CN108165554B - 控制玉米叶宽基因ZmNL4及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子遗传学领域。具体涉及控制玉米叶宽的基因ZmNL4及其相关的分子标记在筛选或改良植物叶宽性状方面的应用。本发明提供了一个控制玉米叶宽基因ZmNL4的序列，且公开了ZmNL4基因内部一个与玉米叶宽性状显著相关的InDel位点。本发明公开了基于该InDel位点开发的分子标记用于筛选玉米叶宽性状的方法。进一步地，本发明公开了通过基因工程手段突变ZmNL4蛋白或其同一性蛋白以降低植物叶宽的方法。

Description

控制玉米叶宽基因ZmNL4及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传学领域。具体涉及控制玉米叶宽的基因ZmNL4及其相关的分子标记在筛选或改良植物叶宽性状方面的应用。本发明提供了一个控制玉米叶宽基因ZmNL4的序列，且公开了ZmNL4基因内部一个与玉米叶宽性状显著相关的InDel位点。本发明公开了基于该InDel位点开发的分子标记用于筛选玉米叶宽性状的方法。进一步地，本发明公开了通过基因工程手段突变ZmNL4蛋白或其同一性蛋白以降低植物叶宽的方法。
背景技术
近年来，玉米育种方向逐渐由追求单株产量到群体产量转变，因此，紧凑型玉米品种越来越受青睐。在玉米株型的影响因素中，叶型是一个重要因素。叶型包括叶长、叶宽、叶夹角，其中叶宽能影响叶面积大小，进而直接影响光合产物的积累，以及蒸腾作用水分的散失。此外，叶片宽度也是植株耐密性和通风透光能力的重要反映。培育窄叶型玉米品种将提高该品种的密植潜能，进而提高单位面积内玉米的群体产量。
利用突变体遗传手段，目前已鉴定到若干影响叶片宽度的突变体，包括rld1、rld2、rgd、ns1、ns2等(Tian F，Bradbury P J，Brown P J，et al.，Genome-wideassociation study of leaf architecture in the maize nested associationmapping population[J].Nat Genet，2011.43(2)：159-162；Scanlon M J，Schneeberger RG，and Freeling M，The maize mutant narrow sheath fails to establish leafmargin identity in a meristematic domain[J].Development，1996.122(6)：1683-1691；Douglas R N，Wiley D，Sarkar A，et al.，ragged seedling2 Encodes anARGONAUTE7-like protein required for mediolateral expansion，but notdorsiventrality，of maize leaves[J].Plant Cell，2010.22(5)：1441-1451.)。突变体rld对叶片产生的多效性影响包括背腹极性颠倒，抑制正常的叶片横向展开，使叶片呈卷曲状。突变体rgd属于AGO-like的基因突变体，产生棒状叶子，该突变体中侧轴发育受到严重影响，使叶片宽度明显变窄。ns突变体叶片长度没有变化，但边缘部分缺失，该突变体表型由WUSCHEL-related homeobox 3A基因控制。可见，这些伴有负面效应的突变体基因很难用于育种实践。
利用群体遗传学手段，目前已定位到大量与叶片宽度相关的QTL。Ku等利用双亲群体，检测到4个与叶宽相关的QTL，分别位于第1、3、9号染色体上(Ku L X，Zhao W M，ZhangJ，et al.，Quantitative trait loci mapping of leaf angle and leaf orientationvalue in maize(Zea mays L.)[J].Theor Appl Genet，2010.121(5)：951-959.)。Wassom利用双亲连锁群体检测到2个与叶宽相关的QTL，分别位于第2，8号染色体上(Wassom JJ.Quantitative trait loci for leaf angle，leaf width，leaf length，and plantheight in a maize(Zea mays L.)B73×Mo17 population[J].Maydica，2013.58(3)：318-321.)。Yang等利用自然群体进行GWAS分析，鉴定到19个与叶宽相关的SNP，分布于十条染色体中，并根据最显著SNP所在的物理位置，提出相应的候选基因(YangN，Lu Y，Yang X，etal.，Genome wide association studies using a new nonparametric model revealthe genetic architecture of 17 agronomic traits in an enlarged maizeassociation panel[J].PLoS Genet，2014.10(9)：e1004573.)。然而，上述研究仅对候选基因进行了预测而并未开展功能验证，或尚未明确控制玉米叶宽的主效功能基因。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一个控制玉米叶宽性状的主效基因ZmNL4以及与叶宽性状显著相关的InDel位点。
本发明的目的之二在于公开一种筛选玉米叶宽性状的方法。
本发明的目的之三在于公开一种降低植物叶宽性状的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一个控制玉米叶宽性状的主效基因ZmNL4，其特征在于，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。其中，相对于SEQ ID NO.1而言，SEQ ID NO.2在第6,606bp处缺失一个T碱基。
本发明提供了一个基于InDel位点开发的分子标记，其特征在于，所述InDel位点位于SEQ ID NO.1第6,606bp处，或玉米chr4：3465235处，为1bp的T碱基缺失(InDel_1)或不缺失(InDel_0)；且含有InDel_1的玉米材料其叶片宽度显著小于等位基因为InDel_0的玉米材料的叶片宽度。
本发明公开了一种筛选具有宽叶性状的玉米材料的方法，包括如下步骤：(1)检测待测玉米材料的InDel位点；(2)筛选基因型为InDel_0的材料；任选地，检测方法采用基于KASP技术的PCR扩增的方法；任选地，基因型InDel_0的序列如SEQ ID NO.3所示，或与SEQID NO.3互补的序列。
本发明同时公开了一种筛选具有窄叶性状的玉米材料的方法，包括如下步骤：(1)检测待测玉米材料的InDel位点；(2)筛选基因型为InDel_1的材料；任选地，检测方法采用基于KASP技术的PCR扩增的方法；任选地，基因型InDel_1的序列如SEQ ID NO.4所示或SEQID NO.4互补的序列。
本发明所述基于竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Alell Specific PCR，KASP)技术的PCR扩增采用的引物对由引物G0553-K1F、G0553-K2F和引物G0553-KR组成；所述引物G0553-K1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：gaaggtgaccaagttcatgctGTGGCGCTGGAAGAGCAGCT，用于检测InDel_0标记位点，其中gaaggtgaccaagttcatgct为FAM标签的核苷酸序列；所述引物G0553-K2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：gaaggtcggagtcaacggattGTGGCGCTGGAAGAGCAGCG，用于检测InDel_1标记位点，其中gaaggtcggagtcaacggatt为HEX标签的核苷酸序列；所述引物G0553-KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：GTCGATGACCAGGGACAGGTTC，为G0553-K1F和G0553-K2F共用的反向引物。
本发明公开了含有基于KASP技术的引物对的试剂盒。
本发明公开了所述的ZmNL4基因、InDel标记、方法、引物对、试剂盒在改良玉米叶宽性状中的应用。
本发明进一步公开了一种降低植物叶宽性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)确定目标蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示序列相似度不低于80％；
(2)突变该植物中步骤(1)所述的蛋白，使其功能缺失。
本发明进一步提供了高粱、谷子、黍、玫瑰草、二穗短柄草、粳稻、籼稻、节节麦等植物中与SEQ ID NO.8所示序列相似度不低于80％的氨基酸序列，所述的目标蛋白的序列为SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10-17中的任意一个。
本发明进一步提供了突变目标蛋白的方法包括但不限于基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入；任选地，所述的方法采用基因编辑；任选地，所述基因编辑在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列为SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示。
本发明进一步公开了利用上述蛋白和方法在培育具有窄叶性状植物中的应用。
附图说明
图1 ZmNL4基因的结构和功能位点示意图。A：基因结构，黑色方框表示外显子，箭头指示InDel位点的位置；B：InDel_0和InDel_1基因型编码的蛋白结构，黑色方框表示结构域。
图2 InDel_0和InDel_1基因型鉴定结果。圆圈代表InDel_0基因型标记；方框代表InDel_1基因型。菱形代表未检测到，三角形代表InDel_0/InDel_0杂合基因型。数据来源于72份玉米材料。
图3 G070533-CPB-ZmUbi-hspCas9载体图。各元件英文及缩写含义列举如下：
RB T-DNA repeat T-DNA右边界重复序列
M13 fwd M13引物序列(正向)
G070533 控制叶宽的基因GRMZM2G070553
Ubi promoter 泛素启动子
3×FLAG 标签序列
SV40NLS 猿猴病毒40核定位信号
Cas9 cas9基因序列
Nucleoplasm in NLS 核定位信号
NOS terminator 胭脂碱合成酶终止子
lac promoter 乳糖启动子
M13 rev M13引物序列(反向)
lac operator 乳糖操纵子
CAP biding site CAP结合位点
CaMV35S promoter(enhanced) 增强的花椰菜花叶病毒35S启动子
BlpR 编码Bar蛋白赋予植物具有草铵膦耐性
CaMV35S polyA single 花椰菜花叶病毒35S多聚腺苷酸序列
LB T-DNA repeat T-DNA左边界重复序列
Kan R 卡那霉素抗性序列
Ori 起始区序列
Bom 骨架区序列
pVS1 RepA pVS1复制子
pVS1 StaA pVS1转录起始区
图4利用CRISPR-Cas9技术突变玉米ZmNL4蛋白后的穗位叶表现。A：阳性材料，B：阴性材料。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。
在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。
本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。
在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。
在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。
在一些实施方案中，本申请对控制杂交和育种设计的群体群体(Controlled-cross and Breeding Design，CBD)的叶宽性状进行多个环境调查，通过全基因组重测序结合关联分析进行QTL检测，新鉴定到一个叶宽主效QTL。该QTL位于chr4：1.99Mb-4.84Mb区间，其表型解释率高达18.2％，加性效应达到0.68cm。进一步通过精细定位将候选基因锁定为半乳糖氧化酶基因，编号为GRMZM2G070553，本发明将该控制玉米叶宽的基因命名为ZmNL4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。进一步通过显著变异类型分析，发现ZmNL4基因上存在一个与表型变异高度相关的InDel位点，该所述InDel位点位于SEQID NO.1的6,606bp处，或玉米chr4：3465235处，为1bp的T碱基缺失(InDel_1)或不缺失(InDel_0)；且含有InDel_1的玉米材料其叶片宽度显著小于等位基因为InDel_0的玉米材料的叶片宽度。
在一些实施方案中，本发明提供了控制玉米叶宽的ZmNL4基因的核苷酸序列及其InDel位点。基于该InDel位点，本发明进一步开发了该位点的分子标记，同时公开了该标记用于检测玉米叶宽性状的方法。该InDel标记和筛选方法，可以应用于改良玉米的叶宽。如，通过该标记筛选具有窄叶性状的玉米材料或种质，以该玉米材料或种质作为亲本进行杂交或回交转育，进而利用该标记进行杂交群体或回交群体的分子标记辅助选择，以快速获得同时具有供体亲本的窄叶性状和受体亲本或轮回亲本的遗传背景的优良亲本或种质，以进一步用于玉米耐密植育种。
在一些实施方案中，本发明在明确ZmNL4基因编码蛋白结构的基础上，提供了高粱、谷子、黍、玫瑰草、二穗短柄草、粳稻、籼稻、节节麦等植物中的同一性蛋白，这些蛋白与ZmNL4蛋白的氨基酸序列相似度不低于80％，且都包含KELCH-domain和BAP-domain结构域，因此这些蛋白与ZmNL4蛋白具有潜在的功能同一性。进一步地，本发明公开了一种降低植物叶宽性状的方法，即通过基因工程技术突变与ZmNL4蛋白序列(SEQ ID NO.8)相似度不低于80％的蛋白质。该蛋白和突变方法，可应用于降低植物叶宽性状。这些突变方法造成了蛋白的功能缺失：比如，通过基因编辑技术定点突变基因组靶标区域，通过引入终止子使mRNA的翻译提前终止；利用RNAi技术，干扰基因的转录，降低mRNA的含量；或通过T-DNA插入技术，干扰基因的正常表达。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(Sambrook J& Russell D W，Molecular cloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
实施例1ZmNL4基因的结构和InDel功能位点
控制玉米叶宽的功能基因ZmNL4，编号为GRMZM2G070553，位于chr4：3,464,429-3,471,840，全长7,412bp，包含16个外显子。编码区长度为2153bp。其基因结构如图1A所示。ZmNL4基因第14外显子上存在一个与叶宽表型变异高度相关的分子标记，该标记位于SEQID NO.1序列第6,606个碱基(即chr4：3465235)处，表现为一个1bp的插入缺失(InDel_1/0)(图1A)。其中，InDel_0基因型的序列如SEQ ID NO.1所示；InDel_1基因型的序列如SEQ IDNO.2所示。通过Sanger测序，对比70份来源于不同遗传背景的群体材料，发现存在InDel_1的玉米材料叶片宽度显著小于InDel_0玉米材料叶片宽度(表1)。结果表明位于SEQ IDNO.1序列第6,606bp处的InDel_1/0为控制玉米叶宽的功能位点。
表1 功能标记InDel_1/0对应玉米材料的叶宽
Figure BSA0000158835060000091
注：叶宽数据选取玉米穗位叶宽测定。下同
实施例2基于InDel位点分子标记的开发
根据实施例1中所述InDel功能位点设计竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAlell Specific PCR)引物，简称KASP引物。包括正向引物G0553-K1F(SEQ ID NO.5)：gaaggtgaccaagttcatgctGTGGCGCTGGAAGAGCAGCT，用于检测InDel_0标记位点，其中gaaggtgaccaagttcatgct为FAM标签的核苷酸序列；G0553-K2F(SEQ ID NO.6)：gaaggtcggagtcaacggattGTGGCGCTGGAAGAGCAGCG，用于检测InDel_1标记位点，其中gaaggtcggagtcaacggatt为HEX标签的核苷酸序列；反向引物：G0553-KR(SEQ ID NO.7)：GTCGATGACCAGGGACAGGTTC。
通过不同基因型与玉米叶宽性状的关联分析评价分子标记的实用性。
1.提取待测玉米的基因组DNA。具体流程如下：
(1)取适量叶片，加入液氮进行充分研磨。迅速取适量研磨好的粉末转移至2mL离心管，粉末约没过管底较为合适。立即加入65℃预热的CTAB缓冲液750～800μL，充分混匀。该过程需快速进行，以防DNA在转移过程中冻融影响提取质量；
(2)将离心管置于水浴锅进行65℃水浴，约10～15min后，加入10μL RNA酶，用移液器上下轻缓吸打混匀。继续水浴1～1.5h，水浴过程中每隔10～15min上下轻缓摇动，混匀，使细胞壁破碎，DNA充分释放。该过程中使用移液器混匀应尽量轻缓，以防吸打过于激烈，DNA被物理作用打碎；
(3)水浴结束后，取出离心管，加入等体积(约为750～800μL)的氯仿和异戊醇混合液，去除蛋白质，混合液按照氯仿和异戊醇体积比24∶1进行混合。在摇床上温和混匀30min后，以12000rmp，进行10min离心；
(4)离心结束后小心吸出适量(约为上清液体积的2/3)上清液，约为700μL。转移至新离心管中，加入等体积氯仿异戊醇混合液，混匀后以8000rpm离心20min。该步骤可重复两至三次，可将蛋白质尽量去除干净，但重复多次会对DNA的总量产生较大影响；
(5)将离心后的上清液小心吸取约400μL，转移至1.5mL离心管中，将等体积-20℃预冷的异丙醇用移液器沿管壁在液面上方缓慢加入，轻缓混匀可看见絮状物析出。若絮状物不明显可在-20℃下静置20～30min后把液体小心吸去留下絮状沉淀；
(6)在装有物的离心管中加入约500μL的75％乙醇，缓慢摇晃，将析出的DNA絮状物洗涤。以转速12000rpm离心1min。重复此步洗涤操作2～3次；
(7)倒出乙醇后晾干。加入50μL 65℃的TE溶液，静置24h使DNA充分溶解；
(8)用Nanodrop测定DNA溶液浓度及提取质量。琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。Qubit仪器测定DNA溶液中真实的双链DNA浓度。参照Qubit浓度对DNA溶液进行定量。
2.以待测玉米的基因组DNA为模板，利用KASP引物，进行PCR扩增反应。
PCR反应体系(10.2μL)：20ng/μL模板DNA 5μL；G0553-K1F、G0553-K2F引物的终浓度为30μM，G0553-KR引物的终浓度为90mM，三条引物按等体积混合成Primer_mix，0.2μL；KASP Master mix 5μL。配置过程中避免强光照射。
PCR反应条件：(1)94℃，15分钟。(2)94℃，20s。(3)61℃，1分钟。(4)第(2)-(3)步循环9次，每循环一次，第(3)步温度就在上一个循环的基础上降低0.6度。(5)94℃，20秒。(6)55℃，1分钟。(7)从(5)步-(6)步循环30次。(8)25℃，1分钟。(9)qPCR仪荧光扫描程序，25℃，5秒。(10)4℃，1分钟。(11)94℃，20s。(12)55℃，1分钟。(13)3个循环。(14)25℃，1分钟。其中步骤(10)-(14)为可选程序。
含有InDel_0标记的PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，含有InDel_1标记的PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。ZmNL4基因的InDel标记在72个自交系间的基因型簇图，如图2所示。其中带有FAM标签的InDel_0标记对应Allele1，而带有HEX标签的InDel_1标记对应Allele2，两种基因型在参试材料中能够明显地区分为两组，可见，本发明的KASP引物对能够用于功能标记InDel_1/0的基因分型。
进一步地，结合72个自交系的PCR检测结果和叶宽数据，结果表明，基因型为InDel_0的玉米叶宽显著大于基因型为InDel_1的玉米叶宽，结果见表2。
表2 功能标记InDel_1/0对应玉米材料的叶宽
Figure BSA0000158835060000111
实施例3ZmNL4蛋白结构及其同一性蛋白
进一步分析ZmNL4基因编码的蛋白序列发现，该基因共编码716个氨基酸(序列如SEQ ID NO.8所示)，其蛋白存在两个功能结构域，分别是KELCH-domain和BAP-domain(图1B)。存在1bp缺失的等位基因InDel_1基因型，导致第566位氨基酸移码突变以及蛋白质编码提前终止，产生只存在603个氨基酸的截短的蛋白质(序列如SEQ ID NO.9所示)，该截短蛋白包含一个KELCH-domain和极小的一部分BAP-domain。由此可见，BAP结构域的缺失对蛋白质功能有重要影响，可能导致叶片表型发生变异。进一步利用BLASTP工具在NCBI数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析发现ZmNL4基因编码的蛋白质在高粱、谷子、黍、玫瑰草、二穗短柄草、粳稻、籼稻和节节麦等植物中存在同一性蛋白，这些蛋白与ZmNL4蛋白的氨基酸序列相似度不低于80％(见表3)，且都包含KELCH-domain和BAP-domain结构域，因此这些蛋白与ZmNL4蛋白具有潜在的功能同一性。这些蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.17所示。
表3 ZmNL4的功能同一性蛋白
Figure BSA0000158835060000121
实施例4突变ZmNL4蛋白改良玉米叶宽
为进一步证实ZmNL4蛋白BAP结构域的缺失对玉米叶宽的影响，本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对ZmNL4基因的BAP结构域区域进行定点突变。实施方式包括基因编辑载体的构建、玉米的遗传转化以及编辑效果的功能验证。具体如下：
1.基因编辑载体的构建
本发明的基因编辑载体为G070533-CPB-ZmUbi-hspCas9，其载体图如图3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。该载体的基础载体为CPB-ZmUbi-hspCas9。本发明通过Overlap PCR获得双靶U6-sgRNA进而通过同源重组克隆到基础载体中，具体的构建流程如下：
(1)U6启动子的克隆。从B73中克隆U6启动子，U6启动子的序列信息如SEQ IDNO.21所示。
(2)靶标gRNA的设计。基于转化受体材料祥249(商业化品种长城799的母本自交系)基因组序列的特异性，对其靶标区域测序后输入http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行靶标设计。本发明优选的两个靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。本发明的sgRNA骨架序列通过人工合成得到，其序列信息如SEQ ID NO.22所示。
(3)通过Overlap PCR获得双靶U6-sgRNA。引物对pU6F1/pU6R(SEQ ID NO.23和SEQID NO.25)用于扩增第一个靶标的U6启动子，产物长度为515bp；引物对pT-1F/pgRR1(SEQID NO.26和SEQ ID NO.28)用于扩增第一个靶标的sgRNA，产物长度为127bp；引物对pU6F1/pgRR1(SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.28)用于扩增第一个靶标的U6-sgRNA，产物长度为623bp；引物对pU6F2/pU6R(SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25)用于扩增第二个靶标的U6启动子，产物长度为515bp；引物对pT-2F/pgRR2(SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.29)用于扩增第二个靶标的sgRNA，产物长度为138bp；引物对pU6F2/pgRR2(SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.29)用于扩增第二个靶标的U6-sgRNA，产物长度为634bp。针对每个靶标，分别进行Overlap PCR扩增，获得U6-sgRNA。Overlap PCR第1步分别扩增U6和sgRNA，PCR产物分别稀释50倍后混合作为模板进行Overlap PCR第2步扩增。扩增产物电泳切胶回收并测序确认序列。Overlap PCR体系和条件如下：Overlap PCR第1步的15μL的反应体系如下，模板DNA(U6或sgRNA，≥30ng/μL)：0.5μL，Primer F/R：各1.2μL，灭菌ddH2O：3.7μL，2×phanta max Buffer：7.5μL，dNTPmix：0.6μL，Phanta酶(产品编号：P505-d1/d2/d3)：0.3μL。Overlap PCR第2步的反应体系为30μL体系。U6吸1μL，加49μL ddH2O稀释；sgRNA吸1μL，加49μL ddH2O稀释各吸10μL，混匀。具体如下：混合模板DNA(U6+sgRNA)：1.5μL，Primer F/R：各2.4μL，灭菌ddH2O：6.9μL，2×phanta max Buffer：15μL，dNTP mix：1.2μL，Phanta酶：0.6μL。Overlap PCR程序如下：(1)94℃ 5分钟，(2)94℃ 30秒，(3)62℃ 35秒，(4)72℃ 30秒，第(5)步是从(2)步-(4)步循环32次，(6)72℃ 10分钟，(7)25℃ 5分钟。
(4)通过重组克隆构建到骨架载体。将CPB-Ubi-hspcas9载体用Hind III消化，回收。通过同源重组将两个靶标的U6-gRNA和载体三者连接。配反应液前保证各Overlap产物浓度接近一致，20μL的同源重组体系如下：Cas Hind III：3μL，T-1F Overlap：1μL，T-2FOverlap：1μL，灭菌ddH2O：9μL，5×CE MultiS buffer：4μL，Exnase MultiS(产品编号：C113-01/02)：2μL。
2.玉米遗传转化
将载体G070533-CPB-ZmUbi-hspCas9通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米自交系祥249的幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。3.基因编辑植株的性状评价
一共获得55个独立转化事件，即T0代材料。对T0代材料提取苗期DNA检测基因编辑情况，设计的扩增靶标编辑区段的引物为如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示。扩增体系为：DNA：3μL，双向引物各1μL，2×TaqMix：7.5μL，ddH2O：2.5μL，总体积10μL。PCR反应条件如下：(1)94℃ 5分钟，(2)94℃ 40秒，(3)57℃ 30秒，(4)72℃ 60秒，(5)从(2)步-(4)步循环35次，(6)72℃ 7分钟，(7)4℃保存。PCR产物交由武汉擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。将转化株测序结果与野生型祥249的基因组比对，发生碱基替换、插入或缺失的材料即为阳性编辑材料，否则为阴性材料。在55个独立转化事件中，18个事件在基因中发生了编辑，为阳性植株；37个没有编辑，为阴性植株。调查T0代材料授粉后期的叶宽、叶长和株高，发现阳性和阴性之间叶宽具有极显著差异(p＝2.23e-05)(图4，表4)，而叶长和株高没有显著差异(p＝0.69，p＝0.43)(表4)，再次表明该基因控制叶宽而对叶长和株高没有影响。
表4 ZmNL4基因编辑玉米材料的叶宽、叶长和株高性状数据
Figure BSA0000158835060000141
注：数据以“平均值±标准差”表示，不同字母表示各材料在p＝0.05水平的显著性差异。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (8)

1.一个控制玉米叶宽的基因ZmNL4，其特征在于，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.一种筛选具有宽叶或窄叶性状的玉米材料的方法，其特征在于，检测位于SEQ IDNO.1所示序列的第6,606bp位置处的InDel位点，所述的InDel位点为1bp的T碱基的缺失InDel_1或不缺失InDel_0，如果筛选宽叶性状，则筛选基因型为InDel_0的材料；如果筛选窄叶性状，则筛选基因型为InDel_1的材料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的检测采用基于KASP技术的PCR扩增的方法；所述基因型InDel_0的扩增序列如SEQ ID NO.3所示或与SEQ ID NO.3互补的序列，基因型InDel_1的扩增序列如SEQ ID NO.4所示或与SEQ ID NO.4互补的序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增采用的引物对由引物G0553-K1F、G0553-K2F和引物G0553-KR组成；所述引物G0553-K1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述引物G0553-K2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述引物G0553-KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.含有权利要求4所述引物对的试剂盒。
6.权利要求1至5所述的基因、方法、试剂盒在改良玉米叶宽性状中的应用。
7.一种降低玉米叶宽的方法，其特征在于，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术方法突变SEQ ID NO.8所示序列的蛋白；所述基因编辑在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列为SEQID NO.18或SEQ ID NO.19所示。
8.权利要求7所述的方法在培育具有窄叶性状玉米中的应用。
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