0.5-0.6g玉米粉，置于30mL螺口玻璃离心管中，并记录质量。
(3)组织软化。在样品中加入6mL含0.1％ BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)的无水乙醇，拧紧盖子，涡旋20sec。
(4)加热。85℃水浴15min，期间每隔5min取出涡旋一次(共2次)，第一次取出时，加入120μL 80％氢氧化钾溶液皂化。
(5)萃取。水浴完成后，立即将样品瓶放入冰中，加入3mL预冷的双蒸水和3mL正己烷，拧紧盖子，涡旋20sec，2700r/min离心5min；用5mL移液器取上清至另一新的螺口玻璃离心管中；重复以下步骤3次：加3mL正己烷、涡旋20sec、2700r/min离心5min、用移液器取上清至洁净的螺口玻璃离心管中。最终上清体积约为12mL。
(6)清洗。在含上清液的新螺口玻璃离心管中加3mL预冷的ddH2O、涡旋20sec、2700r/min离心5min、用移液器移取上层(正己烷层)至15mL尖底玻璃管中；然后，在第二套螺口玻璃离心管中加入2mL正己烷，涡旋20sec，2700r/min离心5min，吸取上层清液至尖底玻璃管中。
(7)吹干。用低温真空离心浓缩仪干燥尖底玻璃管中总的正己烷相，设置仪器15℃，约需2h。
(8)溶解。准确加入1mL流动相(乙腈：含有三乙胺<TEA>和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚<BHT>的甲醇3:1)溶解样品，用1mL注射器混匀并吸取全部液体，通过0.22μm PTFE(聚四氟乙烯)材质过滤器将液体加入2mL棕色样品瓶中。
(9)检测。样品用Waters公司(Milford,MA,USA)的UPLC检测，所用色谱柱为Waters公司的BEH C18色谱柱(粒径1.7μm，2.1×100mm)，检测波长为295nm。采用等度洗脱，流速为0.3mL/min，上样量为10μL。流动相A：乙腈(75％体积)，流动相B：甲醇(25％体积)，每250mL甲醇含有0.5mL TEA和0.028g的BHT。每个样品运行10分钟。
(10)含量计算。手动积分得出对应峰面积(出峰时间参照标样)。根据标准曲线算出样品中生育酚含量，并用称量质量校正。
测定VTE4基因表达量和维生素E含量提高的这个材料中靶标区域的编辑后序列，发现M191864A003a在T21到T23区域的序列发生了变化。M191864A003a编辑后的启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2使用新型启动子提高玉米籽粒维生素E含量
玉米籽粒中的维生素A原、维生素E和油份是对人类健康和动物生长发育有益的重要品质性状。VTE4基因是影响维生素E的重要基因(Li Q,Yang X,Xu S,Cai Y,Zhang D,HanY,et al.Genome-Wide Association Studies Identified Three IndependentPolymorphisms Associated withα-Tocopherol Content in Maize Kernels[J].2012,PLoS ONE 7(5):e36807.)。VTE4基因在B73参考基因组中的编号为Zm00001d017746。
由于SEQ ID NO.1所示的启动子具有增强基因表达的效果，因此可以利用该启动子驱动VTE4基因提高玉米籽粒中的维生素E含量。具体包括：
(1)将M191864A003a编辑植株含有SEQ ID NO.1所示的启动子、VTE4基因、VTE4基因终止子所构成的表达盒，可以通过常规杂交授粉的方式转育到其他玉米材料或玉米品种中，从而获得籽粒维生素E含量提高的玉米新种质。
(2)还可以人工合成SEQ ID NO.1所示的启动子、VTE4基因(SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5)、VTE4基因终止子，或其他常见终止子(如nos、CaMV polyA等)所构成的表达盒，并通过转基因的方式将上述表达盒整合到玉米基因组中，从而获得籽粒维生素E含量提高的玉米新种质。
本实施例人工合成了SEQ ID NO.1所示的启动子、VTE4基因CDS序列(SEQ IDNO.5)、和nos终止子(SEQ ID NO.3)，并构建到pCAMBIA3301骨架载体上，该载体携带CAMV35S-bar表达盒以用于遗传转化时的筛选标记。将载体通过电击法转入农杆菌菌株EHA105中，PCR鉴定筛选阳性克隆。以新鲜剥离的1mm左右的玉米自交系KN5585的幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/LBialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤组织转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
按实施例1中所述的方法鉴定转基因植株中的维生素E含量，发现α-生育酚/总生育酚数值比对照提升了近1倍，表明这种方法能够有效提升玉米籽粒中的维生素E含量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种启动子，其特征在于：所述启动子序列如SEQ ID NO.1所示。
2.表达盒，其特征在于：由权利要求1所述的启动子、编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子、SEQ ID NO.3所示序列的终止子顺序连接而成；任选地，所述编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
3.一种提高玉米籽粒中维生素E含量的方法，其特征在于：包括如下任一种：
(1)使用基因工程手段同时靶向修改SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的玉米基因组区域序列，选择玉米籽粒中维生素E含量提高的植株；
(2)将含有权利要求2所述的表达盒插入玉米基因组，选择玉米籽粒中维生素E含量提高的植株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的基因工程手段采用CRISPR/Cas9基因编辑方法。
5.一种提高玉米籽粒中维生素E含量的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)能够同时识别SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示靶标序列的RNA分子；
(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述RNA的载体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的RNA分子为SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11所示序列的组合。
7.权利要求1所述的启动子在增强基因表达中的应用。
8.权利要求2所述的表达盒、权利要求3-4任一项所述的方法、权利要求5-6任一项所述的试剂盒在提高玉米籽粒中维生素E含量中的应用。
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