CN104628839A

CN104628839A - 一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用

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Publication number: CN104628839A
Application number: CN201510059737.5A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 张龙; 江玲; 卢丙越; 杨春艳; 冯志明; 任玉龙; 郭秀平; 吴赴清
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2035-02-04
Also published as: CN104628839B

Abstract

本发明公开了一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用，属于基因工程领域。本发明提供的蛋白质，命名为FLO7蛋白，来自水稻品种Nipponbare，蛋白序列如SEQ ID NO.1，cDNA序列如SEQ ID NO.2。本发明对于进一步阐明禾本科植物胚乳造粉体发育的分子机理并通过基因工程的技术和手段对谷物品质的遗传改良具有重要的理论意义和现实意义。

Description

一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。我国是世界上最大的水稻生产和消费国。近些年来，水稻总产保持在1.9-2.0亿吨，种植面积维持在0.30-0.32亿公顷，总产量与播种面积均居世界前列，在国民经济中具有十分重要的意义。淀粉占稻米干重90％左右，居所有粮食作物之首。作为我国传统主食，稻米淀粉的性质决定了稻米的食用、加工以及其适用性。因此对其合成加工途径的深入研究，将有助于我们通过基因工程的手段对稻米进行品质改良。

种子的形成过程是贮藏淀粉在造粉体(特殊的质体)内经过一系列淀粉合成酶催化加工形成可见淀粉颗粒的过程，同时伴随着胚乳细胞内造粉体和淀粉粒的增殖和发育。在此过程中，种子逐渐膨大成熟，最后随着膜结构的降解整个胚乳内充满了排列整齐的淀粉颗粒，可见这是一个复杂精细的生物学过程。

水稻胚乳突变体按胚乳的成分可分为：胚乳淀粉突变体、胚乳蛋白质突变体、胚乳微营养突变体。目前水稻中已经克隆出大量控制胚乳淀粉突变体的基因，这些基因大部分是直接参与淀粉合成过程中的合成酶，另一些则通过其它途径间接参与淀粉合成，因此水稻胚乳淀粉突变体，是用来研究水稻胚乳淀粉合成途径机理的理想材料。

发明内容

本发明的目的是提供与水稻胚乳造粉体发育相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FLO7，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。序列表中的SEQ ID NO.1由364个氨基酸残基组成，自氨基末端第70至355位为DUF1338结构域。

编码所述的水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FLO7的基因。

所述的编码水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FLO7的基因，CDS序列优选如SEQ ID NO.1所示，由1092个核苷酸组成，全长序列优选如SEQ ID NO.3所示。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体优选在pCAMBIA2300-Actin1载体的多克隆位点SmaI之间重组插入所述基因(FLO7)得到的重组质粒pCAMBIA2300-FLO7；所述pCAMBIA2300-FLO7是将由FLO7cDNA片段通过重组技术插入到pCAMBIA2300-Actin1多克隆位点SmaI之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。

含有以上任一所述基因(FLO7)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(FLO7)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

一种培育造粉体发育正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入造粉体发育异常的植物中，得到造粉体发育正常的转基因植物；所述造粉体发育异常植物为胚乳外周造粉体碎裂的植物；所述造粉体发育正常的转基因植物为胚乳外周恢复透明，造粉体形态正常的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入造粉体发育异常植物中；所述造粉体发育异常植物可为flo7。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

有益效果：

本发明的造粉体发育相关蛋白影响水稻胚乳中造粉体形成过程。将所述蛋白的编码基因导如造粉体发育异常的植物中，可以得到造粉体发育正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于谷物品质的遗传改良。

附图说明

图1为野生型日本晴和突变体flo7的籽粒以及扫描电镜观察。

图2为野生型日本晴和突变体flo7前期胚乳造粉体形态观察。

图3为野生型日本晴和突变体flo7后期胚乳造粉体形态观察。

图4为转基因植株分子水平检测结果。

图5为转pCAMBIA2300-FLO7的T₁籽粒表型。

图6为突变体和转pCAMBIA2300-FLO7的T₁籽粒的扫描电镜。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、植物造粉体发育相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻粉质选突变体flo7表型分析

在日本晴突变体库中筛选出籽粒粉质表型的株系flo7。

与野生型比较，flo7的主要特征是籽粒胚乳外围粉质，不透明，扫描电镜分析证实，flo7胚乳外围淀粉颗粒松散，透明部位正常(见图1)。通过透射电镜对胚乳发育前期造粉体的观察结果显示，野生型中造粉体上的淀粉颗粒不断吸收营养变大，最后充满造粉体，而突变体flo7中造粉体中的淀粉颗粒不能紧密聚集，造粉体填充速率降低(见图2)。半薄切片观察结果表明野生型种子外周的胚乳细胞中淀粉颗粒紧密呈现多边形，相同时期突变体flo7靠近种子外围的造粉体内部淀粉颗粒不能紧密排，最终表现为复粒淀粉颗粒是碎裂的(见图3)。

综上所述，在突变体flo7中由于胚乳外周造粉体发育异常，导致复合淀粉颗粒在发育后期呈现碎裂的形态，最终造成种子外周粉质的表型。

二、突变基因定位

1、突变基因初步定位

用突变体flo7与籼稻品种Peiai64杂交，在flo7/Peiai64的F₂分离群体中随机选取籽粒粉质的种子，发芽后，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA，构成1个混合基因组池。首先，用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物在flo7和Peiai64之间进行多态性分析，之后每间隔10cM左右挑选一对在两个亲本间有多态的引物。两个亲本DNA连同混池DNA共计三个DNA样本，利用挑选好的覆盖12条染色体的且具有多态的引物进行分析，最后将FLO7定位在第10染色体标记10-1和10-3之间。

上述SSR标记分析的方法如下所述：

(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μl 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μl 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Bechman Instrument Inc.U.S.A)。

(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μl，作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul)1ul，上游引物(2pmol/ul)1ul，下游引物(2pmol/ul)1ul，10xBuffer(MgCl₂free)1ul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl₂(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.1ul，ddH₂O 5.1ul，共10ul。

PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

(3)SSR标记的PCR产物检测

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。

2、突变基因精细定位

根据初步定位的结果，在突变位点所在区域间隔一定区段自行开发SSR标记，以便在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体位点。从flo7/Peiai64杂交组合获得的F₂分离群体中挑出确认为突变表型的F₂种子，用于突变位点的精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、Indel分子标记对突变位点进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变位点，具体方法如下：

(1)SSR标记开发

将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier 5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在flo7和Peiai64之间的多态性，表现多态者用作精细定位FLO7基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。

表2用于精细定位的分子标记

标记	正向引物	反向引物	所在克隆	类型
					10-1	5'CTTAAATGGGCCACATGCG 3'	5'CAAAGCTTCCGGCCAAAAG 3'	OSJNBa0050N08	SSR

10-2	5'TCAGATCTACAATTCCATCC 3'	5'TCGGTGAGACCTAGAGAGCC 3'	OSJNBa0018F16	SSR
					10-3	5'CTCAGTTGTTGGGGGATGAG 3'	5'CTTTGGAGATGTGCCAGAGA 3'	OSJNBb0049A16	Indel
Z10	5'CATCTGCGGGTTGAGTGT 3'	5'TGACATTTCAGTTCTATTGGAC 3'	OSJNBa0006L06	Indel
					Z15	5'TTTTGATGATGCCTACTCCA 3'	5'GTAATTTGAAAAGCGTGCC 3'	OSJNBa0026O12	Indel
Z5	5'TTGATTACAACCAACTCTGACC 3'	5'CAATTGAGTAAGTCTGCTTGTGA 3'	OSJNBa0071K18	Indel
					Z24	5'TGTTTGCAGTTTCAATTAGGTAAG 3'	5'AGTTTTGATTGGAAATGGGG 3'	OSJNBa0071K18	Indel
Z7	5'TCTGACGAAGTACACCTCCTG 3'	5'GTCCCAAACCTCTAAATGAATA 3'	OSJNBa0079L16	Indel

(2)Indel标记开发

Indel引物设计：下载突变位点附近日本晴的BAC/PAC克隆序列，在NCBI数据库中与籼稻品种93-11序列进行比对，寻找两者之间存在的4个及4个以上碱基缺失的位置，运用PrimerPremier 5.0软件设计含有缺失位点的引物，从而获得具有多态性的引物(表2)。

标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，正向引物(10pmol/ul)2ul，反向引物(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，总体积20ul。

SSR以及Indel引物扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃(引物不同，有所调整)45sec，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。

根据F₂群体中胚乳粉质单株的分子数据和表型数据，按照Zhang等报道的“隐性极端个体基因作图”方法，最终把FLO7基因精细定位在PAC克隆OSJNBa0071K18上，标记Z5和Z24之间，物理距离约为83kb(图1)。候选区段基因组测序显示，在flo7中，基因Os10g0463800中存在一个碱基的突变，由G突变为T,造成RNA水平上剪切紊乱，移码，最终导致该基因编码蛋白时提前终止。

(3)突变基因的获得

根据定位的位点设计引物，序列如下所述：

primer1：

5'-TTCGCCTCCAGTGCTCGC-3'(SEQ ID NO.4)

primer2：

5'-CACAGAGAACACTCCTTCAATACGC-3'(SEQ ID NO.5)

以primer1和primer2为引物，以日本晴的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃1.5min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后克隆到载体pEASY(北京全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码364个氨基酸残基组成的蛋白质(从ATG到TGA)(见序列表的SEQ ID NO.1)。将SEQ IDNO.1所示的蛋白命名为FLO7(即为基因定位中所述的FLO7基因)，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名FLO7。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

以日本晴的cDNA为模板，进行PCR扩增获得FLO7基因，PCR引物序列如下：

primer3(下划线所示的序列为SmaI酶切位点)：

5'GTAGAAGAGGTACCCGGGTTCGCCTCCAGTGCTCGC 3'(SEQ ID NO.6)

primer4(下划线所示的序列为SmaI酶切位点)：

5'CTCTAGAGGATCCCCGGGCACAGAGAACACTCCTTCAATACGC 3'(SEQ ID NO.7)

将PCR产物回收纯化,采用Infusion重组试剂盒(Clontech)将PCR产物克隆到载体pCAMBIA2300-Actin中，构建成pCAMBIA2300-FLO7。

重组反应体系(10.0μL)：PCR产物5.4μL(50-100ng)，pCAMBIA2300-Actin载体1.6μL(30-50ng)，5×Infusion buffer 2.0μL，Infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系37℃水浴0.5h以上，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司；CB101)。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ ID NO.3所示全长基因的重组表达载体，将含有FLO7的pCAMBIA2300命名为pCAMBIA2300-FLO7,FLO7基因插入在多克隆位点SmaI之间。

二、重组农杆菌的获得

用电击法将pCAMBIA2300-FLO7转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英骏公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA2300-FLO7。

三、转基因植物的获得

分别将EH-pCAMBIA2300-FLO7转化突变体flo7，具体方法为：

(1)28℃培养EH-pCAMBIA2300-FLO7培养16小时，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L乙酰丁香酮的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的flo7水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L抗卡那霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L抗卡那霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L抗卡那霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；

得到分化成苗的T₀代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

1、PCR分子鉴定

将步骤三获得的T₁代植株提取基因组DNA,以基因组DNA为模板，利用Primer5和Primer6为引物对进行扩增(Primer5：TTAATAACACATTGCGGACGT(SEQ ID NO.8)和Primer6：GGATTGCACGCAGGTTCTC(SEQ ID NO.9))。PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer1(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

用试剂盒(北京Tiangen公司)纯化回收PCR产物。PCR产物用1％的琼脂糖电泳检测,图4中泳道1和2为未转基因植株野生型和突变体flo7基因组DNA扩增产物；泳道3为pCAMBIA2300-Actin空载体转基因植株，作为阴性对照。泳道4-6为转基因阳性株系，作为阳性对照。

2、表型鉴定

分别将T₁代转pCAMBIA2300-FLO7植株，日本晴和flo7种植在南京农业大学试验田内。种子成熟后，收取各材料种子，观察到pCAMBIA2300-FLO7阳性植株的种子中出现了透明的种子(图5，L1、L2、L3是三个不同的转基因株系)，种子横截面扫描电镜结果也表明互补株系L1，L2淀粉形态恢复正常(图6)。由此验证了转基因前的不透明粉质性状是由FLO7基因控制的，即该FLO7基因为造粉体发育相关基因。

Claims

1.水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FLO7，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的水稻胚乳造粉体发育相关蛋白FLO7的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于其CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

4.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于以pCAMBIA2300-Actin载体为出发载体，将权利要求2或3所述的基因插入多克隆位点SmaI之间得到。

6.含有权利要求2所述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。

7.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4或5所述重组表达载体、权利要求6所述的表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在改善水稻造粉体发育中的应用。

8.一种培育造粉体发育正常的转基因水稻的方法，其特征在于将权利要求2或3所述基因导入造粉体发育异常的水稻中，得到造粉体发育正常的转基因水稻；所述造粉体发育异常水稻为胚乳外周造粉体碎裂的水稻；所述造粉体发育正常的转基因水稻为胚乳外周恢复透明，造粉体形态正常的转基因水稻。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入造粉体发育异常水稻中。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述造粉体发育异常水稻为日本晴突变体flo7。