CN108477190A - 5-甲酰四氢叶酸在提高植物氮素利用率方面的应用及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业技术领域，具体涉及5‑甲酰四氢叶酸在提高植物氮利用率方面的应用。外源5‑F‑THF促进了植物幼苗在低氮条件下的生长发育，幼苗的氮代谢发生变化，对理解5‑F‑THF在植物体内的生物学功能，及农业生产中提高植物氮利用效率有重要意义。

Description

5-甲酰四氢叶酸在提高植物氮素利用率方面的应用及方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及5-甲酰四氢叶酸在提高植物氮素利用率方面的应用及方法。
背景技术
氮元素是植物生长发育必需的重要矿质元素之一，是氨基酸合成的必要元素，进而合成蛋白质、核苷酸、叶绿体及其他多种代谢物和细胞组分。植物从土壤中吸收的氮素最初主要是无机态氮，也可以吸收有机态氮，如尿素等。无机态氮主要包括硝态氮(NO3-)和铵态氮(NH4+)。对大多数植物而言，硝态氮(NO3-)是最主要的氮源形式。植物对硝态氮的利用经过吸收、还原和同化三个主要过程。硝酸盐的氮呈高度氧化状态，需在根部的质体和地上部的叶绿体中进行还原转换成铵盐NH4+；游离的铵盐对植物具有毒害作用，所以铵盐会立即被同化成谷氨酰胺和谷氨酸。后者经过氨基交换作用形成其他的氨基酸和酰胺。
氮素不仅是重要的营养物质，也是调控基因表达的信号物质。植物根构型、叶片的发育和叶绿素的合成、开花及种子休眠等生物过程都受到土壤中氮含量的影响。此外，氮代谢与碳代谢在植物生长基本的生物化学途径中紧密协调，例如N同化与光合作用、光呼吸作用紧密结合和暗呼吸互相协调，氮代谢与碳代谢共同构成植物生命活动的基本过程。供氮充足能促进作物根系发育，促进植物生长和提高生物量。当植物缺氮时，蛋白质、核酸、磷脂等物质的合成减少，生长发育状态变差，植株矮小，叶片小而薄，分枝、分蘖减少，花果少且易脱落；缺氮还会导致光合作用的产出会明显下降，影响叶绿素的合成，导致植物叶片发黄、早衰甚至干枯。当土壤中氮肥缺乏时，化学合成氮肥的使用为保障农业生产和粮食安全作出了巨大贡献。目前，农业生产中存在氮肥施用过多、利用效率低的现象，农田过多的氮肥施用不仅增加了农业生产成本，而且还会对气候、土壤及水资源带来严重的污染。如何提高植物氮素利用效率(nitrogen use efficiency，NUE)成为农业领域亟待攻克的难题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的氮肥施用过多、利用效率低的问题，本发明提供5-甲酰四氢叶酸在提高植物氮素利用率方面的应用及方法。
根据本发明的具体实施方式，在施用不同浓度的5-甲酰四氢叶酸后，植物细胞内氨基酸量明显增加，植物的主根长度、鲜重及叶绿素含量均有所提高，植株的生长状况得到改善。
本发明的有益效果：
外源5-F-THF促进了植物幼苗在低氮条件下的生长发育，幼苗的氮代谢发生变化，这些工作为理解5-F-THF在植物体内的生物学功能，为农业生产中提高植物氮素利用效率提供理论基础。
附图说明
图1显示低氮条件(0.3N)、氮充足条件(9.4N)下添加5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)前后拟南介幼苗的变化情况，其中，(a)为幼苗主根长度的变化情况；(b)为幼苗的鲜重变化情况；(c)幼苗叶绿素(a+b)的变化情况；(d)为幼苗中可溶性蛋白的变化情况；
图2显示低氮条件(0.01N)下添加5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)前后水稻幼苗的变化情况；其中，(a)为幼苗地上部高度的变化情况；(b)为幼苗地上部鲜重的变化情况；(c)为幼苗地上部叶绿素(a+b)的变化情况；(d)为幼苗地上部可溶性蛋白的变化情况；
图3显示低氮条件(0.3N)、氮充足条件(9.4N)下添加5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)前后拟南介幼苗叶酸含量的变化情况；其中，(a)为5-F-THF的含量变化情况；(b)为5,10-CH-THF的含量变化情况；(c)为5-M-THF的含量变化情况；(d)为THF的含量变化情况；
图4显示低氮条件(0.01N)下添加5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)前后水稻幼苗地上部叶酸含量的变化情况；其中，(a)为5-F-THF的含量变化情况；(b)为5,10-CH-THF的含量变化情况；(c)为5-M-THF的含量变化情况；(d)为THF的含量变化情况
图5显示低氮条件(0.3N)、氮充足条件(9.4N)下添加5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)前后拟南介幼苗硝酸还原酶活性的变化情况；
图6显示低氮条件(0.01N)下添加5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)前后水稻幼苗地上部谷氨酸合酶活性的变化情况；
图7显示低氮条件(0.01N)下添加5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)前后水稻幼苗地上部游离氨基酸的变化情况；
图8显示添加5-M-THF和5-F-THF前后突变体幼苗的变化情况。
具体实施方式
实施例1
5-甲基四氢叶酸(5-M-THF)和5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF)是植物体中两种主要的叶酸存在形式。本发明分离获得叶酸突变体，该叶酸突变体中叶酸的主要形式为5-M-THF，且含量出现明显降低，叶酸突变体表现出主根缩短的表型。
本发明对叶酸突变体外源施加500μM的5-M-THF，如图8所示，叶酸突变体依然保持主根发育缺陷的表型；对叶酸突变体外源施加500μM的5-F-THF时，突变体主根发育情况得到改善，主根长度恢复到野生型水平。因此，表明5-F-THF能够进入拟南芥幼苗体内并被利用。
实施例2
以拟南芥和水稻为材料，分析外源施加5-甲酰四氢叶酸(5-F-THF，5-formyl-tetrahydrofolate)对缓解幼苗低氮胁迫的作用。
试验步骤：
5-甲酰四氢叶酸粉末用灭菌水配置成10mM母液，-80℃存储备用。
拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,Columbia-0)经表面消毒后，播种在添加5-甲酰四氢叶酸(工作浓度500μM)的培养基上，培养基仅用NO3-作为唯一的氮源，其他成分同1/2MS培养基。9.4N培养基中NO3-浓度为9.4mM；0.3N培养基中NO3-浓度为0.3mM，同时添加9.1mM的KCl使K+浓度保持在9.4mM。拟南芥平板放置在光照培养箱中，培养条件设置温度为22℃，光周期16h光照/8h黑暗，光照强度60μE m-2s-1。光照培养第10天，收集材料，进行表型观察及各项生理指标的检测，具体结果见表1和图1。
水稻野生型日本晴种子(Oryza Sativa L，Japonica)水稻种子点播在湿润的滤纸上，37℃培养2天，萌发的种子移到湿润的蛭石中，转到温室中培养7天(期间蛭石中只浇水)，温室温度设置为30℃，16h光照/8h黑暗，光照强度为200μE m-2s-1。之后使用含有5-甲酰四氢叶酸(工作浓度200μM)的1/2Yoshida营养液交灌一次，温室继续培养6天；之后使用含有5-甲酰四氢叶酸的全强度的Yoshida营养液浇灌一次幼苗，温室中继续培养9天，收获幼苗，进行表型观察及各项生理指标检测。Yoshida营养液中的氮浓度使用NH4NO3浓度进行调整，其他成分不变。水稻幼苗的变化情况见图2和表2。
表1 5-F-THF施用前后拟南介幼苗的变化情况
结果表明，在不同氮浓度条件下进行外源5-F-THF(500μM)施加实验，发现5-F-THF都能够促进-拟南芥幼苗的生长发育，低氮条件下(0.3N)施加外源5-F-THF后拟南芥幼苗主根长度、叶绿素含量、鲜重、可溶性蛋白含量分别为不添加时的1.25倍、1.29倍、1.31倍和2.21倍，氮充分条件(9.4N)施加外源5-F-THF后上述生理指标分别为不添加时的1.26倍、1.09倍、1.28倍和1.13倍。
表2 5-F-THF施用前后水稻幼苗的变化
结果表明，在氮浓度为0.01N条件下外源施加5-F-THF(200μM)，发现5-F-THF能够促进水稻幼苗的地上部的生长发育，地上部的高度、叶绿素含量、鲜重、可溶性蛋白含量分别为未添加时的1.11倍、2.19倍、1.12倍和1.75倍。
实施例3
试验步骤：
5-甲酰四氢叶酸粉末用灭菌水配置成10mM母液，-80℃存储备用。
拟南芥野生型种子(Arabidopsis thaliana,Columbia-0)经表面消毒后，播种在添加5-甲酰四氢叶酸的培养基上，培养基仅用NO3-作为唯一的氮源，其他成分同1/2MS培养基。9.4N培养基中NO3-浓度为9.4mM；0.3N培养基中NO3-浓度为0.3mM，同时添加9.1mM的KCl使K+浓度保持在9.4mM。拟南芥平板放置在光照培养箱中，培养条件设置温度为22℃，光周期16h光照/8h黑暗，光照强度60μE m-2s-1。光照培养第10天，收集材料，灭菌超纯水冲洗后进行叶酸的提取和含量检测，具体结果见表3和图3。
水稻野生型日本晴种子(Oryza Sativa L，Japonica)水稻种子点播在湿润的滤纸上，37℃培养2天，萌发的种子移到湿润的蛭石中，转到温室中培养7天(期间蛭石中只浇水)，温室温度设置为30℃，16h光照/8h黑暗，光照强度为200μE m-2s-1；之后使用含有5-甲酰四氢叶酸的1/2Yoshida营养液交灌一次，温室继续培养6天；之后使用含有5-甲酰四氢叶酸的全强度的Yoshida营养液浇灌一次幼苗，温室中继续培养9天，收获幼苗，地上部分进行叶酸的提取和含量检测。Yoshida营养液中的氮浓度使用NH4NO3浓度进行调整，其他成分不变。具体结果见图4和表3。
表3 5-F-THF施用前后5,10-CH＝THF、5-M-THF、THF的含量变化情况
结果表明，0.3N条件下外源添加500μM 5-F-THF后，拟南芥幼苗的5-F-THF及其衍生物5,10-CH＝THF、5-M-THF、THF含量分别为未添加时的784倍、73倍、1000倍、88倍；9.4N条件下外源添加500μM 5-F-THF后，拟南芥幼苗的5-F-THF及其衍生物5,10-CH＝THF、5-M-THF、THF含量分别为未添加时的118倍、15倍、200倍、26倍；外源添加200μM 5-F-THF后，水稻幼苗体内含量分别为未添加时的5.11倍、8.42倍、8.42倍、4.99倍，表明植物能够吸收利用外源5-F-THF，拟南芥幼苗在不同氮浓度条件下对外源5-F-THF的吸收利用程度不同，不同植物拟南芥和水稻对外源5-F-THF的吸收利用程度不同。
同时，0.3N条件下施加外源5-F-THF(500μM)后，如图5所示，拟南芥幼苗硝酸还原酶(NR，nitrate reducatse)酶活性由初始的4.05±0.38nmol h-1mg-1FW提高到4.95±0.5nmol h-1mg-1FW，增长了1.23倍；如图6所示，外源5-F-THF(200μM)处理后水稻幼苗内谷氨酸合酶(GOGAT，Glutamate synthase)酶活性明显提高，由初始的73.67±7.83nmol min- 1mg-1FW增长到141.97±22.43nmol min-1mg-1FW，提高了1.91倍。
本发明对外源5-F-THF(200μM)处理后的水稻幼苗游离苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含量进行检测，具体结果表4和图7所示。
表4 5-F-THF施用前后水稻幼苗中氨基酸的变化情况
施用前(μg/g FW) 施用后(μg/g FW)
苏氨酸 10.03±0.34 13.15±0.51
丝氨酸 34.35±1.42 52.06±6.33
天冬酰胺 7.38±0.34 20.13±6.98
丙氨酸 17.33±0.73 39.4±6.52
缬氨酸 18.05±0.78 24.26±1.89
γ-氨基丁酸 64.31±5.89 106.88±20.83
异亮氨酸 6.85±0.41 8.13±0.64
亮氨酸 13.05±0.89 16.61±0.65
苯丙氨酸 7.95±0.31 10.35±0.56
赖氨酸 15.81±0.48 20.15±0.18
结果表明，外源5-F-THF处理后的水稻幼苗中游离苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含量显著高于未添加幼苗，为未添加幼苗的1.31倍、1.53倍、2.71倍、2.27倍、1.34倍、1.66倍、1.18倍、1.27倍、1.30倍、1.28倍。
以上试验结果说明，外源5-F-THF促进了植物幼苗在低氮条件下的生长发育，幼苗的氮代谢发生变化，为理解5-F-THF在植物体内的生物学功能，为农业生产中提高植物氮素利用效率提供理论基础。

Claims (8)

1.5-甲酰四氢叶酸在提高植物氮素利用率方面的应用。
2.5-甲酰四氢叶酸在提高植物主根长度方面的应用。
3.5-甲酰四氢叶酸在提高植物鲜重方面的应用。
4.5-甲酰四氢叶酸在提高植物叶绿素含量方面的应用。
5.5-甲酰四氢叶酸在提高植物中氨基酸含量方面的应用。
6.5-甲酰四氢叶酸在提高拟南介幼苗和水稻幼苗的氮素利用率方面的应用。
7.一种提高植物氮素利用率的方法，其特征在于，所述方法包括施用5-甲酰四氢叶酸的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，5-甲酰四氢叶酸的使用浓度为200～500μM。
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CN105647942A (zh) * 2016-03-11 2016-06-08 中国农业科学院生物技术研究所 玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用

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孟红岩: "《拟南芥质体定位的叶酰聚谷氨酸合成酶AtDFB生物学功能研究》", 《中国农业科学院博士论文》 *

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