CN111153974A

CN111153974A - 玉米抗病基因和分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111153974A
Application number: CN202010042670.5A
Authority: CN
Inventors: 赖志兵; 王宏泽; 候甲宝
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2020-05-15
Also published as: CN113121664A; WO2021143587A1

Abstract

本发明涉及玉米大斑病、南方锈病、灰斑病的抗性基因ZmMM1，源于大刍草的抗病单倍型qLM^C117和与之连锁的分子标记M2及其在筛选和培育玉米大斑病或南方锈病或灰斑病抗性品种中的应用，属于分子遗传学领域。本发明公开了玉米大斑病、南方锈病、灰斑病抗性基因ZmMM1，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑SEQ ID NO.9任意一个所示；所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3任意一个所示。同时，本发明还公开了一个源于大刍草的抗病单倍型qLM^C117(SEQ ID NO.5)以及与其紧密连锁的分子标记M2(SEQ ID NO.10)以及该标记的检测引物对(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)和检测方法。进一步地，本发明提供了利用分子标记筛选培育玉米大斑病、南方锈病、灰斑病抗性品种的方法。

Description

玉米抗病基因和分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及玉米大斑病、南方锈病、灰斑病的抗性基因ZmMM1，源于大刍草的抗病单倍型qLM^C117和与之连锁的分子标记M2及其在筛选和培育玉米大斑病或南方锈病或灰斑病抗性品种中的应用，属于分子遗传学领域。

背景技术

玉米是我国重要的粮食和饲料作物，除此之外，还是医疗、化工和酿造等许多行业的不可或缺的原料，在我国国民经济中发挥重要的作用。近些年来，随着玉米种植面积的不断扩大增多和耕作模式的改变，玉米叶部病害的发生呈现愈发严重的趋势。

玉米南方锈病是玉米生产上普遍发生的真菌性病害，严重影响玉米的产量和品质。在高温和高湿的环境下，玉米南方锈病极易爆发，造成玉米减产20％-30％，严重的时候产量损失大于80％，甚至绝收(刘骏，马青，于凯等.我国玉米南方锈病发生区域和玉米品种田间抗性的研究.作物杂志，2009，2：71-74.)。南方锈病除了能侵染玉米，还能够对玉米的祖先大刍草，甘蔗的少数品种以及三个摩擦禾品种造成侵害(Renfro,R.B.1998.Southernrust.InC.Casela,R.B.Renfro,and A.F.Krattiger(ed.)Diagnosing maize diseases inLatin America.No.9–1998.EMBRAPA,Brazil.)。此外，由于锈病病原菌的多样化，南方锈病的类似病原菌可在多种作物中引发锈病危害，例如，禾柄锈病(Puccinia giaminis)引起小麦和其他小粒作物的秆锈病；条形秆锈病(Puccinia striiformis)引起小麦，大麦和黑麦的条锈病；高粱柄锈病(Puccinia sorghi)引起玉米普通锈病；多堆柄锈病菌(PucciniaPolysora)引起南方玉米锈病；黑顶柄锈菌(Puccina melanocephala)引起甘蔗锈病；单胞锈病属(Uromyces)引起豆科植物锈病(U.appendiculatus)(George N.Agrios.,2005.Plant Pathology:Fifth Edition.Elsevier Academic Press)。

灰斑病是由玉蜀黍尾孢菌(Cecrospora zeae-maydis Tehon&Daniels)引起的真菌病害，又被称为玉米尾孢菌叶斑病。如今已成为危害玉米生产的主要病害之一，在我国西南地区尤为严重。

玉米大斑病是由真菌大斑突脐蠕孢菌(Exserohilum turcicum)引起的世界玉米种植区域的流行病害，可以对玉米的产量造成中等到严重损失。大斑病是我国东北、华北和西南春玉米区的主要病害，以东北春玉米区最为严重。近年来，我国东北春玉米主产区的大斑病发病率大幅上升，根本原因在于主栽玉米品种的大斑病抗性较差且种植品种过于单一，且已严重影响了玉米产量。

选育和推广抗病的优良品种，是玉米性状改良的重要目标之一，也是防治玉米大斑病、南方锈病、灰斑病最经济有效的手段。克隆主效和微效的抗病基因，可以为分子标记辅助育种打下良好的基础，也会加速玉米抗病育种的进程。然而，如今在玉米中发现的玉米大斑病、南方锈病、灰斑病的抗性等位位点和基因所带来的抗病性提升是十分有限的。

作为现代栽培玉米的祖先，大刍草中存在着很多优异的遗传资源，能够为玉米很多性状的遗传改良工作带来突破性的进展。

不同作物的抗病基因进行转移，是物种之间抗性转移的一个非常有效的手段，进而能使物种产生广谱的抗病性。因此，大刍草或玉米抗病基因的克隆，不仅为玉米抗病育种提供了良好的资源，丰富抗病基因库，而且也为其他作物抗病育种工作提供基因资源和思路，加速整个作物抗病育种的步伐。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一个具有玉米大斑病或南方锈病或灰斑病抗性的主效基因ZmMM1的核酸序列及其编码的氨基酸序列。

本发明的目的之二在于提供了一个源于大刍草的抗病单倍型qLM^C117以及与其紧密连锁的分子标记M2。

本发明的目的之三在于公开一种利用M2分子标记鉴定和筛选玉米大斑病或南方锈病或灰斑病抗性材料的方法。

本发明的目的之四在于公开一种提高作物抗病性的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种蛋白，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任意一个所示；或所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任意一个所示的序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有与SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的序列相同功能的序列。

本发明还提供了一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码上述的蛋白；在一些实施例中，上述核酸的核苷酸序列或互补序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.9任意一个所示。

本发明还提供了一种分子标记，其特征在于，所述标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示序列或部分序列或上述序列的互补序列。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定植物抗病性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)检测待测材料上述的分子标记；(2)如果检测结果为包含上述标记，待测材料将表现抗病性状；如果检测结果为不包含上述标记，待测材料将表现感病性状；在一些实施例中，所述的分子标记的检测方法采用PCR扩增；在一些实施例中，所述PCR扩增采用的引物对由引物F和引物R组成；所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；在一些实施例中，所述的包含上述标记的表现为PCR扩增出447bp大小的条带。

本发明还提供了一种筛选具有抗病性状的植物材料的方法，其特征在于，按照上述的方法检测待测材料上述的分子标记，筛选包含上述分子标记的材料。

本发明还提供了上述蛋白、核酸、分子标记、方法在植物抗病育种中的应用；在一些实施例中，所述的植物为玉米；在一些实施例中，所述的抗病性为玉米大斑病或南方锈病或灰斑病中的任意一种抗性。

与现有的技术相比，本发明的有益效果是，本发明提供的ZmMM1基因及其编码的蛋白具有提高玉米大斑病、南方锈病、灰斑病抗性的功能，这是之前的公开资料中未报道的。本发明在大刍草中鉴定的qLM^C117单倍型能够显著提升玉米对玉米大斑病、南方锈病、灰斑病的抗性。本发明开发出的功能性分子标记M2与qLM^C117单倍型紧密连锁，能够鉴定qLM^C117单倍型是否存在，也能从玉米群体中特异地鉴定出具有不同抗病性表现的单倍型。qLM^C117单倍型和M2分子标记能够用来对玉米品种的抗病性进行改良，从而获得高抗玉米大斑病、南方锈病、灰斑病的玉米品种。

附图说明

图1 C117和Mo17的抗病斑点表现。A：穗位叶抗病斑点表型；B：红框部位的DAB染色结果。

图2抗病斑点的表型评级图例。从左到右依次为1-5级。按照抗病斑点所占叶片比例定级。1级：0％-5％；2级：5％-10％；3级：10％-20％；4级：20％-30％；5级：30％-50％。

图3 qLM的精细定位。A：qLM位点在玉米第7染色体上的位置；B：各重组类型材料的抗病斑点表型评级；C：ZmMM1基因结构及在Mo17和C117中的差异。I-VI表示不同的重组类型；M1-M5表示定位时用到的标记；n表示单株数。

图4抗病斑点的表型评级图例。A：点状病害(玉米南方锈病)；B：斑状病害(玉米大斑病或灰斑病)。按照抗病斑点所占叶片比例定级。1级：0％-10％；3级：10％-20％；5级：20％-40％；7级：40％-70％；9级：70％-100％。

图5 qLM基因近等基因系NIL-C117和NIL-Mo17的抗病表现。A：玉米大斑病；B：玉米南方锈病；C：玉米灰斑病。

图6 ZmMM1突变体抗病表现。A：玉米大斑病；B：玉米南方锈病；C：玉米灰斑病。

图7 ZmMM1基因瞬时表达对烟草叶片产生坏死的表现。A：4种载体瞬时表达后烟草叶片展示，圆圈内为不同载体表达区域；B：4种瞬时表达载体的表达盒构件示意图。

图8 M2标记的检测效果。A：M1～M5标记与抗病性的连锁程度，以与qLM重组的频率表示；B：M2标记检测玉米群体的结果，Hap_R和Hap_S为玉米群体中存在的两种有抗性差别的单倍型；C：M3标记检测玉米群体的结果，Hap1和Hap2为玉米群体中存在的两种单倍型，带型上不能与C117中的qLM单倍型进行区分。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。

“转基因”是指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。

“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。

阴性或对照植物可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm(热力学熔点)可以近似自Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“关联”。

本文所用术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群或子代中)，具有与表型性状的差异表达关联的至少一个等位基因的多态基因座。QTL能够通过单基因机制或多基因机制发挥作用。

本文所用术语“QTL定位”指采用类似单基因定位的方法将QTL定位在遗传图谱上，确定QTL与遗传标记间的距离(以重组率表示)。根据标记数目的不同，可分为单标记、双标记和多标记几种方法。根据统计分析方法的不同，可分为方差与均值分析法、回归及相关分析法、矩估计及最大似然法等。根据标记区间数可分为零区间作图、单区间作图和多区间作图。此外，还有将不同方法结合起来的综合分析方法，如QTL复合区间作图(CIM)多区间作图(MIM)、多QTL作图、多性状作图(MTM)等。

本文所用术语“分子标记”指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

本文所用术语“主效基因”指由单个基因决定某一性状的基因称为主效基因，本文所述术语“微效基因”指对于同一性状的表型来讲，几个非等位基因中的每一个都只有部分的影响，这样的几个基因称为累加基因或多基因。在累加基因中每一个基因只有较小的一部分表型效应，所以又称为微效基因。

本文所用术语“自交系”指在人工控制自花授粉情况下，经若干代，不断淘汰不良的穗行，选择农艺性状较好的单株进行自交，从而获得农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的系。

本文所用术语“回交”指子一代和两个亲本的任一个进行杂交的方法。

本文所用术语“杂交”或“杂交的”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。

本文所用术语“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。初始杂交产生F₁代；然后，术语“BC₁”指轮回亲本的第二次使用，“BC₂”指轮回亲本的第三次使用等。

本文所用术语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10％(即在基因图谱上的分离频率不超过10cM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90％的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低、优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。

厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。1cM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。

“有利等位基因”是在特定位点的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如提高的玉米抗病性，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记的“有利”等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。

“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。就每个基因图谱而言，基因座之间的距离通过它们间的重组频率进行测量，并且基因座之间的重组可使用多种标记进行检测。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的顺序和遗传距离可能不同。然而，使用常见标记的通用框能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的基因座。

“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。

“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。

“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。

术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。

“种质”指个体(例如植株)、一组个体(例如植株品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。

“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。对于用于检测重组的标记，它们需要在被监测的种群内检测差异或多态性。对于分子标记，这意味着DNA水平的差异是由于多核苷酸序列差异(例如SSR、RFLP、FLP和SNP)。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件或转座因子的存在和序列。分子标记可来源于基因组或表达的核酸(例如EST)，并且也可指用作探针或引物对的核酸，所述引物对能够通过使用基于PCR的方法扩增序列片段。

对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同工酶标记检测、通过等位基因特异性杂交进行的多核苷酸多态性检测(ASH)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记基因座而言是多态的。

“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多邻接核苷酸(“所有或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。

如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或两侧为标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。作为另一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，例如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，插入区域是关于无插入的植株的多态性。因此，标记仅需要指明插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定此类杂交标记，例如SNP技术。

本发明从一个大刍草渗透系群体中鉴定到一个具有抗病斑点表型的材料C117，并进一步利用C117和Mo17构建的遗传群体重组中图位克隆到影响该抗病斑点表型的QTL——qLM，该位点位于第7号染色体上。进一步地精细定位将区间锁定在5Kb区间，该区间包含1个编码基因ZmMM1。烟草瞬时表达实验证实C117和Mo17中的ZmMM1基因均能够产生抗病功能。含有来自C117的ZmMM1近等基因系具有更高的玉米大斑病、玉米南方锈病和玉米灰斑病抗性。

在一些实施方案中，本发明提供了C117和Mo17材料中的qLM区间的核苷酸序列，C117和Mo17材料中的ZmMM1基因编码区(CDS)核苷酸序列，以及参考基因组公布的B73材料中的ZmMM1基因组和转录本核苷酸序列，以及C117、Mo17、B73中ZmMM1基因编码的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了数量性状位点qLM或ZmMM1基因紧密连锁的分子标记M2，该标记与玉米大斑病、南方锈病、灰斑病抗性显著相关，序列如SEQ ID NO.10所示。本发明进一步开发了该分子标记M2的检测方法，同时公开了该标记用于鉴定或辅助鉴定玉米大斑病、南方锈病、灰斑病抗性性状的方法。利用qLM^C117单倍型和M2标记以及M2标记的鉴定方法，可以提高玉米对大斑病、南方锈病、灰斑病的抗性，例如，通过该标记筛选具有qLM^C117单倍型的玉米材料或种质，以该玉米材料或种质(如大刍草)作为亲本进行杂交或回交转育，进而利用该标记进行杂交群体或回交群体的分子标记辅助选择，以快速获得同时具有供体亲本的抗病性状和受体亲本或轮回亲本的遗传背景的优良亲本或种质，以进一步用于玉米抗病育种。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 qLM基因的定位

1、大刍草渗透系群体构建和C117抗病材料的获得。

为了更好地利用大刍草(Zea mays ssp.Mexicana)中的遗传资源，申请人将大刍草和玉米骨干自交系Mo17构建了一个大刍草渗透系群体(Yang N,Xu X W,Wang R R,etal.Contributions of Zea mays subspecies mexicana haplotypes to modern maize[J].Nat Commun,2017,8(1):1874.)。构建群体的步骤如下所述：首先利用大刍草的花粉授到玉米自交系Mo17的雌穗上；然后从F₁的群体中只挑选了一株与Mo17进行了回交；得到的BC₁群体再次与Mo17进行回交得到BC₂之后连续自交7代，得到BC₂F₇材料。

本发明在田间观察抗病斑点表型时，发现一个具有抗病斑点且不会导致整个叶片枯萎表型的材料，命名为C117。多年多点的种植中C117的表型表现非常稳定。从穗位叶的斑点表型可以看出，C117拥有着抗病斑点的表型，DAB染色证明斑点为ROS的积累(图1)。通常，由ROS积累导致的抗病斑点会使得植物的抗病性上升，因此本发明将对C117中的抗病基因进行定位克隆。

2、抗病基因的图位克隆。

为了定位克隆到C117中的抗病基因，本发明再次用Mo17和C117构建了一个克隆群体。群体构建过程如下：

(1)对Mo17和C117进行杂交构建F₁。

(2)F₁进行自交得到F₂，同时回交Mo17得到BC₁F₁。

(3)利用2136份F₂的单株进行了初定位，挑选出了30株没有表型的材料，以及27份极端表型的材料，进行BSR测序(转录组测序结合BSA)并分析，在7号染色体1～4M的范围内发现了一个主效QTL，命名为qLM；抗病斑点的表型以评级的方式进行统计，在田间主要统计穗位叶以及其上下各一片，总计三片叶的表型均值进行评级打分。评级的标准按照抗病斑点所占叶片的比例分类，从完全没有(1级)，到逐渐加重至几乎一半叶片被占满(5级)。抗病斑点的表型评级图例见图2。

(4)再利用回交得到的BC₁F₁群体，在7号染色体1～4M的范围内挑选杂合的重组单株，自交得到BC₁F₂，同时回交Mo17得到BC₂F₁。

(5)下一代种植各种重组类型的BC₁F₂进行子代检测，比较分析其中两种不同基因型的子代的抗病斑点表型是否有显著差异，来判断qLM是否位于该重组类型的杂合区段中；若该重组包含功能QTL，则利用对应构建的BC₂F₁进行回交，筛选更多的重组。

(6)通过重复以上步骤，本发明利用BC₄F₂群体将qLM定位在一个大约5Kb的范围内。通过参考基因组B73数据库(http://www.maizegdb.org/)的查询，发现该区段仅一个基因，命名为ZmMM1。基因定位结果见图3。B73数据库中ZmMM1的基因组序列如SEQ ID NO.6所示，cDNA序列如SEQ ID NO.7所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述定位过程使用了如下引物对检测分子标记，标记的位置见图3B。

M1：5’-TGGAAGTCCTGCCGATTGTC-3’/5’-GACAGGTTCTGCAGACGCAC-3’；

M2：5’-CGGTCTCTGTTGTGGGCTTT-3’/5’-ATGCTGGCGCCTTGATAGTC-3’；

M3：5’-ATGACGAGTTTTCACGTCCGA-3’/5’-CGTTCACGCGATTTTTCAAGTG-3’；

M4：5’-GCACCAATCTCCAGTTCTCCA-3’/5’-TCCGTGCGTGTTACTGAGTT-3’；

M5：5’-TTCCTCAGGGAGTTGTGTGC-3’/5’-CCAAGCTGGTACCGAGTTCTT-3’；

分子标记检测采用如下的方法：

(1)玉米基因组DNA提取：

1.取玉米叶片1.5g左右于液氮中研磨，转入2mL离心管中。

2.加预热至65℃的CTAB提取缓冲液750μl，迅速混匀。在65℃水浴锅内水浴30分钟左右，中途不时小心柔和摇动2-3次离心管。

3.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，在摇床上摇动试管10分钟，直到溶液分层，下层为墨绿色，上层为浅黄色。

4.室温12000rpm离心10分钟，将上清转移到1.5mL离心管中。

5.向上清液中加入2/3体积预冷的异丙醇，小心混匀。放入-20度冰柜中放置30分钟。

6.然后4℃，12000rpm离心10分钟。

7.倒去上清液体，再加入1mL的75％乙醇，浸泡5分钟。再重复洗涤一次。然后将液体倒去，将离心管子放置30min，在常温吹干，加200μl水溶解DNA。

8.用1％琼脂糖检测DNA质量，并测定DNA浓度。DNA放置在-20℃冰箱备用。

(2)使用M2标记引物对的PCR体系和程序为：

PCR体系：

PCR程序：

(3)凝胶成像

1％琼脂糖凝胶上检测。

3、ZmMM1基因抗病功能的确认

图位克隆中使用的BC₄F₁材料再次回交Mo17并自交后，利用BC₅F₂材料再次验证了抗病结果。同时将BC₅F₂中两种纯合基因型的材料进行自交，得到BC₅F₃，成为两个近等基因系NIL-Mo17和NIL-C117。将NIL-Mo17和NIL-C117在海南南滨(玉米南方锈病发病区)，沈阳梨树(玉米大斑病发病区)，湖北巴东(玉米灰斑病发病区)进行了种植，观察两种NIL之间是否有抗性的差别。为了确保结果的准确性，本发明使用了两个来源不同的BC₅F₂来确认抗性。

病害的调查同样以评级的方式进行，在田间主要统计穗位叶以及其上下各一片，总计三片叶的表型均值进行评级打分。评级的标准按照病斑所占叶片的比例分类。病斑表型示意图见图4。

鉴定结果显示，NIL-C117(含有来自C117的ZmMM1近等基因系)比NIL-Mo17(含有来自Mo17的ZmMM1近等基因系)更抗玉米大斑病、玉米南方锈病和玉米灰斑病。两个材料的病斑表型见图5。病斑统计结果见表1。

表1近等基因系的抗病鉴定结果

-1和-2分别表示不同的株系.

由于ZmMM1基因过量表达会引起强烈的细胞坏死，没有办法通过构建超量表达转基因材料的方式来验证基因的功能，所以本发明使用了齐鲁师范学院构建的玉米自交系B73 EMS突变体来验证ZmMM1的功能。该突变体中ZmMM1基因第114位氨基酸对应的密码子TGG突变为TGA(W114*)，使得蛋白翻译提前结束。

结果显示，ZmMM1突变体比野生型玉米植株更感玉米大斑病、玉米南方锈病和玉米灰斑病。该结果说明ZmMM1基因正向调控玉米对玉米大斑病、玉米南方锈病和玉米灰斑病的抗病性。突变体的抗病表现见图6。

以上结果证明ZmMM1基因具有正向调控玉米对玉米大斑病、玉米南方锈病和玉米灰斑病的抗病性功能。来源于C117中的ZmMM1基因能够极大提高玉米对玉米大斑病、玉米南方锈病和玉米灰斑病的抗病性。

实施例2 ZmMM1的基因结构和分子标记位点

将C117和Mo17材料中M2-M3标记之间的序列进行测序分析，得到两个材料中qLM位点的核酸序列。具体为，取C117和Mo17材料的叶片，抽提基因组DNA。使用引物对5’-CGTTCACGCGATTTTTCAAGTG-3’和5’-CGGTCTCTGTTGTGGGCTTT-3’对进行组DNA进行PCR扩增，将得到的5kb左右的目标扩增产物进行测序。Mo17中的qLM核酸序列如SEQ ID NO.4所示，全长5006bp，以qLM^Mo17表示；C117中的qLM核酸序列如SEQ ID NO.5所示，全长5256bp，以qLM^C117表示。该区段包含ZmMM1基因的转录区以及下游3.5kb的区域(基因结构见图3C)。

两个亲本的qLM区段序列差异很多。为了探究是否是基因结构的差异导致了功能的不同，本发明通过烟草瞬时表达的方式检测Mo17和C117中的ZmMM1功能的差异。

由于qLM通过影响植物ROS的水平从而在不同NIL之间产生抗病斑点的表型，所以功能基因ZmMM1过量表达会产生ROS的大量积累，从而产生细胞坏死(这也是无法得到转基因过量表达材料的原因)。为了解决这一问题，本发明构建了烟草瞬时表达载体，用35S启动子分别驱动Mo17和C117中的ZmMM1基因编码区(CDS)序列，在同一片烟草叶片上进行农杆菌介导的瞬时表达。同时，由35S启动子驱动的绿色荧光蛋白GFP基因作为不会产生坏死的阴性对照，由35S启动子驱动的抗病基因Rp1-D21作为可以在烟草中产生坏死的阳性对照。瞬时表达载体的表达盒构件见图7B。所使用的ZmMM1^Mo17和ZmMM1^C117CDS序列分别如SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示，其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

从结果中可以看出，ZmMM1^Mo17和ZmMM1^C117均可以在烟草中产生细胞坏死(图7A)，证明Mo17和C117中的ZmMM1基因均具有抗病功能，且抗病效果没有表现出差异，说明qLM在Mo17和C117中产生不同抗性的原因是由区段内的其他调控序列引起，而不是基因编码蛋白本身。因此可以预期，ZmMM1基因及其编码的蛋白在表达适度的情况下能够具有抗病的功能并被用于培育抗病玉米品种。

实施例3 qLM^C117单倍型在玉米品种中的分布

为了检测抗性单倍型qLM^C117(SEQ ID NO.5)在玉米品种中的分布情况，本发明使用了图位克隆过程中所用的分子标记M2对大量现代玉米群体进行检测。检测所用的群体为一个由527份来自于世界各地的玉米自交系汇总成的关联群体(Yang X,Gao S,Xu S,etal.Characterization of a global germplasm collection and its potentialutilization for analysis of complex quantitative traits in maize[J].MolecularBreeding,2011,28(4):511-526.)。用M2标记引物(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)对该群体内所有材料的DNA进行了PCR扩增，之后用琼脂糖凝胶电泳检测，发现其中有362份材料可以扩增出条带。

M2标记引物能够在Mo17中扩增出大约139bp的条带，在C117中扩增出447bp的条带。其中C117扩增产物中第24-372位的核酸序列是一段特异性的序列(如SEQ ID NO.10所示)。在关联群体中，条带的类型可以分为两类：一种是与Mo17相同的100bp左右的条带(命名为Hap_R类型)，共计有254份材料；另一种是大于500bp的条带(命名为Hap_S类型)，该类条带也有着不同的大小，但均超过了500bp，共计有108份材料；没有材料与C117有着相同的条带大小。通过表型鉴定，发现这362份材料不具有和C117类似的抗病斑点。而且Hap_R单倍型材料相对Hap_S单倍型材料，对玉米大斑病，玉米南方锈病以及玉米灰斑病都有着更强的抗性。抗病鉴定结果见表2。

表2两种单倍型的抗病鉴定结果

以上结果表明，qLM^C117的单倍型可能在现代玉米中已经丢失，如果将qLM^C117的单倍型序列导入现代玉米品种中能够极大提高玉米品种的抗病性。

在图位克隆所用的分子标记M1-M5中，M2和M3标记重组率较低，与qLM位点紧密连锁，然而M3在关联群体种并不能特异性地检测出qLM^C117单倍型(图8)。因此M2标记是最优的可用于检测qLM^C117单倍型的标记。

M2标记和检测方法可以用于玉米大斑病、南方锈病、灰斑病抗性的分子育种，这都是本发明要求保护的范围。下面将详细地介绍检测M2分子标记的方法以及利用M2标记进行辅助选择将qLM^C117单倍型导入常规玉米品种中以培育抗病玉米品种。

实施例4利用qLM^C117单倍型培育抗病玉米品种的方法

本发明获得的M2分子标记可用于各种分子标记辅助选择的方法，将具有抗病性功能的qLM^C117单倍型通过杂交回交的方式从大刍草或含有qLM^C117单倍型的玉米材料中转育到其它玉米遗传背景中。大概的流程为：

杂交：以大刍草或含有qLM^C117单倍型的玉米材料与待改良亲本杂交获得F1种子；播种后获得F1植株，将F1植株与轮回亲本进行杂交，获得BC1种子。

BC1抗病基因型选择(前景选择)：播种BC1种子，获得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各单株叶片，提取DNA，利用相应标记检测引物对进行扩增、电泳，选取含有qLM^C117单倍型的单株继续种植。例如M2标记引物对(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)检测，能够扩增出含有447bp特异条带的为选定的材料。

回交和背景选择：采用一组(例如100个，或200个等)在供体和轮回亲本之间存在多态性的，且在基因组上均匀分布的分子标记(包括但不限于SSR、INDEL、SNP、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对从中选出的单株进行鉴定，选取与轮回亲本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中选率等)的材料；后续每次回交均可以采用相同的方法进行分子标记辅助选择，最终选出100％背景纯合的单株。

本发明选取了两个玉米品种Mo17和掖478进行了上述方式的抗病性遗传改良。从鉴定结果看，上述方法能够得到抗病性较好的改良品种。抗病鉴定结果见表3。

表3两个玉米品种抗病性改良的效果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 玉米抗病基因和分子标记及其应用

<130> 1

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 369

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 1

Met Gly Leu Asp Val Met Glu Ile Gly Met Gly Ala Asp Leu Ser Leu

1 5 10 15

Asp Leu Arg His Phe Ala Ser Lys Ala Val Arg Gln Ser Lys Asp Asp

20 25 30

Thr Pro Ala Pro Asp Met Asp Ala Cys Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu

35 40 45

Arg Gly Lys Ile Glu Met Phe Lys Arg Asp Leu Pro Leu Cys Ala Arg

50 55 60

Leu Leu Ala Asp Val Ile Asp Val Met Lys Glu Glu Ala Gly Lys Lys

65 70 75 80

Lys Thr Thr Thr Arg Arg Arg Ser Asp Arg Arg Leu Ala Ser Ala Ala

85 90 95

Ala Asp Asp Glu Glu Glu Glu Ala Asp Gly Ala Thr Ala Asp Lys Ser

100 105 110

Lys Trp Met Ser Thr Ala Gln Leu Trp Thr Gly Asp Ser Gly Arg Glu

115 120 125

Asp Ala Glu Ser Glu Lys Gln Asp Lys Gly Arg Cys Ser Pro Glu Ala

130 135 140

Arg Ser Arg Gly Ala Leu Leu Pro Phe Lys Ala Asp Val Gly Ser Gly

145 150 155 160

Ala Pro Ala Phe Ala Pro Leu Phe Leu Arg Thr Asp Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Ala Ala Arg Val Gly Val Pro Asp Leu Ser Ser Leu Leu Ser Pro Pro

180 185 190

Ala Thr Met Pro Pro Ala Asp Ala Gly Ala Glu Glu Ser Arg Arg Gln

195 200 205

Val Val Gly Phe Ala Gln Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ala Met Ala Pro

210 215 220

Ser Ala Pro Ala Leu Gly Leu Gln Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Ala Arg Lys Ala Arg Arg Cys Trp Ser Thr Glu Leu His Arg

245 250 255

Lys Phe Val Ala Ala Leu Asp Gln Leu Gly Gly Pro Gln Val Ala Thr

260 265 270

Pro Lys Gln Ile Arg Glu Leu Met Lys Val Asp Gly Leu Thr Asn Asp

275 280 285

Glu Val Lys Ser His Leu Gln Lys Tyr Arg Leu His Asn Arg Arg Ala

290 295 300

Pro Gly Ser Gly Val Val Arg Gln Pro Ile Val Leu Val Gly Gly Leu

305 310 315 320

Trp Ile Pro Gln Glu Gln Gly Ser Pro Gln Ser Gly Ser Pro His Gly

325 330 335

Pro Leu His His Leu Ser Thr Ser Val Ala Ala Val Ser Ser Ala Ala

340 345 350

Thr Ala Ser Cys Glu Glu Glu Asp Gly Arg Ser Glu Ser Tyr Gly Trp

355 360 365

Lys

<210> 2

<211> 365

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 2

Met Gly Leu Asp Val Met Glu Ile Gly Met Gly Ala Asp Leu Ser Leu

1 5 10 15

Asp Leu Arg His Phe Ala Ser Lys Ala Val Arg Gln Ser Lys Asp Asp

20 25 30

Thr Pro Ala Pro Asp Met Asp Ala Cys Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu

35 40 45

Arg Gly Lys Ile Glu Met Phe Lys Arg Asp Leu Pro Leu Cys Ala Arg

50 55 60

Leu Leu Ala Asp Val Ile Asp Val Met Lys Glu Glu Ala Gly Lys Lys

65 70 75 80

Lys Thr Thr Thr Arg Arg Ser Asp Arg Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ala

85 90 95

Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Ala Thr Ala Asp Lys Ser Lys

100 105 110

Trp Met Ser Thr Ala Gln Leu Trp Thr Gly Asp Ser Gly Arg Glu Asp

115 120 125

Ala Glu Ser Glu Lys Gln Asp Lys Gly Trp Cys Ser Pro Glu Ala Arg

130 135 140

Ser Arg Gly Ala Leu Leu Pro Phe Lys Ala Glu Val Gly Ser Gly Ala

145 150 155 160

Pro Ala Phe Ala Pro Leu Cys Leu Arg Thr Asp Asp Lys Ala Ala Ala

165 170 175

Ala Arg Val Gly Val Pro Asp Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Pro Ala

180 185 190

Thr Met Pro Pro Ala Asp Ala Gly Ala Glu Glu Ser Arg Arg Gln Val

195 200 205

Val Gly Phe Ala Gln Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ala Met Ala Pro Ser

210 215 220

Ala Pro Ala Leu Gly Leu Gln Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Arg

225 230 235 240

Lys Ala Arg Arg Cys Trp Ser Thr Glu Leu His Arg Lys Phe Val Ala

245 250 255

Ala Leu Asp Gln Leu Gly Gly Pro Gln Val Ala Thr Pro Lys Gln Ile

260 265 270

Arg Glu Leu Met Lys Val Asp Gly Leu Thr Asn Asp Glu Val Lys Ser

275 280 285

His Leu Gln Lys Tyr Arg Leu His Asn Arg Arg Ala Pro Gly Ser Gly

290 295 300

Val Val Arg Gln Pro Ile Val Leu Val Gly Gly Leu Trp Ile Pro Gln

305 310 315 320

Glu Gln Gly Ser Pro Gln Ser Gly Ser Pro His Gly Pro Leu His His

325 330 335

Leu Ser Thr Ser Val Ala Ala Val Ser Ser Ala Ala Thr Ala Ser Cys

340 345 350

Glu Glu Glu Asp Gly Arg Ser Glu Ser Tyr Gly Trp Gln

355 360 365

<210> 3

<211> 367

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 3

Met Gly Leu Asp Val Met Glu Ile Gly Met Gly Ala Asp Leu Ser Leu

1 5 10 15

Asp Leu Arg His Phe Ala Ser Lys Ala Val Arg Gln Ser Lys Asp Asp

20 25 30

Thr Pro Ala Pro Asp Met Asp Ala Cys Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu

35 40 45

Arg Gly Lys Ile Glu Met Phe Lys Arg Asp Leu Pro Leu Cys Ala Arg

50 55 60

Leu Leu Ala Asp Val Ile Asp Val Met Lys Glu Glu Ala Gly Lys Lys

65 70 75 80

Thr Thr Thr Thr Arg Arg Ser Asp Arg Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ala

85 90 95

Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Ala Thr Ala Asp Lys Ser Lys

100 105 110

Trp Met Ser Thr Ala Gln Leu Trp Thr Gly Asp Ser Gly Arg Glu Asp

115 120 125

Ala Glu Ser Glu Lys Gln Asp Lys Gly Arg Cys Ser Pro Glu Ala Arg

130 135 140

Ser Arg Gly Ala Leu Leu Arg Phe Lys Ala Asp Val Gly Ser Gly Ala

145 150 155 160

Pro Ala Phe Ala Pro Leu Cys Leu Arg Thr Asp Asp Lys Ala Ala Ala

165 170 175

Ala Arg Val Gly Val Pro Asp Leu Ser Ser Leu Leu Ser Pro Pro Ala

180 185 190

Thr Met Pro Pro Ala Asp Ala Gly Ala Glu Glu Ser Arg Arg Gln Val

195 200 205

Val Gly Phe Ala Gln Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ala Met Ala Pro Ser

210 215 220

Ala His Ala Leu Gly His Gln Ser Gln Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln

225 230 235 240

Ala Arg Lys Ala Arg Arg Cys Trp Ser Thr Glu Leu His Arg Lys Phe

245 250 255

Val Ala Ala Leu Asp Gln Leu Gly Gly Pro Gln Val Ala Thr Pro Lys

260 265 270

Gln Ile Arg Glu Leu Met Lys Val Asp Gly Leu Thr Asn Asp Glu Val

275 280 285

Lys Ser His Leu Gln Lys Tyr Arg Leu His Asn Arg Arg Ala Pro Gly

290 295 300

Ser Gly Val Val Arg Gln Pro Ile Val Leu Val Gly Gly Leu Trp Ile

305 310 315 320

Pro Gln Glu Gln Gly Ser Pro Gln Ser Gly Ser Pro His Gly Pro Leu

325 330 335

His His Leu Ser Thr Ser Val Ala Ala Val Ser Ser Ala Ala Thr Ala

340 345 350

Ser Cys Glu Glu Glu Asp Gly Arg Ser Glu Ser Tyr Gly Trp Lys

355 360 365

<210> 4

<211> 5006

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 4

cgttcacgcg atttttcaag tgaaagcgag accgaaaacc agcaatgggc tgtaggaatg 60

cattaggata tttttaccaa atattagcca aacgtttttg ttattatgca taatagtagg 120

catagcacta aatttacaat agactacaaa tataggggct ttattacaaa atattctttc 180

ggacgtgaaa actcgtcatt gttgattcgg agattctacc actccatctc cagttttttc 240

cctcgcctgc tcagctcccc tataaatgga gctcgccttc cgcggcctcc ctccgttccc 300

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cgcgacgatg gggctcgacg tcatggagat cgggatgggc gccgatttga gcctggatct 420

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gctgtcgacg gagagggtgg tactggtgtg cgcaaccgga caacgcaatg ttcaggcctg 3540

aagaatcgga atcggaatat tatattccgt ctggtgtggt tgtcactttc ttttctttgt 3600

gtgtgttttt ttgttgtttg ttgttgttgt gtagataaat actatgggga agaatggagg 3660

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ttagaccata ttttgaaacg tctgaaacta ataattaaca gataaaacta gctaagagag 3900

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ttagttaatt taatctagct aaaatcaaat acaacaactt actctttatg tacaaaatta 4020

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gtttctaaat ttattatata aaaactaaga gataaaatga ataataattt ttggacggaa 4140

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cgttcacgcg atttttcaag tgaaagccaa atattagcca aacgtttttg ttattatgca 60

taatagtagg catagcacta aatttacaat agactacaaa tataggggct ttcgtacaaa 120

ataatctttc ggacgtgaaa actcgtcatt gttgattcgg agattctacc actccatctc 180

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tgttcaagcg ggacctcccg ctctgcgcgc gcctcctcgc cgacggtgag cgcacctacc 540

tcttctctct ctgtctctct ctctttttta tttttcccac ctgtgattca tttgggatac 600

cttctgcttc tttccatttt ggggagcggg tttttttatg cggcgatgtg gtggcgtgtg 660

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tgatcgcagg ctggcgtctg cggcagctga tgaggaggag gaggaggagg acggcgccac 780

cgcggacaag agcaagtgga tgagcacggc gcagctctgg acgggcgatt ccgggcggga 840

ggacgcggaa tcagaggtac ggcacgattc gatcgctggt gcagctgctt gaatgcccag 900

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acatcccaaa gagaaagaga aagagatact agctacagtt ttgcggcttg ctaatccatg 2280

cctgggggca gagctacagt tttcgccccg agagagttca cccatcaccc atacccgttg 2340

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ctgggggcag agctacagtt ttcgccccga gagagttcac 1540

<210> 8

<211> 1098

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 8

atggggctcg acgtcatgga gatcgggatg ggcgccgatt tgagcctgga tctgaggcac 60

ttcgcctcca aggccgtgag gcagagcaag gacgacacgc cggcgccgga catggacgca 120

tgcatccgcc gcctcgagga ggagcggggt aagatcgaga tgttcaagcg ggacctcccg 180

ctctgcgcgc gcctcctcgc cgacgtaatt gatgtcatga aggaggaggc ggggaagaag 240

aagacgacga caaggaggag tgaccgcagg ctggcgtctg cggcagctga tgaggaggag 300

gaggaggagg acggcgccac cgcggacaag agcaagtgga tgagcacggc gcagctctgg 360

acgggcgatt ccgggcggga ggacgcggaa tcagagaagc aagacaaggg gtggtgctcg 420

ccggaggcca ggtcccgcgg cgctctctta ccgttcaagg ctgaagtggg ctctggcgcg 480

ccggcgttcg cgccgctctg cttgagaacg gacgacaagg ctgcggctgc gcgcgtcggg 540

gtgccggatc tgtcgtcctt gctgtcgtcg ccggcgacca tgcctcctgc ggacgccggc 600

gccgaggaga gccgtcgcca ggttgtggga tttgcgcaag ctgcggccag ggcggctgcc 660

atggcgccgt ctgcccctgc gcttgggctc cagtcgcagc agcagcagca gcaggcaagg 720

aaggctcggc gttgctggtc gacggagctg catcgcaagt tcgtcgccgc cttggatcag 780

ctcggtggcc cccaagttgc cacgccgaag caaatcaggg agctgatgaa ggtggatggg 840

ctgacaaacg acgaagtgaa aagccatctt cagaaatacc ggctgcacaa ccggagggcg 900

cctggatccg gcgtggtgcg ccagccgatc gtgctcgtgg gagggctgtg gattccccag 960

gagcaaggca gccctcagtc tggatctccc cacggccccc tccaccacct gtccacctcg 1020

gtggccgccg tctcgtccgc cgccaccgcc agctgcgagg aggaagacgg ccggtccgag 1080

agctatggct ggcaatga 1098

<210> 9

<211> 1104

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 9

atggggctcg acgtcatgga gatcgggatg ggcgccgatt tgagcctgga tctgaggcac 60

ttcgcctcca aggccgtgag gcagagcaag gacgacacgc cggcgccgga catggacgca 120

tgcatccgcc gcctcgagga ggagcggggt aagatcgaga tgttcaagcg ggacctcccg 180

ctctgcgcgc gcctcctcgc cgacgtaatt gatgtcatga aggaggaggc ggggaagaag 240

acgacgacca cgaggaggag tgatcgcagg ctggcgtctg cggcagctga tgaggaggag 300

gaggaggagg acggcgccac cgcggacaag agcaagtgga tgagcacggc gcagctctgg 360

acgggcgatt ccgggcggga ggacgcggaa tcagagaagc aagacaaggg gcggtgctcg 420

ccggaggcca ggtcccgcgg cgctctctta cggttcaagg ctgatgtggg ctctggcgcg 480

ccggcgttcg cgccgctctg cttgagaacg gacgacaagg ctgcggctgc gcgcgtcggg 540

gtgccggatc tgtcgtcctt gctgtcgccg ccggcgacca tgcctcctgc ggacgccggc 600

gccgaggaga gccgtcgcca ggttgtggga tttgcgcaag ctgcggccag ggcggctgcc 660

atggcgccgt ctgcccatgc gcttgggcac cagtcgcagt cgcagcagca gcagcagcag 720

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gatcagctcg gtggccccca agttgccacg ccgaagcaaa tcagggagct gatgaaggtg 840

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acctcggtgg ccgccgtctc gtccgccgcc accgccagct gcgaggagga agacggccgg 1080

tccgagagct atggctggaa atga 1104

<210> 10

<211> 349

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 10

cagacatgct ttgcagtagt agtagtatat agggtgtgtt tggtttgact tttgactctg 60

gcttttaccc cctaaaagct aaaagccaaa ccaaagggct ggatttagga agcagctttt 120

tctaaaagcc gactttcttg cagtgcaaaa ctgaaagcac ctctagacct gcttttagct 180

gcttttagat ggaactgtga aaatatatat ggaaaaacat ttagcgactt ttagtggttt 240

ccaccaaaca ctttttagct ttttaacagc tcgcagccca cagcagcttt tctcacagct 300

cacagcccac agcagctttt ttcacagcca cagtccaacc aaacagacc 349

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 11

cggtctctgt tgtgggcttt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 12

atgctggcgc cttgatagtc 20

Claims

1.蛋白，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任意一个所示；或所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任意一个所示的序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有与SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示的序列相同功能的序列。

2.核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的蛋白；任选地，所述核酸的核苷酸序列或互补序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.9任意一个所示。

3.分子标记，其特征在于，所述标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示序列或部分序列或上述序列的互补序列。

4.一种鉴定或辅助鉴定植物抗病性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)检测待测材料权利要求3所述的分子标记；(2)如果检测结果为包含上述标记，待测材料将表现抗病性状；如果检测结果为不包含上述标记，待测材料将表现感病性状；

任选地，所述的分子标记的检测方法采用PCR扩增；任选地，所述PCR扩增采用的引物对由引物F和引物R组成；所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

任选地，所述的包含上述标记的表现为PCR扩增出447bp大小的条带。

5.一种筛选具有抗病性状的植物材料的方法，其特征在于，按照权利要求4所述的方法检测待测材料权利要求3所述的分子标记，筛选包含权利要求3所述分子标记的材料。

6.权利要求1至权利要求5所述的蛋白、核酸、分子标记、方法在植物抗病育种中的应用；任选地，所述的植物为玉米；任选地，所述的抗病性为玉米大斑病或南方锈病或灰斑病中的任意一种抗性。