CN105647942A - 玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用 - Google Patents

玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用。通过对玉米自然变异群体513份自交系材料中5-甲酰四氢叶酸含量进行测定，结合RNA-Seq数据中挖掘到的基因型数据，评估自然变异群体群体结构和亲缘关系的影响，利用全基因组关联分析的方法定位到一个位于玉米第5号染色体上显著影响5-甲酰四氢叶酸含量的基因GFT1，其编码谷氨酸亚胺甲基转移酶1。本发明还提供与玉米叶酸含量相关的SNP标记及其应用。玉米ZmGFT1基因及该基因中显著影响5-甲酰四氢叶酸含量的关键SNP位点的发现，不仅为在玉米和其他作物中研究叶酸代谢提供了理论基础，还可以通过提高转基因植物的叶酸含量，缓解人类在叶酸营养方面的隐形饥饿问题。

Description

玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用。
背景技术
叶酸属于水溶性的B族维生素，是四氢叶酸及其衍生物的统称。由于氧化状态不同而存在不同形式的叶酸衍生物，如四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、5,10-亚甲基四氢叶酸等。在大多数物种中，叶酸在一碳转移反应中作为供体或受体发挥重要作用。叶酸参与嘌呤、甲酰甲硫氨酸-tRNA、胸苷酸、甘氨酸、丝氨酸和甲硫氨酸的生物合成，并且叶酸还参与泛酸盐的合成、甲基化反应和组氨酸代谢。在植物中，叶酸还与木质素、生物碱、甜菜素和叶绿素的生物合成相关，对植物的光呼吸也是必须的。人类和其他动物不能自身合成叶酸，只能从饮食中摄取所需的叶酸，植物是人类获取叶酸的主要来源。叶酸参与这些重要的生命过程，因此叶酸摄入不足会许多造成严重的健康问题，例如巨幼红细胞贫血、神经管缺陷等,还有导致癌症的潜在风险。所以叶酸缺乏成为一个全球性的健康问题。尽管在有些国家和地区实行了食物强化和维生素片补充等有效的措施来改善叶酸缺乏的状况，但是对于不发达国家和地区来说还是很难实现的。
5-甲酰四氢叶酸，又称做亚叶酸，是最稳定的自然形式的叶酸，作为一种稳定的储存形式是玉米籽粒中最丰富的叶酸组分。其通过丝氨酸羟甲基转移酶的副反应生成，可以抑制丝氨酸羟甲基转移酶和其它大部分叶酸依赖酶的活性。5-甲酰四氢叶酸是唯一一个不参与一碳代谢的叶酸形式，其在代谢活跃组织中发挥的具体作用目前还不清楚。叶酸遇光、遇热就不稳定，容易降解失去活性，所以人体真正能从食物中获得的叶酸并不多。提高叶酸中稳定形式叶酸所占的比例，增加叶酸的生物可利用率，也是叶酸强化的一种重要途径。
发明内容
本发明的目的是提供玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用。
为了实现本发明目的，本发明通过对玉米自然变异群体513份自交系材料中5-甲酰四氢叶酸含量进行测定，结合RNA-Seq数据中挖掘到的基因型数据，并且评估自然变异群体群体结构和亲缘关系的影响，利用全基因组关联分析的方法定位到一个位于玉米第5号染色体上显著影响5-甲酰四氢叶酸含量的基因GFT1，其编码谷氨酸亚胺甲基转移酶1。该基因所在位点的编号为GRMZM2G124863(参考玉米基因组B72RefGen_v2)。
玉米自交系Qi319中GRMZM2G124863基因的CDS全长为993bp，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，GRMZM2G124863基因编码330个氨基酸，序列如SEQIDNO:2所示。经过NCBI比对，该蛋白的21-228位氨基酸为亚胺甲基转移酶环化脱氨酶结构域的N端亚结构域。与玉米中的其他两个GFT基因GRMZM2G349536和GRMZM2G083711编码蛋白的序列同源性较低，分别为40.0％和39.8％。
而在玉米自交系B73中，多态性位点Chr5.s_19676906(S2069)和Chr5.s_19676907[A/G]的等位变异，共同造成该蛋白底物结合活性位置的氨基酸变异(由天冬酰胺变为甘氨酸)，从而影响5-甲酰四氢叶酸的含量。玉米自交系B73ZmGFT1基因的CDS全长为981bp，核苷酸序列如SEQIDNO:9所示，ZmGFT1基因编码326个氨基酸，序列如SEQIDNO:10所示。
本发明提供玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用。
所述玉米ZmGFT1基因的CDS序列如下：
i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或
ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明还提供携带有玉米ZmGFT1基因的载体、宿主细胞、转基因细胞系及工程菌。
携带有玉米ZmGFT1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition)。
前述的应用，采用农杆菌介导的方法，将携带有玉米ZmGFT1基因的表达载体转入植物组织中，筛选转基因植株。所述表达载体包括植物双元表达载体，优选pCAMBIA3301、pH2GW7。
本发明所述植物包括但不限于玉米、拟南芥。
本发明又对另一个自然变异群体的155份玉米材料的GFT1基因进行重测序，挖掘出更多的等位变异，利用候选基因关联分析的方法，发现了7个显著影响5-甲酰四氢叶酸含量的多态性位点。7个多态性位点中，4个插入缺失位点位于5’非翻译区，3个SNPs位于基因编码区。其中位于该基因编码区的多态性位点Chr5.s_19676906(S2069)和Chr5.s_19676907[A/G]等位变异，共同造成了该蛋白底物结合活性位置的氨基酸变异(由天冬酰胺变为甘氨酸)，显著影响了5-甲酰四氢叶酸含量，可以解释5-甲酰四氢叶酸变异的28％。
本发明还提供与玉米叶酸含量相关的SNP标记，所述SNP标记位于玉米自交系B73第5号染色体Chr5.s_19676906和Chr5.s_19676907位点(即玉米自交系B73ZmGFT1基因如SEQIDNO:9所示序列的第682位和第683位碱基)，两个位点处的碱基均为G的玉米叶酸含量显著高于两个位点处的碱基均为A的玉米叶酸含量。
上述SNP标记位于玉米自交系Qi319ZmGFT1基因如SEQIDNO:1所示序列的第694位和第695位碱基，两个碱基均为G的玉米叶酸含量显著高于两个碱基均为A的玉米叶酸含量。
本发明还提供用于检测所述与玉米叶酸含量相关的SNP标记的引物，包括正向引物F5’-ATGGAGCCTCATCACGCAAAC-3’和反向引物R5'-TCAGTCGTCAGCGCAAGC-3'。
本发明还提供含有所述引物F和R的用于检测玉米叶酸含量的试剂盒。
本发明还提供利用所述与玉米叶酸含量相关的SNP标记或所述引物或所述试剂盒鉴定玉米叶酸含量的方法。
所述方法包括以下步骤：
1)提取待测玉米的基因组DNA；
2)以待测玉米的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物。扩增产物第694位和第695位碱基，两个碱基均为G的玉米叶酸含量显著高于两个碱基均为A的玉米叶酸含量。
本发明进一步提供与玉米叶酸含量相关的SNP标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
本发明利用全基因组关联分析的方法，首次在玉米中发现了5-甲酰四氢叶酸代谢的关键基因ZmGFT1，并且发现了该基因中显著影响5-甲酰四氢叶酸含量的关键SNP位点。这不仅为在玉米和其他作物中研究叶酸代谢提供了理论基础，还可以通过基因工程手段，提高转基因植物的叶酸含量，缓解人类在叶酸营养方面的隐形饥饿问题。
附图说明
图1为本发明实施例1中玉米ZmGFT1基因的PCR扩增结果；A为来源于玉米自交系B73和Qi319的ZmGFT1基因扩增，用于转化拟南芥来研究自然变异对于5-甲酰四氢叶酸含量的影响；B为来源于自交系Qi319的ZmGFT1基因的扩增用于转化玉米来研究ZmGFT1的功能。
图2为本发明实施例2中ZmGFT1基因在玉米中的相对表达量；从左到右依次为根、茎、茎尖、嫩叶、花丝、果穗和授粉后10、15、20、25天的胚(Em)和胚乳(En)。
图3为本发明实施例3中对转ZmGFT1基因植株材料的PCR鉴定结果；A分别为转化了自交系B73和Qi319ZmGFT1基因的转基因拟南芥植株，其中B1、B2、B6、B7、B18、B32为转B73GFT1CDS阳性拟南芥转基因植株，Q1、Q2、Q3、Q4为转Qi319GFT1CDS阳性拟南芥转基因植株；B为转化了Qi319ZmGFT1的转基因玉米材料，其中26、128、147、177、347、372为阳性转基因玉米植株。
图4为本发明实施例3中RT-PCR检测转基因拟南芥和转基因玉米中ZmGFT1的表达量；A为阳性转基因拟南芥ZmGFT1转录水平检测，B1、B2、B6、B7、B18、B32代表拟南芥转入来自于自交系B73的ZmGFT1，Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6代表拟南芥转入来自于自交系Qi319的ZmGFT1；B中13-128、13-147、13-177、13-372为阳性转基因玉米中ZmGFT1转录水平检测结果。
图5为本发明实施例3中转基因拟南芥种子和转基因玉米叶片中5-甲酰四氢叶酸含量的检测结果；A中灰色柱子代表转入来自于B73的ZmGFT1转基因拟南芥种子中叶酸水平，黑色柱子代表转入来自于Qi319的转基因拟南芥种子中叶酸水平，白色柱子代表col野生型拟南芥种子中的叶酸水平。B中白色柱子代表作为对照的野生型玉米叶片材料的叶酸水平，其他4个柱子代表不同的转基因株系叶片材料的叶酸水平。
图6为本发明实施例4中392个自交系重测序发现与5-甲酰四氢叶酸显著关联的多态性位点及其单倍型与表型分析。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1玉米ZmGFT1基因的克隆及转化
采集玉米自交系Qi319叶片，trizol法提取玉米总RNA，用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(Thermo)获得玉米cDNA。以玉米cDNA为模板，4863CDS-BglII-F和4863CDS-BstEII-R为扩增引物，扩增GRMZM2G124863基因的CDS全长(图1A)。对含有GRMZM2G124863全长CDS序列测序正确的质粒进行BglII和BstEII双酶切，酶切后片段连接到ubiquitin-pCAMBIA3301上。以玉米自交系Qi319(S2069基因型为G)cDNA为模板，ZM-FAB4863-CDS-F和ZM-FAB4863-CDS-R为扩增引物，扩增Qi319GRMZM2G124863基因(即ZmGFT1基因)的CDS全长(图1B)。通过gateway同源重组的方法将经过测序正确的GRMZM2G124863全长CDS重组到过表达载体PH2GW7上，构建重组载体319GFT1-pH2GW7。
所用引物序列见表1。
表1克隆玉米ZmGFT1基因使用的引物
引物名称 序列(5’-3’)
4863CDS-BglII-F AGATCTATGGAGCCTCATCACGCAAAC
4863CDS-BstEII-R GGTTACCTCAGTCGTCAGCGCAAGC
ZM-FAB4863-CDS-F AAAAAGCAGGCTATGGAGCCTCATCACGCAAAC
ZM-FAB4863-CDS-R AGAAAGCTGGGTTCAGTCGTCAGCGCAAGC
玉米自交系Qi319ZmGFT1基因的CDS全长为993bp，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，ZmGFT1基因编码330个氨基酸，序列如SEQIDNO:2所示。
实施例2ZmGFT1基因在玉米中的表达模式
对玉米自交系Qi319不同发育时期组织器官如根、茎、茎尖嫩叶、花丝和授粉不同天数的胚和胚乳进行取材，提取总RNA，利用芯片技术检测ZmGFT1基因在玉米中的表达情况。结果表明，在选取的组织器官中都可以检测到ZmGFT1基因的表达，在授粉后20天的胚乳中表达水平最高，在胚和花丝中也检测到ZmGFT1基因较高的表达，在嫩叶中ZmGFT1基因的表达最弱(图2)。
实施例3ZmGFT1转基因玉米和转基因拟南芥植株的鉴定和叶酸含量测定
从玉米cDNA中扩增完整的ZmGFT1CDS序列，并通过酶切和同源重组的方法将其克隆到过表达载体pCAMBIA3301和pH2GW7上。将构建好的ZmGFT1-pCAMBIA3301通过农杆菌介导的遗传转化转化玉米愈伤，获得转基因玉米植株。对获得的转基因植株进行PCR鉴定(图3)，将鉴定为阳性的植株取叶片材料进行叶酸测定。将构建好的73GFT1-pH2GW7和319GFT1-pH2GW7通过花蘸法侵染col野生型拟南芥，将获得的T0代种子在潮霉素抗性平板上筛选。将筛选出的转基因阳性植株转移到培养土中，待可取材料时，取其叶片进行PCR鉴定进一步确认转基因阳性植株。取经过鉴定的转基因玉米和拟南芥阳性植株叶片，通过RT-PCR确定ZmGFT1在转基因阳性材料中的表达水平。结果表明，在转基因玉米材料中，ZmGFT1表达量比对照显著提高(图4)。利用高效液相色谱质谱法测定ZmGFT1阳性转基因玉米叶片中的叶酸含量，结果发现5-甲酰四氢叶酸含量比对照都有显著的提高。经过对转B73GFT1和转Qi319GFT1转基因阳性拟南芥种子叶酸进行测定，发现转B73GFT1的阳性转基因拟南芥种子比野生型5-甲酰四氢叶酸含量没有明显的变化，而转Qi319GFT1的阳性转基因拟南芥种子比野生型对照5-甲酰四氢叶酸含量显著提高。(图5)
实施例4与玉米叶酸含量相关的SNP标记的获得
通过对自然变异群体的155份玉米材料的GFT1基因进行重测序，挖掘出更多的等位变异，利用候选基因关联分析的方法，发现了7个显著影响5-甲酰四氢叶酸含量的多态性位点(图6)。7个多态性位点中，4个插入缺失位点位于5’非翻译区，3个SNPs位于基因编码区。其中位于该基因编码区的多态性位点Chr5.s_19676906(S2069)和Chr5.s_19676907[A/G]等位变异，共同造成了该蛋白底物结合活性位置的氨基酸变异(由天冬酰胺变为甘氨酸)，显著影响了5-甲酰四氢叶酸含量，可以解释5-甲酰四氢叶酸变异的28％。并且我们对392个玉米自交系GFT1基因进行了重测序，确定了7个显著性位点在392个自交系中的基因型。
根据所述多态性位点设计用于检测上述SNP标记的引物，包括正向引物F5’-ATGGAGCCTCATCACGCAAAC-3’和反向引物R5'-TCAGTCGTCAGCGCAAGC-3'。
不同基因型与玉米叶酸含量的关联分析：
1)提取待测玉米的基因组DNA；
2)以待测玉米的基因组DNA为模板，利用引物F和R，进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物。扩增产物第694位和第695位碱基，两个碱基均为G的玉米叶酸含量显著高于两个碱基均为A的玉米叶酸含量。
PCR反应体系(25μl)：50ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/LdNTPmix0.5μl，5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为水。
PCR反应条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，34个循环；72℃10分钟。
结合392个自交系7个显著性位点和5-甲酰四氢叶酸含量数据，我们发现，含有GG的单倍型代表的5-甲酰四氢叶酸含量显著高于其他单倍型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用，所述玉米ZmGFT1基因的CDS序列如下：
i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或
ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将携带有玉米ZmGFT1基因的表达载体转入植物组织中，筛选转基因植株。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述表达载体包括植物双元表达载体，优选pCAMBIA3301、pH2GW7。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括玉米、拟南芥。
5.与玉米叶酸含量相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于玉米自交系B73第5号染色体Chr5.s_19676906和Chr5.s_19676907位点，两个位点处的碱基均为G的玉米叶酸含量显著高于两个位点处的碱基均为A的玉米叶酸含量。
6.用于检测权利要求5所述与玉米叶酸含量相关的SNP标记的引物，其特征在于，包括正向引物F5’-ATGGAGCCTCATCACGCAAAC-3’和反向引物R5'-TCAGTCGTCAGCGCAAGC-3'。
7.含有权利要求6所述引物的用于检测玉米叶酸含量的试剂盒。
8.利用权利要求5所述SNP标记或权利要求6所述引物或权利要求7所述试剂盒鉴定玉米叶酸含量的方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测玉米的基因组DNA；
2)以待测玉米的基因组DNA为模板，利用权利要求6所述引物F和R，进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物。
10.权利要求5所述与玉米叶酸含量相关的SNP标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
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