CN112646015B - 改变玉米开花期的基因及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子遗传学领域。具体涉及改变玉米开花期的基因及方法。本发明提供了一个控制玉米开花期基因的序列，且公开了利用基因工程手段突变该基因以改变开花期的方法。本发明还提供了开花期改变的玉米突变基因序列，该突变基因序列可以用来改良玉米开花期性状。

Description

改变玉米开花期的基因及方法
技术领域
本发明属于分子遗传学领域。具体涉及控制玉米花期的基因及其在改变玉米花期性状方面的应用。本发明提供了一个控制玉米花期基因的序列，且公开了利用基因工程手段突变该基因以缩短花期的方法。本发明还提供了花期缩短的玉米突变基因序列，该突变基因序列可以用来改良玉米花期性状。
背景技术
在高等植物中，开花代表着从营养生长到生殖生长的转换过程，其在植物体的整个生长发育阶段中具有重要的作用。而何时开花这一生物性状则受到植物体自身遗传因子及外界环境因素的双重作用。在这双重作用的影响下，一系列开花诱导过程在高等植物中具有普遍的规律，即植物体叶片通过感受外界生长条件(光照，温度，湿度等)，在适宜的时间产生成花物质(或叫开花素florigen)，成花物质经过输导组织由叶片运送到茎尖生长点，刺激顶端分生组织成花。
开花期是作物进化和适应过程中的重要性状，理解作物开花期性状的遗传基础、克隆候选基因可以提高作物的环境适应能力和可塑性，这对培育适应不同生态区的优良作物品种具有重要的意义，同时也将促进产量等与开花期密切相关的重要生产性状的遗传改良进程。
CCT(CO、COL和TOC1)家族基因广泛参与植物花期的调控过程，对植物的生长与发育起着至关重要的作用。玉米B73参考基因组中共有53个具有CCT结构的基因，申请人之前利用一个由368份玉米自交系组成的关联群体，定位到34个与玉米开花有关的CCT类基因(金敏亮.玉米泛转录组的构建及玉米开花抑制因子ZmCOL3的功能解析[D].湖北：华中农业大学，2018；Jin M,Liu X,Jia W,et al.ZmCOL3,a CCT gene represses flowering inmaize by interfering with the circadian clock and activating expression ofZmCCT[J].J Integr Plant Biol.,2018,60(6):465-480.)，其中的大部分基因尚没有具体的功能鉴定研究结果，因此具体哪些基因会确实地控制玉米开花性状尚不完全清楚。如果想要更加精准的改变玉米花期，需要具体明确究竟哪些基因会控制玉米花期性状以及这些基因进行了基因工程操作后对花期性状产生了什么程度的变化。
为解决上述问题，本发明利用基因编辑技术对这34个基因中的15个基因进行了突变，通过表型鉴定获得能够影响玉米开花期性状的基因和突变基因，并提供了人工改变玉米花期的方法。这些基因和方法可以用于人工调控玉米花期，培育适应不同生态环境的玉米新材料。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一个控制玉米花期性状的基因序列。
本发明的目的之二在于公开一种改变玉米花期的方法。
本发明的目的之三在于提供一个改变玉米花期性状的突变基因。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种玉米基因在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1序列为GRMZM2G095727基因在玉米自交系B73中的基因组序列。
本发明还提供了一种提早玉米开花期的方法，其特征在于：抑制玉米中上述基因编码蛋白的表达和/或活性，选择玉米开花期提早的植株。
在一些实施方案中，上述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入、物理或化学诱变中任一种。
在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
在一些实施方案中，上述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种用于提早玉米开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；
(2)所述sgRNA的编码DNA分子；
(3)表达所述sgRNA的载体。
本发明还提供了一种玉米开花期提早的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.6所示。
通过基因编辑突变靶基因可以得到很多不同的编辑类型，这些不同的编辑类型所对应的植株表现并不是完全一样的。本发明经过筛选鉴定，确定SEQ ID NO.6所示的突变基因能够使玉米开花期适度提早。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制早花玉米新品种。
本发明还提供了用于检测上述突变基因的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列或其互补序列。
本发明还提供了上述引物对在检测上述突变基因中的应用。利用上述引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，并测序分析扩增产物序列，如果扩增产物测序后序列与SEQ ID NO.6所示序列的部分序列一致，则待测样品中包含上述突变基因。
本发明的优点及有益效果如下：本发明利用关联群体定位到34个与玉米开花期性状有关的CCT类基因，然而并不知道这些候选基因中具体哪些基因会确实地控制玉米开花性状以及对开花期性状的影响程度。本发明利用基因编辑技术对这34个基因中的15个进行了突变，通过表型鉴定确定GRMZM2G095727确实能够影响玉米开花期性状。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法可以改变玉米开花期，编辑后的突变基因能够用于创制早花玉米新品种。本发明为人工调控玉米开花期以培育适应不同生态环境的玉米新材料提供了新的基因和方法。
附图说明
图1基因编辑载体图。各元件英文及缩写含义列举如下：
RB T-DNA repeat T-DNA右边界重复序列
M13 fwd M13引物序列(正向)
p000204_1F 靶标gRNA序列
Ubi promoter 泛素启动子
3×FLAG 标签序列
SV40NLS 猿猴病毒40核定位信号
Cas9 cas9基因序列
Nucleoplasm in NLS 核定位信号
NOS terminator 胭脂碱合成酶终止子
lac promoter 乳糖启动子
M13 rev M13引物序列(反向)
lac operator 乳糖操纵子
CAP biding site CAP结合位点
CaMV35S promoter(enhanced) 增强的花椰菜花叶病毒35S启动子
BlpR 编码Bar蛋白赋予植物具有草铵膦耐性
CaMV35S polyA single 花椰菜花叶病毒35S多聚腺苷酸序列
LB T-DNA repeat T-DNA左边界重复序列
Kan R 卡那霉素抗性序列
Ori 起始区序列
Bom 骨架区序列
pVS1 RepA pVS1复制子
pVS1 StaA pVS1转录起始区
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。
在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。
本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。
在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。
在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
实施例1基因编辑敲除候选基因后鉴定玉米开花期的变化情况
本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对关联分析结果显示的与玉米开花期相关的34个基因中的15个基因进行定点编辑。
实施方式包括基因编辑载体的构建、玉米的遗传转化以及编辑效果的功能验证。具体如下：
1、基因编辑载体的构建
本发明的基因编辑载体为G08943-CPB-ZmUbi-hspCas9，其载体图如图1所示。该载体的基础载体为CPB-ZmUbi-hspCas9。本发明通过OverlapPCR获得双靶U6-sgRNA进而通过同源重组克隆到基础载体中，具体的构建流程如下：
(1)U6启动子的克隆。从B73中克隆U6启动子。
(2)靶标gRNA的设计。将受体材料B73参考基因组序列输入http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行靶标设计。
(3)通过Overlap PCR获得U6-sgRNA。引物对U6F1/U6R用于扩增第一个靶标的U6启动子，产物长度为515bp；引物对gR-1F(3F)/gRR1用于扩增第一个靶标的sgRNA，产物长度为127bp；引物对U6F1/gRR1用于进行Overlap PCR第2步扩增(U6-sgRNA)，产物长度为634bp。Overlap PCR第1步分别扩增U6和sgRNA，PCR产物分别稀释50倍后混合作为模板进行Overlap PCR第2步扩增。扩增产物电泳切胶回收并测序确认序列。Overlap PCR体系和条件如下：Overlap PCR第1步的15μL的反应体系如下，模板DNA(U6或sgRNA，≥30ng/μL)：0.5μL，Primer F/R：各1.2μL，灭菌ddH2O：3.7μL，2×phanta max Buffer：7.5μL，dNTP mix：0.6μL，Phanta酶(产品编号：P505-d1/d2/d3)：0.3μL。Overlap PCR第2步的反应体系为30μL体系。U6吸1μL，加49μL ddH2O稀释；sgRNA吸1μL，加49μL ddH2O稀释各吸10μL，混匀。具体如下：混合模板DNA(U6+sgRNA)：1.5μL，Primer F/R：各2.4μL，灭菌ddH2O：6.9μL，2×phanta maxBuffer：15μL，dNTP mix：1.2μL，Phanta酶：0.6μL。Overlap PCR程序如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃30秒，(3)62℃35秒，(4)72℃30秒，第(5)步是从(2)步－(4)步循环32次，(6)72℃10分钟，(7)25℃5分钟。载体构建所需的引物序列见表1。
表1载体构建所需的引物序列
Figure BDA0002910574500000091
(4)通过重组克隆构建到骨架载体。将CPB-Ubi-hspcas9载体用HindIII消化，回收。通过同源重组将U6-gRNA和载体二者连接。配反应液前保证各Overlap产物浓度接近一致，20μL的同源重组体系如下：Cas Hind III：3μL，T-1F Overlap：1μL，灭菌ddH2O：10μL，5×CE MultiS buffer：4μL，Exnase MultiS(产品编号：C113-01/02)：2μL。
2、玉米遗传转化
将载体通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米自交系KN5585(未米生物科技(江苏)有限公司选育的自交系)的幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
3、基因编辑植株的性状鉴定
对获得的基因编辑材料的开花期性状进行鉴定，发现这些基因中，有的编辑后确实能够造成玉米开花期的显著改变，而有些基因编辑后不能观察到明显的开花期变化，具体的变化方式见表2。
表2各基因编辑后的开花期变化情况
Figure BDA0002910574500000101
实施例2玉米开花期性状的深入分析和突变基因的鉴定
对开花性状有变化的基因编辑材料进行更深入的性状鉴定，并分析具体的编辑位点。GRMZM2G095727这个基因编辑后，T0代材料的玉米开花期比受体对照KN5585提早。对这个转化体的T1代材料的开花期进行更深入地鉴定，并分析具体的编辑位点。
GRMZM2G095727这个基因编辑时设计的靶标位点有两个，分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。含有这两个靶标的载体所表达的gRNA序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示。
提取苗期DNA检测基因编辑情况。设计引物，引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示。扩增靶标编辑区段，扩增体系为：DNA：3μL，双向引物各1μL，2×TaqMix：7.5μL，ddH2O：2.5μL，总体积10μL。PCR反应条件如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃40秒，(3)57℃30秒，(4)72℃60秒，(5)从(2)步－(4)步循环35次，(6)72℃7分钟，(7)4℃保存。PCR产物交由武汉擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。将转化株与受体KN5585的PCR扩增测序结果进行比较，发生碱基替换、插入或缺失的材料即为阳性编辑材料，否则为阴性材料。
序列比较后发现只有1种编辑类型的材料，该材料的两个靶点都发生了突变，导致两个靶点之间删除了5897bp(表3)。因此，编辑后，A1材料的基因序列由SEQ ID NO.1变为SEQ ID NO.6。
表3基因编辑玉米材料的花期性状数据
Figure BDA0002910574500000111
“＝”表示删除序列，方框表示PAM序列，下划线表示编辑靶标。
2018年、2020年夏季以及2019年冬季分别在吉林省和海南省的试验地调查A1材料的开花期性状(包括抽雄期、散粉期、吐丝期)，结果如表4所示。A1已编辑的材料比未编辑的对照材料的花期均有明显的提早，证明该基因控制花期性状，基因编辑后花期提前。
表4基因编辑玉米材料的花期性状数据
Figure BDA0002910574500000121
花期数据以平均值±标准差表示，单位：天。“CK”表示未编辑的对照材料。“**”表示与对照相比有极显著差异(P<0.01)；“*”表示与对照相比有显著差异(P<0.05)。
因此SEQ ID NO.6所示的突变基因能够使玉米开花期适度提早。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制早花玉米新品种。
在导入的过程中，利用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列的引物对可以检测玉米基因组中是否含有上述突变基因，用该引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，如果扩增产物大小为256bp，则包含SEQ ID NO.6所示的突变基因；如果扩增产物大小为6153bp则为未编辑的基因型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 华中农业大学；吉林省农业科学院；未米生物科技（江苏）有限公司
<120> 改变玉米开花期的基因及方法
<130> 1
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8997
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 1
ccactcctgt cctctcctct cctctccccg ccatttggct ccgaaccctc acaacagtgc 60
atcgtctctc ctgtccccgc catttggttc ggaactctcg cggcctcaac tcctcctcgt 120
catcgtaaca cccacgctta ggtgcgcacc gcgccctctg ctgcggctac gggagctagc 180
tcgtgaattc aactcttttt tcatattttt ttaattcatt tagctgcctt tttctgtgtt 240
gtttctgcgg cagagttcgt gagggtcgcc cccaggggat ctcgagacgt ccgtttccaa 300
gagtggaccg gctcgcaggc gctgctgtta ccttgggtgg aggcaagttg gaattgcgat 360
gtttgtttgc ttcacagcct ttttccttct aaagttttgc tctgacgagg tctacttatc 420
cttttgctct atatttagct cggacctgcg gatcagttgg attctcaagg gagacggtgg 480
tttctgattt cctttctcta agcataccaa atcctttgtc tcgtactgcc tcaaatctct 540
attgtcggtt ttgtatgcgg ggaacttcgt acacgatcct tatcatatga gctgttttaa 600
tgtttcgcag gagtcgggag caactggttt tgggcgtcgc ggagcacatg gcttaagaat 660
aatttcttcc agcccggcga caagtgagcc tcgctacaat tagtcctctc tcgctctcac 720
cgatactgca gaatggagta gcttattctg agcatctgtt atgctcatga cagatcggtg 780
tttgattcct gtgtgttttc cctgcagatt cgcagttgga ttcagcatat gcatttttta 840
tgctgacata ggatgtgctc aaccatccgt ggactccctc tagttgcaca aaccacctca 900
gtgctctctc tttcttcgaa tcgggctaat aatgggcagt gcttgccaag ctggcacaga 960
cgggccttcc cgcaaggatg tgttagggat agggaatgcc gccttagaga atggccacca 1020
tcaggctgaa gctgacgcag atgaatggag ggaaaaggaa gaggacttgg ccaacaacgg 1080
gcacagtgcg ccaccgccag gcatgcagca ggtggatgag cataaggagg aacaaagaca 1140
aagcattcac tgggagaggt tcctacctgt gaagacactg agagtcttgc tggtggagaa 1200
tgatgactct actcgtcagg tggtcagtgc cctgctccgt aagtgctgct atgaaggtac 1260
gcgctgcaaa tggtaaagct aatttgattt gatttttctc tcgcatcaaa caggagagct 1320
gcaatcatta tatactaaga agaaactaat ttgattttat taaattggtc atatactcgg 1380
ttgctggttt cataacttct actagatagc agtatcatgg attgttaact tgtgtatatt 1440
gcaattgctg ctgcaaaaaa aggattatgg ttttattggg tacttttaaa attgaccaca 1500
gttcaaacat caacttgaca ccaacctata tatagaatga tgttgatctg atttaatctc 1560
tatagcaaac aattatgtgg aatatcggtg ttcctttagt gaaacaaggt tctcaatggt 1620
gaatgtaact gtcttggtgc atcaatcgat tggtgtggta gacatgctca atcttgatta 1680
tattatacgt ttatgtatgc atgggaatgc tttataggta caacagggac taatttgatt 1740
catctgactc tctcgtcaca tatttggacg gaaatggttc cccctgcttg aattttcaaa 1800
atagtcccct ctcccactgt ggcaggcctg agagatgtca tgtctcacct agtacagctc 1860
catagcatct taggtataca ctgatccata ttatgccaga ccgcctgtct cagctgcagc 1920
aggggcggat acaagccccg ggccacccgg tccgtggccc ggggcatgat ccatatgtct 1980
ctagtcacat ttattgtttt acactagagt atattggaag aatattatat ccaatagacc 2040
ggcccaggcc gtgatcggat cctggatctg cccctgagct gcagtgagta gtttgctggg 2100
caatctgctg tgaattggga gcttggtggg tggggtgttg cagtatgttt gcactctggg 2160
tagcctgagc attgctaccc tgtggtacac acataatgtg acaagtactg actgcactat 2220
aggattgaca agtcatctca tgggcctact gtggtgggcc aatggaattt cttttgcaat 2280
agcaagggct ggctattttc attttaacaa aaccagggtc tagagatcaa gagtgtcaca 2340
tcatcaacaa acagtgaata atcttgcaac atatggaagg tggaatgctg cagtagtcaa 2400
ttgaggatct ggatcaattt ggctctttta tatgtcctac gcttagttgt tggataaatt 2460
gcttaatgcc ttattgtttt tttgtactag tgagcaaaca tattccactt aatttgttta 2520
tatgtctacg gtagcttaac atgttccaag caaacatatt aattattgtt gactagtact 2580
agcatcatgt tactgtacag tccactttgc attggcaaga agtaacgatt atttctatct 2640
tctacttgca ctggattttg tttcttagaa acttgtggca tacagaattg tgaatttaag 2700
cttgtacatt tcccttttct atcatatgag catcaaaaga acatattcta tttgacaacg 2760
tagatgctag ctattttttc tatttgacaa cagaaaatgg tactctttct tgtgggtcat 2820
tttgttagtt tgtttattct tggacaaata ggtagttagg tacacaaata gaactgcctg 2880
tgttaaaatc atttcaccct gactcgaaaa gcaaagcttg aaaactatga tacatcaaag 2940
catgactttg tgtgatacat ataaggtggt gtttgaatgc aggtggctaa attttagtcc 3000
cgtcacggat gtttggatgt tagttagaag tattaaatat agtgtaatta caaaactaat 3060
tacacatgtg aggactaaac gacaagacaa acttgttaag cctaattagt tcatgattca 3120
ctcatgtgat ctacagtaaa catttgccaa tcatggatta attaggatta ttaaattagt 3180
ttcattattt agtcttcatt tgtataatta gtttcataat tagaataata tttaatactc 3240
gtaattggca ttcaaacatc cgatgttcgc ttttaaattg gctctttgag ggcggattgt 3300
tgtgaaacgg actaaactaa aaaactttag ttagtacaac caaacacctc ataagacaag 3360
tgacatgcat gtatactatt aaattaatag catccatgca gctgctttgt gctaggttgc 3420
attaagactt taatatttta agttgtttat agaacttttt ttgtcttgat aatggttgaa 3480
agcaatgcat ctgaagggat ttgacttaga ttgaacttga actgtgtagc ctcccaccgt 3540
caccaagtta gaaatacacc tctcctcacc tagtttgtta tacacaaact accagttctt 3600
gtggtacttc agattttggg taaacacaca ctgcataatt ttttcatgta aattcataaa 3660
tatttaaagg acagacccgg tgctggtggc ttccacatga gtggggtcta tggaagaaat 3720
agccgaggca agcgttaccc ctgcattttg cagagaggct gcatggaacc caggaccttt 3780
ggctcagtga aaatgcttct caccattgtg ccaggcttca tggatatttg aaatgtagac 3840
tttaggctag ctccagcaag ggaccctaaa aggttctgta ccctaaatat agaggatcaa 3900
atggtcatct atgctctcca gcagcgtcct ctaaacggtc ctctaaattt agaggactct 3960
gctggattct ctatatatag agtttctcta aacggtcttc tatccatttg aatactttaa 4020
ataaccggtt tagcaaaact aaaatatgta caatacattt gagagtatga caaatacgta 4080
cgtacaaaaa ataaaaataa aaaatgtctc taatatagat atttgagtat agaggacgtt 4140
gttggagagg aaggagatat agaggatgaa atcttttaga gaagactgta aatgacggat 4200
atagaggatg gatatagagg acgttgttgg agacaacctt atacttgatg tatttggtga 4260
tatggccaat gttttttttt atgttatgtc cctgtttgat tatgtttgat tgttaattat 4320
tagcagtgga aatttgtatc tatcatcatc taaaaaaggg taattttagt tgtttcagtg 4380
ttctgacagc aatcctatct ccttccattt tagttattcc tgctgaaaat ggtttgcatg 4440
catggcgata tcttgaagat ctgcagaaca acatcgacct tgtattgact gaggttttca 4500
tgccttgtct atctggtatc ggtctgctta gcaaaatcac aagtcacaaa atttgcaaag 4560
acattcctgt gattagtaag tagatttcct caactaccct aatgcacgtg aaattttatc 4620
ttgttaattg ttgggtttaa atacttttag ctgctacact gatgtgtttt gcatgcagtg 4680
atgtctacga atgattctat gagtatggtg tttaagtgtt tgtcgaaggg agcagttgat 4740
ttcttggtaa aaccactacg taagaatgag cttaagaacc tttggcagca tgtttggagg 4800
cgatgccaca gtgtaagctg tttgtttttg gtctagtttt ttctggatat tttattccac 4860
gaaacatgag gcgtgatttc tttgagtcct cactgtgttt cctttgtgat cactctgagt 4920
tgaatttgcc tctttggtac tcagtccagt ggaagtgaaa gtggcatcca gacacagaag 4980
tgtgccaaac taaatactgg cgacgagtat gagaacggca gtgacagcaa tcatgatgat 5040
gaagaaaatg atgacggcga cgatgacgac ttcagtgttg gactcaatgc tagggatgga 5100
agtgacaatg gcagtggtac tcaagtatgt gtccatttac tgttcctaat accttcttaa 5160
tctaacataa tgtagttgga tttgaatgtg tgtgtttcta tatatatata taaaataaag 5220
gttagtggta gagtactgca agcaaagttt atatcatctt aggtataaag gttagttatt 5280
ctatgatata tctggacata ttatattaaa tagccaattt acatatagta ataccacaat 5340
tagactatct ccagcagctt acccatctcc atccccatat tcaaactcca ctctgcgaac 5400
aatgcagtgt acaatgcaga acggtgcaaa acaatgtttt aggtaaccac ataggtaaac 5460
tgctagacac ggtctttatg taggaagata aaagttattt attgctttca ttcaaaataa 5520
ttcacttggt ggcaatcttt atttctcaga aaagtaatat attgtctgat aattctctct 5580
atgtgtagag tttttatgtc aatgtattat cgagtgcaca atctgtttca aaatgcagag 5640
ctcatggaca aagcgtgctg tggagattga cagcccacaa cctatatctc ccgatcaact 5700
agttgatcca cctgatagta catgtgcaca agtaattcac cctagatcag agatatgcag 5760
taacaagtgg ttaccgacag caaacaaaag gaatgtcaag aaacagaagg agaataaagg 5820
tatatgctcc acactccaca gcattcatca tatagaagtg aagcatttca cagttcttcc 5880
actattgtct cattcaacca aattccatgt ttttacagat gaatctatgg gaagatactt 5940
aggaataggt gctcctagga actcaagtgc agaatatcaa tcatctctca atgatgtatc 6000
tgttaatcca atagaaaaag gacatgagaa tcacatgtcc aaatgcaaat ctaaaaagga 6060
aacaatggca gaagatgatt gtacaaacat gcctagtgca acaaatgctg aaactgctga 6120
tttgattagc tcaatagcca gaaacacaga aggccaacaa gcagtacaag ccgttgacgc 6180
accagatggc ccttccaaaa tggctaatgg aaatgataag aatcatgatt ctcatatcga 6240
agtgacaccc catgagttgg gtttgaagag atcgagaaca aatggagcta cagcggaaat 6300
ccatgatgag cgaaatattc tgaaaagatc agatcagtca gccttcacca ggtgcaaaac 6360
ataatatcag tgtcattact aggttattaa cataacagta agttgcatgc taacccatta 6420
tgatttctgc aaggtaccat acatctgtgg cttccaatca aggtggagca agatatgggg 6480
aaagctcttc accacaagat aacagttctg aggccatgaa aacggactct acatgcaaga 6540
tgaagtcaaa ttcagatgct gctccaataa agcagggctc caatggcagt agcaataacg 6600
atgtgggatc cagtacaaag aatgttgctg caaggccttc gggtgacagg gagagagtag 6660
cgtcaccatt agccatcaaa tctacccagc atgcctcagc atttcatact atacagaatc 6720
aaacgtcacc agctaatctg attggggaag acaaagctga tgaaggaatt tccaatacag 6780
tgaaaatgag ccacccaaca gaggttccac aaggctgcgt ccagcatcat catcatgtgc 6840
attattacct ccatgttatg acacagaaac agccatcaac agaccgtgga tcatcagatg 6900
ttcactgtgg ttcgtcaaat gtgtttgatc ctcctgttga aggacatgct gcaaactaca 6960
gtgtgaatgg gggtgtctca gttggtcata atgggtgcaa tgggcagaat ggaagtagcg 7020
ctgtccccaa tattgcaaga ccaaacatag agagtattaa tggtaccatg agccaaaata 7080
ttgccggagg tggcattgta agtgggagtg ggagtggcaa tgacatgtat cagaatcggt 7140
tcctgcaacg agaagctgca ttgaacaaat tcagactgaa gcggaaagat cggaactttg 7200
gtaaaaaggt agcctgtttt cagttacatg cctgttgtag ctatgacttg aaatcagtaa 7260
tagttatttg agggttgaag ggccttccac ttaatatata aaagtaaggg tagggattca 7320
aatggtttgc acaattataa tcagaaaaaa gatagaagtg attattaata atctctacct 7380
ttggaggata taaaaatgct tatgctactt ccagctatgc cttttgtctt tttttagaaa 7440
aacttccagt tatgacttaa ttgttaatat tgacaatacc agtgtaggaa tactgaaatt 7500
agtcttgaaa gtaagacatt agttgctgct gtttgcgtga tggcccctag cttgaggata 7560
ctttgccgct actcttgcgg atgctttgcc gctccatgtc atctctagcg gacgctctgc 7620
tgtcgtgctg ctggatgttt gtctcgtctc ctctcagggg atgctctgcc actgcagtgt 7680
cttcgtcttt attggcaacc tggagttgat gtgcttttcc ttctgcaggt tcagtcggtt 7740
agattttagg tggagagtcc ttcttactgc attttctttc tctggttctt tgggtcggtt 7800
taggttgcta accacttctg tgcttttgta atatgggcga cggggtctct cagtagcttt 7860
gtcataaaac aattctactt ccccttaata tagtacatgt gactctgaca tgttatcgaa 7920
caaaaaaaaa cattgctcgc tctaaatttt atgagatctg gcatgatttc aaactattct 7980
tcttttcaaa atcctgtttt ctgactgcag tttttacaag attttatggt cttgccgctt 8040
catttttctg actgtttgca ttggaccgat accttctgat ggccttgtcc gcctattttc 8100
aggttcgcta ccaaagcagg aagaggcttg ctgagcagcg gccacgggtc cgaggacagt 8160
ttgtgcgaca atctgagcaa gaagatcaaa cagcgcaagg ttcagaaaga tgacacgtaa 8220
tttctaatac aacgtatcat cttcttcggc agatctgaga attaggcggt tcttcctatt 8280
gcgcatcttc gtcgacagat ctgagaatta agtggtcctt cccattgctg atagtagccc 8340
actgattccc aacgttagag tacacaataa ataagactct agttgtcaat ttctgtggtt 8400
gactgcagat gatcacccta gcgctatgga gtcaacaatg taatatttat atactatgtt 8460
cgtgccttgg cgccttggcg gtttgcaatc ttcagtttcc tttctgagag attcttggcc 8520
aagtgccttg aggaggagca aactagcagc gtcgccattg ctatattaat agctggaatc 8580
atgtagtagt agttcatcca ttcattcgaa gatcgtgttc caaatcaaca caagtagggg 8640
tttgcttctc ctctttccaa gaaaagtggt tgtagcgtga gatgcaaata ggtctcttgt 8700
gctagatcaa gctcaataaa ctttaggccg tgttaggcag ctgatctact tcaccaatgt 8760
ggcaaggcat tcgtcgtatt ctgttgacag aaacaaggtg ttcactgcac gggcatgccg 8820
cacgactcct cgcagatcaa aagagggaac acggcatgct tttaccaaaa ttattttcga 8880
ataacattgt gaggaacaga caataattaa cttcccaaaa cgtctcgcta tactggattt 8940
ttcgatgttg gattcgtaat cagatccttt tgacaataat tttcgtacat caggcat 8997
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 2
gggaatgccg ccttagagaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 3
ggatcatcag atgttcactg 20
<210> 4
<211> 103
<212> RNA
<213> unknown(人工合成)
<400> 4
gggaaugccg ccuuagagaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103
<210> 5
<211> 103
<212> RNA
<213> unknown(人工合成)
<400> 5
ggaucaucag auguucacug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103
<210> 6
<211> 3100
<212> DNA
<213> unknown(人工合成)
<400> 6
ccactcctgt cctctcctct cctctccccg ccatttggct ccgaaccctc acaacagtgc 60
atcgtctctc ctgtccccgc catttggttc ggaactctcg cggcctcaac tcctcctcgt 120
catcgtaaca cccacgctta ggtgcgcacc gcgccctctg ctgcggctac gggagctagc 180
tcgtgaattc aactcttttt tcatattttt ttaattcatt tagctgcctt tttctgtgtt 240
gtttctgcgg cagagttcgt gagggtcgcc cccaggggat ctcgagacgt ccgtttccaa 300
gagtggaccg gctcgcaggc gctgctgtta ccttgggtgg aggcaagttg gaattgcgat 360
gtttgtttgc ttcacagcct ttttccttct aaagttttgc tctgacgagg tctacttatc 420
cttttgctct atatttagct cggacctgcg gatcagttgg attctcaagg gagacggtgg 480
tttctgattt cctttctcta agcataccaa atcctttgtc tcgtactgcc tcaaatctct 540
attgtcggtt ttgtatgcgg ggaacttcgt acacgatcct tatcatatga gctgttttaa 600
tgtttcgcag gagtcgggag caactggttt tgggcgtcgc ggagcacatg gcttaagaat 660
aatttcttcc agcccggcga caagtgagcc tcgctacaat tagtcctctc tcgctctcac 720
cgatactgca gaatggagta gcttattctg agcatctgtt atgctcatga cagatcggtg 780
tttgattcct gtgtgttttc cctgcagatt cgcagttgga ttcagcatat gcatttttta 840
tgctgacata ggatgtgctc aaccatccgt ggactccctc tagttgcaca aaccacctca 900
gtgctctctc tttcttcgaa tcgggctaat aatgggcagt gcttgccaag ctggcacaga 960
cgggccttcc cgcaaggatg tgttagggat agggaatgcc gccttagatg tggttcgtca 1020
aatgtgtttg atcctcctgt tgaaggacat gctgcaaact acagtgtgaa tgggggtgtc 1080
tcagttggtc ataatgggtg caatgggcag aatggaagta gcgctgtccc caatattgca 1140
agaccaaaca tagagagtat taatggtacc atgagccaaa atattgccgg aggtggcatt 1200
gtaagtggga gtgggagtgg caatgacatg tatcagaatc ggttcctgca acgagaagct 1260
gcattgaaca aattcagact gaagcggaaa gatcggaact ttggtaaaaa ggtagcctgt 1320
tttcagttac atgcctgttg tagctatgac ttgaaatcag taatagttat ttgagggttg 1380
aagggccttc cacttaatat ataaaagtaa gggtagggat tcaaatggtt tgcacaatta 1440
taatcagaaa aaagatagaa gtgattatta ataatctcta cctttggagg atataaaaat 1500
gcttatgcta cttccagcta tgccttttgt ctttttttag aaaaacttcc agttatgact 1560
taattgttaa tattgacaat accagtgtag gaatactgaa attagtcttg aaagtaagac 1620
attagttgct gctgtttgcg tgatggcccc tagcttgagg atactttgcc gctactcttg 1680
cggatgcttt gccgctccat gtcatctcta gcggacgctc tgctgtcgtg ctgctggatg 1740
tttgtctcgt ctcctctcag gggatgctct gccactgcag tgtcttcgtc tttattggca 1800
acctggagtt gatgtgcttt tccttctgca ggttcagtcg gttagatttt aggtggagag 1860
tccttcttac tgcattttct ttctctggtt ctttgggtcg gtttaggttg ctaaccactt 1920
ctgtgctttt gtaatatggg cgacggggtc tctcagtagc tttgtcataa aacaattcta 1980
cttcccctta atatagtaca tgtgactctg acatgttatc gaacaaaaaa aaacattgct 2040
cgctctaaat tttatgagat ctggcatgat ttcaaactat tcttcttttc aaaatcctgt 2100
tttctgactg cagtttttac aagattttat ggtcttgccg cttcattttt ctgactgttt 2160
gcattggacc gataccttct gatggccttg tccgcctatt ttcaggttcg ctaccaaagc 2220
aggaagaggc ttgctgagca gcggccacgg gtccgaggac agtttgtgcg acaatctgag 2280
caagaagatc aaacagcgca aggttcagaa agatgacacg taatttctaa tacaacgtat 2340
catcttcttc ggcagatctg agaattaggc ggttcttcct attgcgcatc ttcgtcgaca 2400
gatctgagaa ttaagtggtc cttcccattg ctgatagtag cccactgatt cccaacgtta 2460
gagtacacaa taaataagac tctagttgtc aatttctgtg gttgactgca gatgatcacc 2520
ctagcgctat ggagtcaaca atgtaatatt tatatactat gttcgtgcct tggcgccttg 2580
gcggtttgca atcttcagtt tcctttctga gagattcttg gccaagtgcc ttgaggagga 2640
gcaaactagc agcgtcgcca ttgctatatt aatagctgga atcatgtagt agtagttcat 2700
ccattcattc gaagatcgtg ttccaaatca acacaagtag gggtttgctt ctcctctttc 2760
caagaaaagt ggttgtagcg tgagatgcaa ataggtctct tgtgctagat caagctcaat 2820
aaactttagg ccgtgttagg cagctgatct acttcaccaa tgtggcaagg cattcgtcgt 2880
attctgttga cagaaacaag gtgttcactg cacgggcatg ccgcacgact cctcgcagat 2940
caaaagaggg aacacggcat gcttttacca aaattatttt cgaataacat tgtgaggaac 3000
agacaataat taacttccca aaacgtctcg ctatactgga tttttcgatg ttggattcgt 3060
aatcagatcc ttttgacaat aattttcgta catcaggcat 3100
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown(人工合成)
<400> 7
cgtggactcc ctctagttgc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown(人工合成)
<400> 8
cgctacttcc attctgccca 20

Claims (5)

1.一种提早玉米开花期的方法，其特征在于：抑制玉米中SEQ ID NO.1所示序列基因编码蛋白的表达和/或活性，选择玉米开花期提早的植株；
所述抑制蛋白表达和/或活性的方法采用基因编辑方法；
所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法；
所述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
2.一种用于提早玉米开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
(2)所述sgRNA的编码DNA分子；
(3)表达所述sgRNA的载体。
3.一种玉米开花期提早的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.6所示。
4.用于检测权利要求3所述突变基因的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示的序列。
5.权利要求4所述的引物对在检测权利要求3所述突变基因中的应用。
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