CN108484741B - 一种控制作物籽粒粒重的蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制作物籽粒粒重的蛋白及其应用，属于植物遗传育种领域。本发明提供的蛋白是玉米中的qHKW1‑9蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或氨基酸序列具有与SEQ ID NO.1所示序列至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少89％或至少92％序列相似度的蛋白。进一步地，本发明公开了编码上述蛋白的核酸，以及包含该核酸的表达盒、表达载体、宿主细胞及其在提高作物籽粒粒重中的应用。

Description

一种控制作物籽粒粒重的蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种控制作物籽粒粒重的蛋白及其应用，属于植物遗传育种技术领域。

背景技术

玉米高产是单位面积穗数、穗粒数和粒重三个产量要素协调发展的结果，其中粒重是决定产量的最后一个因素，而且由于粒重的降低无法得到另外两个产量要素的补偿，因此在高产育种中具有意义。因此，对玉米粒重遗传机制的剖析不仅有助于理解玉米产量遗传基础，而且对玉米高产遗传改良具有重要的现实意义。

玉米粒重性状的遗传基础备受关注，尽管国内外许多科学家已对玉米粒重进行了大量QTL定位研究，但大部分已初定位的粒重QTL遗传稳定性差，受环境稳影响较大，对粒重贡献率低，难以利用。据统计目前玉米中已公布的QTL共有1735个，其中粒重相关QTL有145个(maizeGDB，http：//www.maizegdb.org)。而玉米中许多籽粒发育必需的基因均是通过突变体克隆到的，这些基因发生突变之后籽粒粒重或胚和胚乳的发育严重受到影响(Li J，FuJ，Chen Y，et al.，The U6 Biogenesis-Like 1 plays an important role in maizekernel and seedling development by affecting the 3′end processing of U6 snRNA[J].Mol Plant，2017.10(3)：470-482；Qi W，Tian Z，Lu L，et al.，Editing ofmitochondrial transcripts nad3 and cox2 by Dek10 is essential formitochondrial function and maize plant development[J].Genetics，2017.205(4)：1489-1501；Liu Y J，Xiu Z H，Meeley R，et al.，Empty pericarp5 encodes apentatricopeptide repeat protein that is required for mitochondrial RNAediting and seed development in maize[J].Plant Cell，2013.25(3)：868-883.)。

近年来，研究人员利用候选基因关联分析的方法，鉴定到了与玉米产量显著相关联的基因。异戊烯转移酶(IPT)是调控细胞分裂素合成的重要酶，Weng等通过候选基因关联分析发现玉米中ZmIPT2编码区的一个SNP(单核苷酸多态性，single nucleotideploymorphism)在三个环境中都与百粒重显著关联，这个SNP会引起编码的脯氨酸(Pro)转变为丝氨酸(Ser)，从而引起该基因编码的蛋白质的酶活力发生改变(Weng J，Li B，Liu C，Yang X，Wang H，Hao Z，Li M，Zhang D，Ci X，Li X，Zhang S.A non-synonymous SNPwithin the isopentenyl transferase 2 locus is associated with kernel weightin Chinese maize inbreds(Zea mays L.).BMC Plant Biol，2013，13：98.)。Li等利用同源克隆的方法，克隆了玉米中与水稻GS3、GW2同源的基因ZmGS3、ZmGW2-CHR4和ZmGW2-CHR5，并利用关联分析的方法对这三个基因中的自然变异是否同样影响玉米籽粒性状进行了研究，结果发现ZmGS3与粒长和百粒重相关联；ZmGW2-CHR4与百粒重显著关联；ZmGW2-CHR5在多个环境中与籽粒长、宽、厚、百粒重这四个性状中的至少一个显著关联(Li Q，Yang X，BaiG，Warburton ML，Mahuku G，Gore M，Dai J，Li J，Yan J.Cloning and characterizationof a putative GS3 ortholog involved in maize kernel development.Theor ApplGenet，2010，120：753-763；Li Q，Yang X，Warburton ML，Bai G，Dai J，Li J，YanJ.Relationship，evolutionary fate and function of two maize co-orthologs ofrice GW2 associated with kernel size and weight.BMC Plant Biol，2010，10：143.)。

玉米粒重的遗传主要以加性效应为主，且粒重由多个微效基因共同控制，单个QTL的效应值相对较小，对粒重的贡献率较小，导致精细定位相对困难，所以粒重相关主效QTL直接应用于育种实践的难度较大。本发明提供了一个通过精细定位克隆的、影响玉米粒重的主效QTL基因qHKW1，这一基因对粒重的贡献率很大，可以直接应用于育种实践。利用该基因编码的蛋白质及其他功能同一性蛋白可以改良作物粒重性状，培育高产亲本/品种。

发明内容

本发明提供了一种可以用来控制作物籽粒粒重的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或者，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有与SEQ ID NO.1所示的序列相同功能的序列。

在又一方面，上述蛋白还包括氨基酸序列具有与SEQ ID NO.1所示序列至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少89％或至少92％序列相似度的蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.15中的任意一个所示。

在又一方面，本发明还提供了一种核酸，其特征在于，上述核酸编码上述的蛋白；在一些实施方案中，所述核酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

在又一方面，本发明还提供了基因表达盒，其特征在于，含有权利要求3所述的核酸序列；在一些实施方案中，所述核酸与ubi启动子和nos终止子可操作地连接。

在又一方面，本发明还提供了表达载体，其特征在于，所述载体含有上述表达盒；在一些实施方案中，所述载体还包含ubiquitin：bar：CaMV35S polyA表达盒

在又一方面，本发明还提供了宿主细胞，其特征在于，包含上述表达载体；在一些实施方案中，所述宿主细胞为植物细胞或原核生物细胞；在一些实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌细胞。

在又一方面，本发明还提供了产生转基因作物的方法，其特征在于，用上述表达载体或上述宿主细胞转化作物，得到转基因作物。

在又一方面，本发明还提供了产生转基因种子的方法，其特征在于，从上述方法产生的转基因作物产生转基因种子。

在又一方面，本发明还提供了上述蛋白、核酸、基因表达盒、表达载体、宿主细胞、方法在提高作物籽粒粒重上的应用。在一些实施方案中，所述作物为玉米。

附图说明

图1郑58和SK的表型差异及qHKW1的初定位。(A)郑58和SK的穗子差异；(B)郑58和SK的籽粒差异；(C)qHKW1在郑58×SK的RIL群体中的初定位结果。纵轴表示LOD(检测限，limit of detection)值，横轴表示第1染色体的位置。qHKW1在多个环境及BLUP(最佳线性无偏预测法，Best Linear Unbiased Prediction)中均可以被定位到。

图2 pZZ-qHKW1载体图。各元件英文及各缩写含义列举如下：

T-border(right) T-DNA区右边界序列

Ubiquitin promoter 玉米泛素启动子

qHKW1-9 qHKW1-9基因

Nos 胭脂碱合成酶终止子

Ubiquitin promoter 玉米泛素启动子

BAR 耐除草剂草铵膦bar基因

CaMV35S ployA 花椰菜花叶病毒35SpolyA终止子

T-Border(left) T-DNA区左边界序列

kanamycin(R) 卡那霉素抗性序列

pBR322ori pBR322起始区

pBR322bom pBR322骨架区

pVS1rep pVS1复制子

pVS1sta pVS1转录起始区

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。

“转基因”是指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。

“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。

阴性或对照植物可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm(热力学熔点)可以近似自Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

在一些实施方案中，本发明对玉米自交系郑58和SK构建的RIL(重组自交系，Recombinant Inbred Lines)群体的粒重性状进行多个环境调查，通过QTL检测鉴定到一个新的粒重性状主效QTL。该QTL位于chrl：27.5 Mb-44.0Mb区间，其对粒重表型解释率为12.84％，加性效应为0.24mm(表1)。利用分子标记进一步将其精细定位于大小为600kb的区间内，该区间包含9个基因，只有qHKW1-9基因是可以表达蛋白的，因此，qHKW1-9基因是QTL位点qHKW1的主效基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明在明确玉米qHKW1-9基因编码蛋白功能的基础上，提供了高粱、谷子、黍、粳稻、籼稻、短花药野生稻、节节麦、大麦、二穗短柄草等植物中的同一性蛋白，它们与qHKW1-9蛋白的氨基酸序列相似度至少在81％、82％、83％、84％、85％、89％或92％，且都属于leucine-rich repeat receptor-like serine/threonine-protein kinase类型的蛋白，因此这些蛋白与qHKW1-9蛋白具有潜在的功能同一性。

进一步地，本发明公开了一种改良植物粒重性状的方法，即通过基因工程技术在植株内表达qHKW1-9蛋白序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)或氨基酸序列与SEQ IDNO.1所示序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、89％或92％相似度的蛋白质(SEQ IDNO.7-15)，可得到粒重显著提高的植株。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell DW，Molecular cloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 玉米qHKW1-9基因的定位

郑58和SK是两个玉米中自交系，其中郑58果穗大、籽粒多、籽粒大且重、产量高，而SK果穗小、籽粒少、籽粒小且轻、产量低(图1A、B)。因此，通过构建郑58×SK的重组自交系(RIL)群体，对玉米籽粒性状进行初定位，发现在1号染色体短臂上有一个主效的QTL可以影响籽粒的粒重(粒重以百粒重性状指标衡量)(图1C)，将此QTL命名为qHKW1。根据多年多点的定位结果，此QTL可以在7个环境点检测到影响百粒重(图1C)，该QTL的候选区间为65～77cM，对应的物理位置区间长度为16Mb。在不同环境点，其最高LOD(检测限，limit ofdetection)值大小、效应值大小和解释的表型变异率(描述表型的变异程度)有所不同。粒重在7个环境定位的结果，其最高LOD值的变化范围为3.31～12.25，平均为7.27；加性效应值大小变化范围为0.70～1.62g，平均为1.19g；解释的表型变异率变化范围为4.61～17.90％，平均为12.76％(表1)。

qHKW1的初定位结果表明此QTL非常稳定，可以在多个环境点起作用；但是在不同环境点中，最高LOD值、加性效应值大小和解释的表型变异率均有较大幅度的变化，表明此QTL会受到环境的影响。qHKW1是一个主效的QTL，其在6个环境中对百粒重的表型解释率大于10％(R²＞10％)，这一结果暗示qHKW1在玉米产量的遗传改良育种中有着重要的应用价值。

表1 qHKW1初定位结果

注：BLUP：最佳线性无偏预测法，Best Linear Unbiased Prediction；LOD：检测限，limit of detection。

继续进行此主效QTL的精细定位。郑58×SK的RIL群体中有一个剩余杂合材料-HZAU1348，此杂合材料覆盖qHKW1的整个候选区间，杂合区段较大，因此用覆盖在qHKW1的LOD值最高bin的分子标记对材料进行基因型鉴定，这些分子标记覆盖了4Mb的区间。首先对此QTL进行确认时所用的群体是来自于同一个穗子的F2纯合子代，通过比较了纯合基因型材料之间表型的差异，发现与两亲本基因型一致的纯合材料之间表型差异明显(P＝0.04)。

接着播种杂合材料，筛选重组单株，并对筛选到的重组单株进行繁种，收获F2之后，随机挑选双亲类型的纯合基因型果穗3到5个播种，用F3纯合基因型材料进行后代测验，检测同一个杂合重组单株分离出来的F3子代是否有无表型差异。根据后代测验的结果，当ID02(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)和M48(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)之间的基因型为纯合时，后代测验发现百粒重并无显著差异；反之，ID02和M48之间基因型为杂合时，后代测验发现百粒重差异显著。因此，qHKW1被定位到ID02与M48之间，这一候选区间为600Kb大小。

根据精细定位的结果，qHKW1被定位到600Kb大小的区间内，根据玉米B73参考基因组V2版本(5b.60)的注释，这个区段内有9个基因，将从qHKW1-1到qHKW1-9依次编号。分析公开发表的基因表达谱数据(Walley J W，Sartor R C，Shen Z，et al.Integration of omicnetworks in a developmental atlas of maize[J].Science，2016，353(6301)：814.)，结果显示，只有qHKW1-2和qHKW1-9有蛋白表达，且qHKW1-9在籽粒中有蛋白产物而qHKW1-2没有，因此qHKW1-9是此QTL的候选基因。

实施例2 qHKW1-9蛋白功能及其同一性蛋白

分析qHKW1-9基因编码的蛋白序列发现，该基因共编码1个氨基酸(序列如SEQ IDNO.1所示)，该蛋白属于leucine-rich repeat receptor-like serine/threonine-protein kinase蛋白。进一步利用BLASTP工具在NCBI数据库中(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析发现，qHKW1-9蛋白在其他植物中存在同一性蛋白，这些蛋白与qHKW1-9蛋白序列相似度极高、且都属于leucine-rich repeat receptor-like serine/threonine-protein kinase类型的蛋白。这些蛋白来自于高粱、谷子、黍、粳稻、籼稻、短花药野生稻、节节麦、大麦、二穗短柄草等植物，它们与qHKW1-9蛋白的氨基酸序列相似度至少在81％、82％、83％、84％、85％、89％或92％(表2)，氨基酸序列如SEQ ID NO.12-20所示。这说明这些其他植物中的蛋白与qHKW1-9蛋白具有潜在的功能同一性。

表2 qHKW1-9蛋白的功能同一性蛋白

实施例2 利用qHKW1-9蛋白增加玉米粒重

qHKW1-9基因通过参与玉米分生组织的发育途径，进而调控玉米籽粒的粒重，因此可以通过增强qHKW1-9基因的表达量增加玉米qHKW1-9蛋白的含量，从而在其他性状不变的情况下增加玉米的粒重，最终实现玉米单株产量的提高。

通过将qHKW1-9基因连接ubiquitin启动子和nos终止子，构建ubiquitin：qHKW1-9：nos表达盒，进而构建表达载体pZZ-qHKW1。由于ubiquitin启动子具有增强基因表达的作用，因此ubiquitin：qHKW1-9：nos表达盒具有产生qHKW1-9蛋白的功效。

pZZ-qHKW1载体可以增加qHKW1-9蛋白的含量。

pZZ-qHKW1载体的构建过程为：

(1)以玉米自交系SK亲本DNA作为模板，用引物qHKW1-9-OE-F(SEQ ID NO.16)和qHKW1-9-OE-R(SEQ ID NO.17)扩增qHKW1-9的基因全长；

(2)用限制性内切酶AscI对基础载体进行酶切，利用同源重组克隆的方法，将qHKW1-9基因连入载体；

(3)连入载体后，分别用qHKW1-9特异性的引物(SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17)筛选阳性克隆，选取测序正确的阳性克隆进行遗传转化。

pZZ-qHKW1载体图谱如附图2所示。该载体的T-DNA区域包含ubiquitin：qHKW1-9：nos的表达盒，该表达盒的主要作用为表达qHKW1-9蛋白；此外，该载体的T-DNA区域还包含ubiquitin：bar：CaMV35S polyA表达盒，该表达盒的主要作用为表达抗草铵膦除草剂的PAT蛋白，可用于组织培养阶段的筛选标记并在获得转基因植株后利用除草剂喷施筛选得到含有ubiquitin：qHKW1-9：nos表达盒的阳性植株。

利用农杆菌介导方法将pZZ-qHKW1载体转入农杆菌EHA105。遗传转化的步骤如下：

(1)将载体通过电击法转入农杆菌菌株EHA105的宿主细胞中，利用PCR方法进行鉴定；

(2)以新鲜剥离的1mm左右的自交系C01玉米幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2ml塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；

(3)吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天；

(4)共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/LBialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周；

(5)将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周；

(6)再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；

(7)将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；

(8)将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，期间喷施除草剂草铵膦(商品名保试达，拜耳科学公司生产的18％草铵膦水剂)并进行PCR检测筛选得到20个阳性转基因植株，3-4个月后收获T₀转基因种子。

收获阳性T₀代种子后种植T₁代转基因植株，收获T₁代种子并对其百粒重性状进行考察分析。结果发现超表达qHKW1-9基因的阳性单株表达量显著高于阴性单株(表3)，阳性单株百粒重显著高于阴性单株(表3)。因此，利用基因工程手段产生qHKW1-9基因编码的蛋白可以提高作物的籽粒粒重，进而具有增产的潜力。

表3转基因植株的百粒重性状表现

注：A和B表示同列数据差异极显著(P＜0.01)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种蛋白在提高玉米籽粒粒重上的应用，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种核酸在提高玉米籽粒粒重上的应用，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的蛋白。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.基因表达盒在提高玉米籽粒粒重上的应用，其特征在于，所述的表达盒含有权利要求2或权利要求3中所述的核酸；所述的核酸与ubiquitin启动子和nos终止子可操作地连接。

5.表达载体在提高玉米籽粒粒重上的应用，其特征在于，所述载体含有权利要求4中所述的表达盒。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述载体还包含ubiquitin：bar：CaMV35SpolyA表达盒。

7.宿主细胞在提高玉米籽粒粒重上的应用，其特征在于，包含权利要求5或权利要求6中所述的表达载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的宿主细胞为原核生物细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述原核生物细胞为大肠杆菌或农杆菌细胞。

10.提高玉米籽粒粒重的方法，其特征在于，在所述玉米中增加氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示蛋白的表达和/或活性。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，用权利要求5-6任一项中的表达载体或权利要求7-9任一项中的宿主细胞转化玉米，得到转基因玉米，筛选籽粒粒重增加的玉米。

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