CN113061602A

CN113061602A - 一种高通量启动子变异创制方法

Info

Publication number: CN113061602A
Application number: CN202110215398.0A
Authority: CN
Inventors: 许洁婷; 黄磊; 韩宝柱; 潘弘; 杜沅昊
Original assignee: Weimi Biotechnology Jiangsu Co ltd
Current assignee: Changzhou Xinmi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2021-07-02

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高通量启动子变异创制方法。本发明使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对基因启动子区域进行饱和突变，通过大量产生启动子变异，并对突变体进行基因型和表型的鉴定，将启动子顺式元件突变、表达水平、转录本模式与表型进行四维关联分析，鉴定启动子对基因的调控模式变化，从而筛选出有价值的启动子变异。该方法可用于研究启动子中的顺式元件功能、改变目标基因表达模式、获得具有新功能的启动子片段以及获得具有性状变化的启动子突变材料。

Description

一种高通量启动子变异创制方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高通量启动子变异创制方法。

背景技术

启动子是决定基因表达模式的重要元件。启动子包括转录起始位点，TATA框和上游启动子元件，分为组成型、组织特异型和诱导型等几个种类。具有特定特性的启动子在基因工程领域具有很大的价值，例如CaMV 35S、Actin、ubiquitin等组成型启动子常用于超量表达目的基因；而rbcs等各种组织特异型启动子可用于目的基因的组织特异性表达。然而，受到研究手段的限制，可用的功能明确的启动子仍然相对较少，不能满足需求。

利用报告基因测定启动子活性以及通过不同长度的启动子片段活性测试确定启动子中的顺式元件是全面研究启动子功能的常用手段，然而这种方法获得的结果并不能直接反映启动子在“原位”上的功能，从而影响结果的可靠性。

基因编辑是对物种进行性状改良的有效工具。除了能够对基因进行编辑外，也可以对启动子进行编辑，通过改变启动子特性改变基因的表达，从而实现性状改良的效果。例如，修饰水稻OsSWEET基因启动子可以提高水稻对白叶枯病的抗性(Oliva,R.,Ji,C.,Atienza-Grande,G.et al.Broad-spectrum resistance to bacterial blight in riceusing genome editing[J].Nat Biotechnol.,2019,37,1344-1350)；编辑番茄中的SlCLV3等启动子可以获得连续变化的表型，从而可以对表型进行微调(Rodríguez-Leal D,LemmonZ H,Man J,et al.Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvementby Genome Editing[J].Cell,2017,171:470-480.e8.)。

因此，在“原位”上鉴定启动子中的顺式元件功能，获得能改变基因表达模式的启动子变异对于性状的遗传改良具有重要意义。由于启动子结构的复杂性(影响基因表达的区域可能分布在转录起始位点前的2kb甚至是5kb范围内)和不可预测性(虽然可以初步预测常用顺式元件的位置，但是预测结果并不可靠)，一种在“原位”上高通量鉴定启动子顺式元件和创制有功能的启动子变异的方法就具有很大的价值。

为解决上述问题，本发明利用基因编辑技术，以玉米基因启动子为例，通过启动子饱和突变的方式，高通量产生启动子变异，大量获得各种类型的启动子突变体，并对突变体进行基因型和表型的鉴定，将启动子顺式元件突变、表达水平、转录本模式与表型进行四维关联分析，以鉴定启动子中的顺式元件功能，筛选可以改变目标基因表达模式的变异，获得具有新功能的启动子片段和具有特定性状表现的启动子变异植株。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量启动子变异创制方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种高通量启动子变异创制方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)选取基因上游2000bp-2500bp长度的序列作为目标启动子序列；

2)设计10-25个突变靶标，相邻靶标的间隔在100bp-200bp之间；

3)将步骤2)所述的突变靶标任意3个一组，构建多个编辑载体，并保证所有靶标均包含在编辑载体中；

4)使用构建好的编辑载体对目标启动子进行编辑，分析编辑后的启动子变异序列和目标基因表达量。

在一些实施方案中，上述的启动子为玉米中的启动子，并且步骤3)所述的编辑载体gRNA表达盒含有玉米U6启动子，并使用Overlap PCR方法构建；其中Overlap PCR方法使用的引物序列包括：i)ccaatggtctcaattg靶标1序列gttttagagctagaaatag；ii)ccaatggtctca靶标2其余序列gttttagagctagaaatagca；iii)attggggtctct靶标3序列caattcggtgcttgcggctc。

本发明的优点及有益效果如下：在启动子结构的复杂性和不可预测性的背景下，提供了一种在“原位”上高通量鉴定启动子顺式元件和创制有功能的启动子变异的方法。该方法综合考虑了启动子饱和突变的需求、编辑载体的构建难度以及后期编辑材料鉴定的工作量，可用于研究启动子中的顺式元件功能、改变目标基因表达模式、获得具有新功能的启动子片段以及获得具有性状变化的启动子突变材料。

附图说明

图1玉米VTE4启动子编辑靶标位点分布。

图2基因编辑骨架载体图。

图3启动子基因编辑载体图。各元件英文及缩写含义列举如下：

RB T-DNA右边界重复序列

ZmU61 玉米gRNA启动子

gRNA 靶标gRNA序列

UBI 泛素启动子

Cas9 cas9基因序列

NOS 胭脂碱合成酶终止子

35S 花椰菜花叶病毒35S启动子

Bar 编码Bar蛋白赋予植物具有草铵膦耐性

PolyA 花椰菜花叶病毒35S多聚腺苷酸序列

LB T-DNA左边界重复序列

Kan 卡那霉素抗性序列

pBR322 起始区序列

bom site 骨架区序列

pVS1 pVS1复制子

STA region pVS1转录起始区

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

实施例1目标基因的选择和启动子片段序列

玉米籽粒中的维生素A原、维生素E和油份是对人类健康和动物生长发育有益的重要品质性状。VTE4基因是影响维生素E主要组分——a-生育酚含量的重要基因(Li Q,YangX,Xu S,Cai Y,Zhang D,Han Y,et al.

Genome-Wide Association Studies Identified Three IndependentPolymorphisms Associated withα-Tocopherol Content in Maize Kernels[J].2012,PLoS ONE7(5):e36807.)。本实施例选取玉米VTE4基因的启动子作为基因编辑的目标序列。VTE4基因在B73参考基因组中的编号为Zm00001d017746，根据参考基因组中的序列，以基因上游3kb区域的序列作为参照，设计引物(VTE4F-1：5’-CGTTTGAGAGAGGG-3’；VTE4R-1：5’-TTGCGGCGCCGGGATGCGC-3’)，在玉米品种KN5585中扩增VTE4基因的启动子片段，并测序，获得的长度为2597bp的启动子序列(如SEQ ID NO.1所示)。

实施例2基因编辑载体构建和玉米转化

本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对VTE4启动子进行饱和突变。实施方式包括靶点的设计、基因编辑载体的构建、玉米的遗传转化。具体如下：

1、靶标的设计

使用CRISPR-P网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)以SEQ ID NO.1所示的启动子序列作为目标编辑区段，设计靶标。选用靶标分数高，脱靶标率低，位置合适的靶标共25个(具体见表1)，均匀分布启动子区间，两个靶标间隔100-200bp(靶标分布图见图1)。

表1 VTE4启动子敲除载体靶标组合

最后3位碱基为PAM基序。

2、基因编辑载体的构建

本发明的基因编辑骨架载体为pCXB053，其载体图如图2所示。将设计的基因编辑靶标每3个一组构建到一个载体上(分组情况具体见表2)。

表2 VTE4启动子编辑载体靶标组合

本发明通过OverlapPCR获得靶标U6-sgRNA，进而bsal酶切处理，通过T4连接酶克隆到基础载体中，具体的构建流程如下：

(1)U6启动子的克隆。从B73中克隆U6启动子，序列如SEQ ID NO.2所示。

(2)靶标gRNA的设计。将受体材料B73参考基因组序列输入http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行靶标设计。

(3)通过Overlap PCR获得U6-sgRNA。引物对SG+U6_1F/SG+U6_1R用于扩增第一个靶标+gRNA+U6启动子+第二个靶标的部分序列，产物长度为650bp左右。引物对SG+U6_2F/SG+U6_2R用于扩增第二个靶标的其余序列+gRNA+U6启动子+第三个靶标序列，产物长度为650bp左右。扩增产物电泳切胶回收并测序确认序列。

Overlap PCR体系和条件如下：Overlap PCR反应体系为30μL体系。模板DNA(gRNA+U6)：1.5μL，Primer F/R：各2.4μL，灭菌ddH2O：6.9μL，2×phanta max Buffer：15μL，dNTPmix：1.2μL，Phanta酶：0.6μL。Overlap PCR程序如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃30秒，(3)62℃35秒，(4)72℃30秒，第(5)步是从(2)步－(4)步循环32次，(6)72℃10分钟，(7)25℃5分钟。载体构建所需的引物序列见表3。

表3载体构建所需的引物序列

(4)通过T4连接酶到骨架载体。将载体pCXB053，以上两个PCR产物分别用BASL消化，回收。通过T4连接酶将U6-gRNA和载体二者连接。10μL的T4连接体系如下：Cas HindIII：2μL，pcr bsal：各2μL，灭菌ddH2O：2μL，10×Ligase buffer：1μL，T4 DNA Ligase(产品编号：C301-01)：1μL。

2、玉米遗传转化

将载体通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米自交系KN5585(未米生物科技(江苏)有限公司选育的自交系)的幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。

实施例3启动子突变植株的基因表达分析

测定获得的基因编辑材料的VTE4基因表达量，具体步骤如下。

取苗期叶片组织的样品至少三个生物学重复，用于RNA提取，提取方法用RNA提取试剂盒Quick RNA isolation Kit(Huayueyang,China)。提取过程中加入DNA酶去除基因组DNA，随后利用反转录试剂盒cDNA Synthesis kit(TransGen Biotech,China)将RNA反转录为cDNA，得到20μL cDNA，一般可稀释至50μL,然后利用Bio-Rad CFX96 real-time system(Bio-Rad,USA)仪器进行实时定量PCR来检测每个样品中该基因的表达量，引物为55qp-1。每个样品含有三个技术重复，且将ZmActin(GRMZM2G126010)作为内参用2-^ΔΔCt方法校正基因的表达量(引物为5’-TACGAGATGCCTGATGGTCAGGTCA-3’和5’-TGGAGTTGTACGTGGCCTCATGGAC-3’)，VTE4基因表达量鉴定的引物对为5’-GTACTACCTCCCGGACTGG-3’和5’-CTGGATCATTAGCGGCATCAC-3’。并根据测定的基因表达量分析突变后启动子的功能。

实施例4启动子突变植株的表型鉴定

对获得的基因编辑材料的生育酚含量进行鉴定，具体步骤如下。

(1)磨粉。将烘干的种子取～2.0g(～6-8粒)用Retsch公司(Haan,Germany)MM400球磨仪配合原装25mL钢瓶及12mm钢珠磨成粉末(～90sec)，并存于自封袋避光保存于干燥器中，尽快提取。

(2)称样。用万分之一天平称取0.5-0.6g玉米粉，置于30mL螺口玻璃离心管中，并记录质量。

(3)组织软化。在样品中加入6mL含0.1％BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)的无水乙醇，拧紧盖子，涡旋20sec。

(4)加热。85℃水浴15min，期间每隔5min取出涡旋一次(共2次)，第一次取出时，加入120μL 80％氢氧化钾溶液皂化。

(5)萃取。水浴完成后，立即将样品瓶放入冰中，加入3mL预冷的双蒸水和3mL正己烷，拧紧盖子，涡旋20sec，2700r/min离心5min；用5mL移液器取上清至另一新的螺口玻璃离心管中；重复以下步骤3次：加3mL正己烷、涡旋20sec、2700r/min离心5min、用移液器取上清至洁净的螺口玻璃离心管中。最终上清体积约为12mL。

(6)清洗。在含上清液的新螺口玻璃离心管中加3mL预冷的ddH₂O、涡旋20sec、2700r/min离心5min、用移液器移取上层(正己烷层)至15mL尖底玻璃管中；然后，在第二套螺口玻璃离心管中加入2mL正己烷，涡旋20sec，2700r/min离心5min，吸取上层清液至尖底玻璃管中。

(7)吹干。用低温真空离心浓缩仪干燥尖底玻璃管中总的正己烷相，设置仪器15℃，约需2h。

(8)溶解。准确加入1mL流动相(乙腈：含有三乙胺<TEA>和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚<BHT>的甲醇3:1)溶解样品，用1mL注射器混匀并吸取全部液体，通过0.22μm PTFE(聚四氟乙烯)材质过滤器将液体加入2mL棕色样品瓶中。

(9)检测。样品用Waters公司(Milford,MA,USA)的UPLC检测，所用色谱柱为Waters公司的BEH C18色谱柱(粒径1.7μm，2.1×100mm)，检测波长为295nm。采用等度洗脱，流速为0.3mL/min，上样量为10μL。流动相A：乙腈(75％体积)，流动相B：甲醇(25％体积)，每250mL甲醇含有0.5mL TEA和0.028g的BHT。每个样品运行10分钟。

(10)含量计算。手动积分得出对应峰面积(出峰时间参照标样)。根据标准曲线算出样品中生育酚含量，并用称量质量校正。

根据分析得到的生育酚含量确定突变后启动子的功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 未米生物科技（江苏）有限公司

<120> 一种高通量启动子变异创制方法

<130> 1

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2597

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 1

cgtttgagag agggaagggt tgaaagagac ccggcctttg tggcctcctc aacggggagt 60

aggtttgcaa aaaccgaacc tcggtaaaac aaatctccgt gtctcacttg ttcatttgct 120

tgggatttgt tttgcgccct ctctcgcgga ctcatttctt tattactaac gctaatcccg 180

gcttgtagtt gtgattattt gtgtaaattt cagtttcgcc ctattcaccc ccctctaggc 240

gactatcaac gtcccatcgc tcctcctcgc ttgctacgtc gcctcttcct cttcgagatc 300

catgctacag gttcgtccct tcctcgctct ctctatcgtt tcttcgtcgt accactcgtg 360

acaacgttag gatttgccac catttctctc ttcagtcttt cgtcggtttc acggttctag 420

ggtttatgtc ctccgtctgc gagatctttg gtcggcttca tggttctagg ctttgtgttt 480

ctaccggcgg atgcgtgacg gagaatcact ttccctgacc tcctcaccct tttctcaacc 540

tgtgattcat tgtttgcgtg ctctgttggt gagatccgga aaaacaactt ttagttccta 600

tgtgctagtg acatatgagg atgccatgca aggaaaatat gaacaacatc ttctgtataa 660

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ttcggtgcag tcctacttca caaagataaa cgtttcattc taattagagc cagtatctct 780

tcccttttaa ctgaaaccat tcacccagat gcctcatcga tgcacagaaa caatcgtcaa 840

atcagcttag attagacaat ggcattaacg gtagatgtaa tgtcgttgcc tccagatcac 900

tggatatgca gaaacataac atatactact tgtagacaag acaaacatat gaggttaata 960

aagatagacg tagccataga aactttgaaa gataccatgc aaagtttaga ctgcaagaaa 1020

caaggaatat tattcaatca ttaactgacc gttgctacta tatcaattta ttcattcttt 1080

gcattggcta gctaaaatgt cagaacaaaa caaaatcaaa actgaagtac tctcgattat 1140

tctagcaagt tctagttgcc gtgccaacag gtcagattcg attgcatcaa cagtcttgca 1200

ctatagcata cctacccaac atggatggtg aagactagtt tgttcgaagc tcaattttct 1260

tgcgtggcgg ttaaaaagca gtggcggagg acaaaaaaaa taaatggggt atggcaacat 1320

acctggtttc tggtagaata aaaagaaaaa aatggtgcaa actgcaggaa tgtacctggt 1380

agctaggaga agaaagaaaa acggaccaac agaagggatt atatatcgac caaagcacaa 1440

ccactactcc acatatgctt tagtactcaa gtgagatata aaatttgagg tatggcagct 1500

gctatattgc gccataatgg gtactccgtc actgttaaaa agtgatggga gtctcatata 1560

tcgtatatgc acagtgcacc tatatgatgc atagatatta ttagattata ttataatata 1620

taaacttata gttaatgaca taaatattgg tatttattat aaaaatgtta aactcaaagg 1680

ctagtttggt ggggctttag accatcctaa aatgcctccg tatctctagt tttgggcttt 1740

tggctcctct tgtgaagcta aagacgtttg gcaaaaataa atctagtgac aatttattac 1800

tccgtccata ccaaattaat attcgttgta tgaatctggg caaatgtaga aaacaaattc 1860

attaattatt gtataaatct attaaaaatg aaattggatt ttaatttaca acagatagag 1920

tataattcta caactttaaa gcacttacat catgggaaac cgaacgagct ataaaaaagg 1980

atcagccttc ttttcaactc atattttcct tggccttttg actaagttaa aatgtaacat 2040

ttgctcttgt cggtttaata tatgaaatat aaaccatatg ttcagtttca tattaaattt 2100

attttttata tgtatcaaat ataattgtgt gccgtcgtaa catggatatt gtactatcta 2160

gttacgttaa atctgtaagg aagatcagaa aacactgcgt tttctcaact ctggtttcgg 2220

agccctcttt gcaagcgttg tttttaaatg gccatttggc atagctctat attaagaatc 2280

ataaaaaagt ccaaatcgga gctacaccaa aaggagaccc ttgaatagtt tgattaaaaa 2340

ctagtattgt acaatttttc ataacggaga tagcacgaaa ctaggatttt tcatttcaca 2400

ttttcagcaa attcacacgg ccacgtgggg catggatatt caagggacaa ggggcaccac 2460

gttgtccatt tccctgccgg cacctctact ttatcactag gctacgaaac agtgccgcgg 2520

tgcgcgcaca cacagccacc acagcccaga cccctcgcct cggcctcttt taaatatcgc 2580

gcatcccggc gccgcaa 2597

<210> 2

<211> 497

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

gctgtttttg ttagccccat cgaatccttg acataatgat cccgcttaaa taagcaacct 60

cgcttgtata gttccttgtg ctctaacaca cgatgatgat aagtcgtaaa atagtggtgt 120

ccaaagaatt tccaggccca gttgtaaaag ctaaaatgct attcgaattt ctactagcag 180

taagtcgtgt ttagaaatta tttttttata tacctttttt ccttctatgt acagtaggac 240

acagtgtcag cgccgcgttg acggagaata tttgcaaaaa agtaaaagag aaagtcatag 300

cggcgtatgt gccaaaaact tcgtcacaga gagggccata agaaacatgg cccacggccc 360

aatacgaagc accgcgacga agcccaaaca gcagtccgta ggtggagcaa agcgctgggt 420

aatacgcaaa cgttttgtcc caccttgact aatcacaaga gtggagcgta ccttataaac 480

cgagccgcaa gcaccga 497

Claims

1.一种高通量启动子变异创制方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)选取基因上游2000bp-2500bp长度的序列作为目标启动子序列；

2)设计10-25个突变靶标，相邻靶标的间隔在100bp-200bp之间；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的启动子为玉米中的启动子；

步骤3)所述的编辑载体gRNA表达盒含有玉米U6启动子，并使用Overlap PCR方法构建；

其中Overlap PCR方法使用的引物序列包括：i)ccaatggtctcaattg靶标1序列gttttagagctagaaatag；ii)ccaatggtctca靶标2其余序列gttttagagctagaaatagca；iii)attggggtctct靶标3序列caattcggtgcttgcggctc。