CN112662687B - 推迟玉米花期的方法、试剂盒、基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够推迟玉米花期的方法、试剂盒及基因。本发明提供了利用CRISPR‑Cas9方法编辑GRMZM2G044126基因序列，实现推迟开花的方法，同时公开了编辑后具有晚花性状的突变基因序列。本发明通过利用CRISPR/Cas9方法突变玉米MYST蛋白家族编码基因GRMZM2G044126，发现了GRMZM2G044126基因对玉米开花时间的调控作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法，可以推迟玉米的开花时间，提高玉米对特定种植区的生态适应性。本发明还提供了开花时间延迟的基因编辑植株的GRMZM2G044126突变基因，这些突变基因能够造成玉米开花时间延迟，可以用来培育晚花玉米新品种。

Description

推迟玉米花期的方法、试剂盒、基因

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种能够推迟玉米花期的方法、试剂盒及基因。本发明提供了利用CRISPR-Cas9方法编辑GRMZM2G044126基因序列，实现推迟开花的方法，同时公开了编辑后具有晚花性状的突变基因序列。

背景技术

开花期是作物进化和适应过程中的重要性状，理解作物开花期性状的遗传基础、克隆候选基因可以提高作物的环境适应能力和可塑性，这对培育适应不同生态区的优良作物品种具有重要的意义，同时也将促进产量等与开花期密切相关的重要生产性状的遗传改良进程。

组蛋白乙酰化是表观遗传调控的重要方式，组蛋白乙酰化修饰是由组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶共同调控的一种动态可逆的修饰过程。植物中的组蛋白乙酰转移酶可以分为GCN5、MYST、CBP和TAFII四个主要家族，它们在植物的生长发育和胁迫反应过程中发挥着重要的调控作用。目前玉米中的组蛋白乙酰转移酶基因的系统研究尚少。

本发明根据蛋白的结构域特点，在玉米中找到了5个具有MYST结构域的组蛋白乙酰转移酶基因，并利用CRISPR/Cas9技术对这些基因进行编辑，通过调查编辑植株的表型变化鉴定基因在植物生长发育过程中的功能，发现GRMZM2G044126这个基因在被编辑后，玉米的花期明显推迟，因此该基因可用于推迟玉米花期，培育晚花品种。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种推迟玉米花期的方法。

本发明的目的之二在于公开一种推迟玉米花期的试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一个推迟玉米花期性状的基因。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种玉米基因在控制玉米花期性状中的应用，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1序列为GRMZM2G044126基因在玉米自交系B73中的基因组序列。

本发明还提供了一种推迟玉米开花期的方法，其特征在于：抑制玉米中上述基因编码蛋白的表达和/或活性，选择玉米花期推迟的植株。

在一些实施方案中，上述推迟玉米花期的方法，其特征在于：上述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入、物理或化学诱变中任一种。

在一些实施方案中，上述推迟玉米花期的方法，其特征在于：上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

在一些实施方案中，上述推迟玉米花期的方法，其特征在于：上述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种用于推迟玉米花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；

(2)所述sgRNA的编码DNA分子；

(3)表达所述sgRNA的载体。

本发明还提供了一种用于推迟玉米花期的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。

通过基因编辑突变靶基因可以得到很多不同的编辑类型，这些不同的编辑类型所对应的植株表现并不是完全一样的。本发明经过筛选鉴定，确定SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.7所示的突变基因能够使玉米开花期适度推迟。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制晚花玉米新品种。

本发明还提供了用于检测上述突变基因的引物对，其特征在于：上述引物对为SEQID NO.8和SEQ ID NO.9所示的序列或其互补序列。

本发明还提供了上述引物对在检测上述突变基因中的应用。利用上述引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，并测序分析扩增产物序列，可以确定测定样品中是否含有SEQ ID NO:6或SEQ ID NO.7所示序列的突变基因。

本发明的优点及有益效果如下：组蛋白乙酰转移酶会广泛参与植物生长发育的各个方面。玉米中有多个组蛋白乙酰转移酶基因，其中大部分在玉米中的调控作用尚不清楚。本发明通过蛋白结构域比对，在玉米中找到了5个具有MYST结构域的组蛋白乙酰转移酶基因，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术发现GRMZM2G044126基因被编辑后，玉米花期推迟。这表明该基因可用于调控玉米花期性状，抑制GRMZM2G044126基因编码蛋白或使用本发明提供的试剂盒或本发明创制的突变基因可以推迟玉米花期，培育晚花新品种。

附图说明

图1基因编辑载体图。各元件英文及缩写含义列举如下：

RB T-DNA repeat T-DNA右边界重复序列

M13 fwd M13引物序列(正向)

p000204_1F 靶标gRNA序列

Ubi promoter 泛素启动子

3×FLAG 标签序列

SV40NLS 猿猴病毒40核定位信号

Cas9 cas9基因序列

Nucleoplasm in NLS 核定位信号

NOS terminator 胭脂碱合成酶终止子

lac promoter 乳糖启动子

M13 rev M13引物序列(反向)

lac operator 乳糖操纵子

CAP biding site CAP结合位点

CaMV35S promoter(enhanced) 增强的花椰菜花叶病毒35S启动子

BlpR 编码Bar蛋白赋予植物具有草铵膦耐性

CaMV35S polyA single 花椰菜花叶病毒35S多聚腺苷酸序列

LB T-DNA repeat T-DNA左边界重复序列

Kan R 卡那霉素抗性序列

Ori 起始区序列

Bom 骨架区序列

pVS1 RepA pVS1复制子

pVS1 StaA pVS1转录起始区

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

实施例1在玉米中查找MYST蛋白编码基因

在Pfam网站(http://pfam.xfam.org/)中下载zf-MYST.hmm结构域，并用hmmer-3.3.2在玉米B73参考蛋白序列(Zea_mays.AGPv3.25.pep.all.fa)中搜索可编码MYST结构域的基因，共找到5个基因，分别是GRMZM2G044126，GRMZM2G140288，GRMZM2G092533，GRMZM2G465595，GRMZM2G074032。

实施例2利用基因编辑突变玉米MYST基因

本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对5个玉米MYST基因进行定点编辑。实施方式包括基因编辑载体的构建、玉米的遗传转化以及编辑效果的功能验证。具体如下：

1、基因编辑载体的构建

本发明的基因编辑载体为G08943-CPB-ZmUbi-hspCas9，其载体图如图1所示。该载体的基础载体为CPB-ZmUbi-hspCas9。本发明通过OverlapPCR获得双靶U6-sgRNA进而通过同源重组克隆到基础载体中，具体的构建流程如下：

(1)U6启动子的克隆。从B73中克隆U6启动子。

(2)靶标gRNA的设计。将受体材料B73参考基因组序列输入http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行靶标设计。

(3)通过Overlap PCR获得U6-sgRNA。引物对U6F1/U6R用于扩增第一个靶标的U6启动子，产物长度为515bp；引物对gR-1F(3F)/gRR1用于扩增第一个靶标的sgRNA，产物长度为127bp；引物对U6F1/gRR1用于进行Overlap PCR第2步扩增(U6-sgRNA)，产物长度为634bp。Overlap PCR第1步分别扩增U6和sgRNA，PCR产物分别稀释50倍后混合作为模板进行Overlap PCR第2步扩增。扩增产物电泳切胶回收并测序确认序列。Overlap PCR体系和条件如下：Overlap PCR第1步的15μL的反应体系如下，模板DNA(U6或sgRNA，≥30ng/μL)：0.5μL，Primer F/R：各1.2μL，灭菌ddH₂O：3.7μL，2×phanta max Buffer：7.5μL，dNTP mix：0.6μL，Phanta酶(产品编号：P505-d1/d2/d3)：0.3μL。Overlap PCR第2步的反应体系为30μL体系。U6吸1μL，加49μL ddH₂O稀释；sgRNA吸1μL，加49μL ddH2O稀释各吸10μL，混匀。具体如下：混合模板DNA(U6+sgRNA)：1.5μL，Primer F/R：各2.4μL，灭菌ddH2O：6.9μL，2×phanta maxBuffer：15μL，dNTP mix：1.2μL，Phanta酶：0.6μL。Overlap PCR程序如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃30秒，(3)62℃35秒，(4)72℃30秒，第(5)步是从(2)步－(4)步循环32次，(6)72℃10分钟，(7)25℃5分钟。载体构建所需的引物序列见表1。

表1载体构建所需的引物序列

(4)通过重组克隆构建到骨架载体。将CPB-Ubi-hspcas9载体用HindIII消化，回收。通过同源重组将U6-gRNA和载体二者连接。配反应液前保证各Overlap产物浓度接近一致，20μL的同源重组体系如下：Cas Hind III：3μL，T-1F Overlap：1μL，灭菌ddH2O：10μL，5×CE MultiS buffer：4μL，Exnase MultiS(产品编号：C113-01/02)：2μL。

2、玉米遗传转化

将载体通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米自交系KN5585(未米生物科技(江苏)有限公司选育的自交系)的幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。

3、基因编辑植株的表型鉴定

对获得的基因编辑材料进行表型鉴定，发现GRMZM2G044126基因编辑后，玉米开花时间明显比未编辑的植株延迟，表明该基因具有玉米开花的调控作用。

实施例3玉米编辑位点的鉴定

GRMZM2G044126这个基因编辑时设计的靶标位点如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。含有这个靶标的载体所表达的gRNA序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。为了分析编辑靶点的变化情况，在靶标区域两侧设计引物SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

提取叶片DNA，PCR扩增测序检测基因编辑情况。扩增靶标编辑区段，扩增体系为：DNA：3μL，双向引物各1μL，2×TaqMix：7.5μL，ddH₂O：2.5μL，总体积10μL。PCR反应条件如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃40秒，(3)57℃30秒，(4)72℃60秒，(5)从(2)步－(4)步循环35次，(6)72℃7分钟，(7)4℃保存。PCR产物交由武汉擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。将转化株与受体KN5585的PCR扩增测序结果进行比较，发生碱基替换、插入或缺失的材料即为阳性编辑材料，否则为阴性材料。

序列比较后发现共有2种编辑类型的材料，其中一种在两个靶点处删除了216bp，另外一种在两个靶点处删除了179bp(表2)。因此，编辑后，A1和A2材料的基因序列分别由SEQ ID NO.1变为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。

表2基因编辑玉米材料的花期性状数据

“＝”表示删除序列，方框表示PAM序列，下划线表示编辑靶标。

2018年夏季在吉林省试验地调查A1材料的开花期性状，2019年冬季在海南省试验地调查A2材料的开花期性状，具体包括抽雄期、散粉期、吐丝期，结果如表3所示。A1和A2已编辑的材料比未编辑的对照材料的花期有不同程度的延迟，证明该基因控制花期性状，基因编辑后花期推迟。

表3基因编辑玉米材料的花期性状数据

花期数据以平均值±标准差表示，单位：天。“CK”表示未编辑的对照材料。“*”表示与对照相比有极显著差异(P<0.05)，“**”表示与对照相比有极显著差异(P<0.01)。

因此SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变基因能够使玉米开花期适度延迟。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制晚花玉米新品种。

在导入的过程中，利用SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列的引物对可以检测玉米基因组中是否含有上述突变基因，用该引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，

如果扩增产物大小为193bp，则包含SEQ ID NO.6所示的突变基因；如果扩增产物大小为230bp，则包含SEQ ID NO.7所示的突变基因；如果扩增产物大小为403bp，则为未编辑的基因型。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中农业大学，吉林省农业科学院，未米生物科技（江苏）有限公司

<120> 推迟玉米花期的方法、试剂盒、基因

<130> 1

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4925

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

tcggtaaggt acgaaagccc aacgggcccc aaacagtcca gaaggggctc tcacaccgga 60

tccgctctgg ctccaacaac gtgatgggct ccatggaagc gtcgaccgcg ccggagaacg 120

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agttcacaat gatatgaatc tatggtctat tttgttaagc tgcttcagta gtttctgtac 2760

aagatatgtt tcgcgccagt ggagtggatc atttaatgct agagaacatc tgcattctgt 2820

tgaatgtgtt tttctctttt caggaaaaac actccgaaga atcttataat ttggcttgca 2880

ttctcactct ccccccatac caaagaaaag gatatgggaa gttcctgatt gctttctgta 2940

agtatggctg ttgatgttgt atgttccatt ttatgatcat taaagtttga atatcttgtg 3000

ggacaaatag tactttaggc attttattca ctgaagaact gtttttgctg ttgtagcata 3060

tgaactttcc aagaaagaag gtaaagttgg gacaccggag cgccctctct ctgatcttgg 3120

tctgctcagc tatagaggtt attggactag agtgcttctg gaaattctaa agaaacataa 3180

gggaaacata tctataaagg taacaccctt ccatccagat ataccttttt cgttgtacaa 3240

atttcgaaag ctgattgaat tatgatgcag cagttctaga aagaaacttt ctattggctc 3300

ctcatattac cctacttaac ccttgatcta tgaccaaaaa aggttagccc ctgtgtttca 3360

tagattacac ttcaataaac aggtggattt tctgtgctgc aattgcgtgt tagtcaaaca 3420

ttccctgaat aaggacattt agtagtcttc tagaacataa tgtatggtaa tggtcttttt 3480

ggatgagaaa gatcacctca ggaatgttta ggtttagtcc agttccaaca tcctctttcc 3540

aaacatatct taaaatacca ggttacatgt ggagtcagct ttatattact cggtgctgtt 3600

atctggtata aaaactggct tttcatctta gttatcctgc tactgcatgt cttgcctggg 3660

ccctgaaact tttgggtgca tgtgaagcga ctagtttggt ggtagatatc atcatctgga 3720

attctggata tttatgggat cgtagttgtc agcacagtgt actgtgtcgc tattcgggga 3780

ggtagtatgt acgggtggta gattgttata cctggcttca gctcttcaag cagtagattt 3840

ttttttttac cgaaaaacag gtggatggag cagttagtcg atgttattct tttcactcct 3900

aggagaatca tgtttgttat cgaaagcact ataacatcgc agaagagaca aaacatgtaa 3960

atagtaacat atatcatatc ataggcagct gtaacttgta acatcagatg tgcaaggatt 4020

gtagcaaaca atatgctaga cttcaaaccg agtagaagtg tactgaatag ctttaattct 4080

ataactgtga agcccagtgc aatgttgaca gggccacgtg cacccagtga aatatgcaga 4140

aacttcctgc atggaaggac atttgatcca tgtgctctgt gggtcttctg tctgtgccct 4200

cctgtccgtg ttgctgctgc ccttgaaaaa atttggacgt aggaagtatg caaagcagat 4260

catctgacga gagtacatgg aacaattgta ttctgaacgt cattgctgtt gccttcttgt 4320

ccttgatctg taccagtgtt tgttggtaga gtgcacatgc tcgtagtaga accttttttt 4380

tcatgaagac atgtacatga tcatagggtg cccctctagc attcatgagt gtttctgaat 4440

ccaaaaggta gcataacact gttctaacaa gctagttcgt acatgcattt ttttttgtaa 4500

caaactcttg tgcttgcgcg caggaactaa gcgacatgac ggcaataaaa gcagatgaca 4560

tattgagcac gctacagagc ctggacctaa tccagtaccg caaagggcag cacgtcatct 4620

gcgctgaccc gaaggtcctc gaccgccacc tcaaggcggc ggggcggggc ggcctggacg 4680

tcgacgttag caagctcata tggactccct acaaggagca aggctaaaag gcgaactgct 4740

ccgtgtctca gatttagact cgctgaccga tgcgatgcag tccctgtaca tagcatctcc 4800

ccacagctca cttgacttga cttgactcgt gtaccgtgaa actctacttg taactttgaa 4860

catccacatc gttgtctcct catttctcct tgcattaacc atgctacctt tttttttttc 4920

ttgga 4925

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

gagaacggct cctccgctgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 3

gcgcgaccag aagctccacc 20

<210> 4

<211> 103

<212> RNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 4

gagaacggcu ccuccgcugc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 5

<211> 103

<212> RNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 5

gcgcgaccag aagcuccacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 6

<211> 4715

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 6

tcggtaaggt acgaaagccc aacgggcccc aaacagtcca gaaggggctc tcacaccgga 60

tccgctctgg ctccaacaac gtgatgggct ccatggaagc gtcgaccgcg ccggagaacg 120

gctcctcgtg ctcttccccc gccgactacg agtattacgt ccactacacc gagtgtaagg 180

aacctccctg cctcgcgtct cgtcaggatg cttgttgtct agggttaggg gaactttggc 240

ctcgccatct aactcgctga ttgggtgcat aaatacattt agctggaagg tttttttagt 300

gatgaattga gatttctgct tcgttcatct gcacatttca gcaatggttg ttctcgtggt 360

agagaatttt agtctagtca caaacatctt cccacaattt ttgtttgtgt taactgcagt 420

ctgttcagat tattgtagac tgatatatct taaatgattt ggactcacag tcaatagaag 480

acttgacgag tgggttaagc ttgatcagct tgatcttgac actgtcgaga ccgttgtcga 540

tgagaaagta gaagataagg taaatggaga tgcatgccgt tatgctgcta tataccaatg 600

atagttctac cattttcttc acatctagcc agtggcagca tcattagact gccaacgttt 660

tggtgaagca atgtccacaa cttttattga aaacaccagt tttgcaagat gagtgcttga 720

tatgattatc ttttgatatt tatccaggca acaagcttaa agatgacacg gcaccagaaa 780

cgtaaaattg atgaaacaca tgtggaggta tgctgcagat tgttattact catcgttcat 840

ttactatttt cacttaaatg ttatatgaac ttgtcaagat tttttatctg aatattagtt 900

taggcatgag ctctctgtgc attcagtccg aaaaatattt cttcctcatt tggccccaat 960

cattttggta gcaaggacat gaggagcttg atgcagccag cttgcgggaa catgaagaat 1020

tcacaaaggt gaaaaatatc gcgaagatcg aactggggag atatgagata gacacatggt 1080

atttctctcc ttttccacca gagtataatg actgcccgaa gctgtttttc tgtgaatttt 1140

gcctcaactt catgaagcgc aaagaacagc ttcagaggca catggtgagc tatacttgtt 1200

tatgctttat accttaccta tttgttagat acatgctact aatatgagat taaaaaaact 1260

ggtattagta agctcgcttc ttgtttatct aaactatcta tcatccattt ctgtttagtt 1320

ttaacctagg tgctagtgct agactggcca cccagaggct acgaagcagg tactagagta 1380

tcaagactgc aactagaagt tctagatggt aatgcactgt atcagcaaac atccatatac 1440

tgaagtaaac aaataaccac aaaaaattag tcttacaaca tgcagtttgg catgtcttgc 1500

tattaatcga tgctactcaa tatataacca tactgtactt acttttaata gctgagcaac 1560

tagccaacaa cacatgacaa ggccacacac acacagacac cctaaaacag tggatggttt 1620

cttgaagtgg ttcttaatat cattttattt gcttttacag aagaagtgtg atcttaagca 1680

ccccccaggt gatgaaatct atagaagtgg aactctatca atgttcgagg taagttttgt 1740

gtccatctta gtttcttcca taagtatttt ctattcagac atcttaaatc ttgatcctgt 1800

tggttttatt gactcatgtt gatcgggtac caaattttta cttctgccac ttttgagcaa 1860

caacaaagat tttgagaaga tgactcaagc tacagttatg tgaatagtta cttatattat 1920

atactgtagc agtagttaac tagttatacc tcatgcatta actaacagca aagcattttg 1980

atcccaagca agtttgggta ggctagaatg tcttaagagt ttctagcaaa atgtgaaata 2040

agtccatgca ttcactttgt tagcaagtac tgctgattct agaaaattat ggtgccagaa 2100

tgttttgttc agttgtagtt ggtcaattaa aggatctttt tcaaaaccat gtctgcgatg 2160

tttaggaaca tgatcataga cacctattat tcatgaacat gtagaagtta ggagccacac 2220

ttgctgacat tcagcagttt tttatgaatg atgaaattct attgtcaagt tacttgattt 2280

tagtctggag gatagtaatt ggaataatgc atgtacaatg acaggttgat gggaagaaga 2340

acaaggttta tggacagaac ctttgttatc tggctaagct atttcttgat cacaagacat 2400

tgtactatga tgttgatttg ttcttgtttt atgtcctctg cgaatgtgat gatcggggat 2460

gtcatatggt gggatatttc tctaaggtaa agttcacaat gatatgaatc tatggtctat 2520

tttgttaagc tgcttcagta gtttctgtac aagatatgtt tcgcgccagt ggagtggatc 2580

atttaatgct agagaacatc tgcattctgt tgaatgtgtt tttctctttt caggaaaaac 2640

actccgaaga atcttataat ttggcttgca ttctcactct ccccccatac caaagaaaag 2700

gatatgggaa gttcctgatt gctttctgta agtatggctg ttgatgttgt atgttccatt 2760

ttatgatcat taaagtttga atatcttgtg ggacaaatag tactttaggc attttattca 2820

ctgaagaact gtttttgctg ttgtagcata tgaactttcc aagaaagaag gtaaagttgg 2880

gacaccggag cgccctctct ctgatcttgg tctgctcagc tatagaggtt attggactag 2940

agtgcttctg gaaattctaa agaaacataa gggaaacata tctataaagg taacaccctt 3000

ccatccagat ataccttttt cgttgtacaa atttcgaaag ctgattgaat tatgatgcag 3060

cagttctaga aagaaacttt ctattggctc ctcatattac cctacttaac ccttgatcta 3120

tgaccaaaaa aggttagccc ctgtgtttca tagattacac ttcaataaac aggtggattt 3180

tctgtgctgc aattgcgtgt tagtcaaaca ttccctgaat aaggacattt agtagtcttc 3240

tagaacataa tgtatggtaa tggtcttttt ggatgagaaa gatcacctca ggaatgttta 3300

ggtttagtcc agttccaaca tcctctttcc aaacatatct taaaatacca ggttacatgt 3360

ggagtcagct ttatattact cggtgctgtt atctggtata aaaactggct tttcatctta 3420

gttatcctgc tactgcatgt cttgcctggg ccctgaaact tttgggtgca tgtgaagcga 3480

ctagtttggt ggtagatatc atcatctgga attctggata tttatgggat cgtagttgtc 3540

agcacagtgt actgtgtcgc tattcgggga ggtagtatgt acgggtggta gattgttata 3600

cctggcttca gctcttcaag cagtagattt ttttttttac cgaaaaacag gtggatggag 3660

cagttagtcg atgttattct tttcactcct aggagaatca tgtttgttat cgaaagcact 3720

ataacatcgc agaagagaca aaacatgtaa atagtaacat atatcatatc ataggcagct 3780

gtaacttgta acatcagatg tgcaaggatt gtagcaaaca atatgctaga cttcaaaccg 3840

agtagaagtg tactgaatag ctttaattct ataactgtga agcccagtgc aatgttgaca 3900

gggccacgtg cacccagtga aatatgcaga aacttcctgc atggaaggac atttgatcca 3960

tgtgctctgt gggtcttctg tctgtgccct cctgtccgtg ttgctgctgc ccttgaaaaa 4020

atttggacgt aggaagtatg caaagcagat catctgacga gagtacatgg aacaattgta 4080

ttctgaacgt cattgctgtt gccttcttgt ccttgatctg taccagtgtt tgttggtaga 4140

gtgcacatgc tcgtagtaga accttttttt tcatgaagac atgtacatga tcatagggtg 4200

cccctctagc attcatgagt gtttctgaat ccaaaaggta gcataacact gttctaacaa 4260

gctagttcgt acatgcattt ttttttgtaa caaactcttg tgcttgcgcg caggaactaa 4320

gcgacatgac ggcaataaaa gcagatgaca tattgagcac gctacagagc ctggacctaa 4380

tccagtaccg caaagggcag cacgtcatct gcgctgaccc gaaggtcctc gaccgccacc 4440

tcaaggcggc ggggcggggc ggcctggacg tcgacgttag caagctcata tggactccct 4500

acaaggagca aggctaaaag gcgaactgct ccgtgtctca gatttagact cgctgaccga 4560

tgcgatgcag tccctgtaca tagcatctcc ccacagctca cttgacttga cttgactcgt 4620

gtaccgtgaa actctacttg taactttgaa catccacatc gttgtctcct catttctcct 4680

tgcattaacc atgctacctt tttttttttc ttgga 4715

<210> 7

<211> 4752

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 7

tcggtaaggt acgaaagccc aacgggcccc aaacagtcca gaaggggctc tcacaccgga 60

tccgctctgg ctccaacaac gtgatgggct ccatggaagc gtcgaccgcg ccggagaacg 120

gctcctcacc cggtcaaggt gatcgagcgc cgcaagggct ccgcgtgctc ttcccccgcc 180

gactacgagt attacgtcca ctacaccgag tgtaaggaac ctccctgcct cgcgtctcgt 240

caggatgctt gttgtctagg gttaggggaa ctttggcctc gccatctaac tcgctgattg 300

ggtgcataaa tacatttagc tggaaggttt ttttagtgat gaattgagat ttctgcttcg 360

ttcatctgca catttcagca atggttgttc tcgtggtaga gaattttagt ctagtcacaa 420

acatcttccc acaatttttg tttgtgttaa ctgcagtctg ttcagattat tgtagactga 480

tatatcttaa atgatttgga ctcacagtca atagaagact tgacgagtgg gttaagcttg 540

atcagcttga tcttgacact gtcgagaccg ttgtcgatga gaaagtagaa gataaggtaa 600

atggagatgc atgccgttat gctgctatat accaatgata gttctaccat tttcttcaca 660

tctagccagt ggcagcatca ttagactgcc aacgttttgg tgaagcaatg tccacaactt 720

ttattgaaaa caccagtttt gcaagatgag tgcttgatat gattatcttt tgatatttat 780

ccaggcaaca agcttaaaga tgacacggca ccagaaacgt aaaattgatg aaacacatgt 840

ggaggtatgc tgcagattgt tattactcat cgttcattta ctattttcac ttaaatgtta 900

tatgaacttg tcaagatttt ttatctgaat attagtttag gcatgagctc tctgtgcatt 960

cagtccgaaa aatatttctt cctcatttgg ccccaatcat tttggtagca aggacatgag 1020

gagcttgatg cagccagctt gcgggaacat gaagaattca caaaggtgaa aaatatcgcg 1080

aagatcgaac tggggagata tgagatagac acatggtatt tctctccttt tccaccagag 1140

tataatgact gcccgaagct gtttttctgt gaattttgcc tcaacttcat gaagcgcaaa 1200

gaacagcttc agaggcacat ggtgagctat acttgtttat gctttatacc ttacctattt 1260

gttagataca tgctactaat atgagattaa aaaaactggt attagtaagc tcgcttcttg 1320

tttatctaaa ctatctatca tccatttctg tttagtttta acctaggtgc tagtgctaga 1380

ctggccaccc agaggctacg aagcaggtac tagagtatca agactgcaac tagaagttct 1440

agatggtaat gcactgtatc agcaaacatc catatactga agtaaacaaa taaccacaaa 1500

aaattagtct tacaacatgc agtttggcat gtcttgctat taatcgatgc tactcaatat 1560

ataaccatac tgtacttact tttaatagct gagcaactag ccaacaacac atgacaaggc 1620

cacacacaca cagacaccct aaaacagtgg atggtttctt gaagtggttc ttaatatcat 1680

tttatttgct tttacagaag aagtgtgatc ttaagcaccc cccaggtgat gaaatctata 1740

gaagtggaac tctatcaatg ttcgaggtaa gttttgtgtc catcttagtt tcttccataa 1800

gtattttcta ttcagacatc ttaaatcttg atcctgttgg ttttattgac tcatgttgat 1860

cgggtaccaa atttttactt ctgccacttt tgagcaacaa caaagatttt gagaagatga 1920

ctcaagctac agttatgtga atagttactt atattatata ctgtagcagt agttaactag 1980

ttatacctca tgcattaact aacagcaaag cattttgatc ccaagcaagt ttgggtaggc 2040

tagaatgtct taagagtttc tagcaaaatg tgaaataagt ccatgcattc actttgttag 2100

caagtactgc tgattctaga aaattatggt gccagaatgt tttgttcagt tgtagttggt 2160

caattaaagg atctttttca aaaccatgtc tgcgatgttt aggaacatga tcatagacac 2220

ctattattca tgaacatgta gaagttagga gccacacttg ctgacattca gcagtttttt 2280

atgaatgatg aaattctatt gtcaagttac ttgattttag tctggaggat agtaattgga 2340

ataatgcatg tacaatgaca ggttgatggg aagaagaaca aggtttatgg acagaacctt 2400

tgttatctgg ctaagctatt tcttgatcac aagacattgt actatgatgt tgatttgttc 2460

ttgttttatg tcctctgcga atgtgatgat cggggatgtc atatggtggg atatttctct 2520

aaggtaaagt tcacaatgat atgaatctat ggtctatttt gttaagctgc ttcagtagtt 2580

tctgtacaag atatgtttcg cgccagtgga gtggatcatt taatgctaga gaacatctgc 2640

attctgttga atgtgttttt ctcttttcag gaaaaacact ccgaagaatc ttataatttg 2700

gcttgcattc tcactctccc cccataccaa agaaaaggat atgggaagtt cctgattgct 2760

ttctgtaagt atggctgttg atgttgtatg ttccatttta tgatcattaa agtttgaata 2820

tcttgtggga caaatagtac tttaggcatt ttattcactg aagaactgtt tttgctgttg 2880

tagcatatga actttccaag aaagaaggta aagttgggac accggagcgc cctctctctg 2940

atcttggtct gctcagctat agaggttatt ggactagagt gcttctggaa attctaaaga 3000

aacataaggg aaacatatct ataaaggtaa cacccttcca tccagatata cctttttcgt 3060

tgtacaaatt tcgaaagctg attgaattat gatgcagcag ttctagaaag aaactttcta 3120

ttggctcctc atattaccct acttaaccct tgatctatga ccaaaaaagg ttagcccctg 3180

tgtttcatag attacacttc aataaacagg tggattttct gtgctgcaat tgcgtgttag 3240

tcaaacattc cctgaataag gacatttagt agtcttctag aacataatgt atggtaatgg 3300

tctttttgga tgagaaagat cacctcagga atgtttaggt ttagtccagt tccaacatcc 3360

tctttccaaa catatcttaa aataccaggt tacatgtgga gtcagcttta tattactcgg 3420

tgctgttatc tggtataaaa actggctttt catcttagtt atcctgctac tgcatgtctt 3480

gcctgggccc tgaaactttt gggtgcatgt gaagcgacta gtttggtggt agatatcatc 3540

atctggaatt ctggatattt atgggatcgt agttgtcagc acagtgtact gtgtcgctat 3600

tcggggaggt agtatgtacg ggtggtagat tgttatacct ggcttcagct cttcaagcag 3660

tagatttttt tttttaccga aaaacaggtg gatggagcag ttagtcgatg ttattctttt 3720

cactcctagg agaatcatgt ttgttatcga aagcactata acatcgcaga agagacaaaa 3780

catgtaaata gtaacatata tcatatcata ggcagctgta acttgtaaca tcagatgtgc 3840

aaggattgta gcaaacaata tgctagactt caaaccgagt agaagtgtac tgaatagctt 3900

taattctata actgtgaagc ccagtgcaat gttgacaggg ccacgtgcac ccagtgaaat 3960

atgcagaaac ttcctgcatg gaaggacatt tgatccatgt gctctgtggg tcttctgtct 4020

gtgccctcct gtccgtgttg ctgctgccct tgaaaaaatt tggacgtagg aagtatgcaa 4080

agcagatcat ctgacgagag tacatggaac aattgtattc tgaacgtcat tgctgttgcc 4140

ttcttgtcct tgatctgtac cagtgtttgt tggtagagtg cacatgctcg tagtagaacc 4200

ttttttttca tgaagacatg tacatgatca tagggtgccc ctctagcatt catgagtgtt 4260

tctgaatcca aaaggtagca taacactgtt ctaacaagct agttcgtaca tgcatttttt 4320

tttgtaacaa actcttgtgc ttgcgcgcag gaactaagcg acatgacggc aataaaagca 4380

gatgacatat tgagcacgct acagagcctg gacctaatcc agtaccgcaa agggcagcac 4440

gtcatctgcg ctgacccgaa ggtcctcgac cgccacctca aggcggcggg gcggggcggc 4500

ctggacgtcg acgttagcaa gctcatatgg actccctaca aggagcaagg ctaaaaggcg 4560

aactgctccg tgtctcagat ttagactcgc tgaccgatgc gatgcagtcc ctgtacatag 4620

catctcccca cagctcactt gacttgactt gactcgtgta ccgtgaaact ctacttgtaa 4680

ctttgaacat ccacatcgtt gtctcctcat ttctccttgc attaaccatg ctaccttttt 4740

ttttttcttg ga 4752

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 8

tcggtaaggt acgaaagccc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 9

aggcagggag gttccttaca 20

Claims (9)

1.一种玉米基因在控制玉米花期性状中的应用，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种推迟玉米花期的方法，其特征在于：抑制玉米中权利要求1中所述基因编码蛋白的表达和/或活性，选择玉米花期推迟的植株。

3.根据权利要求2所述推迟玉米花期的方法，其特征在于：所述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑或RNA干扰中任一种。

4.根据权利要求3所述推迟玉米花期的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

5.根据权利要求4所述推迟玉米花期的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

6.一种用于推迟玉米花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；

(2)所述sgRNA的编码DNA分子；

(3)表达所述sgRNA的载体。

7.一种用于推迟玉米花期的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。

8.用于检测权利要求7所述突变基因的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示的序列。

9.权利要求8所述的引物对在检测权利要求7所述突变基因中的应用。