CN104650204B - 与水稻atp运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
与水稻atp运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104650204B CN104650204B CN201510068039.1A CN201510068039A CN104650204B CN 104650204 B CN104650204 B CN 104650204B CN 201510068039 A CN201510068039 A CN 201510068039A CN 104650204 B CN104650204 B CN 104650204B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant
- rice
- osbt3
- albumen
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/8269—Photosynthesis
Abstract
本发明公开了一种与水稻ATP运输及水稻叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为OsBT3蛋白，来自水稻品种Nipponbare，是由说明书中所述氨基酸序列组成的蛋白质，并且经由一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/添加可衍生而来的与水稻ATP运输及叶绿体发育相关的蛋白质。本发明对于进一步阐明植物叶绿体发育的分子机理并通过基因工程的技术和手段培育高光效的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种与水稻ATP运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
水稻是我国最主要的粮食作物，我国60％以上的人口以稻米为主食。目前采用高光效育种已经成为提高作物产量的重要手段，高等植物进行光合作用的唯一场所是叶绿体，而水稻叶色突变体是研究植物叶绿体发育、光形态建成和光合作用等过程的理想材料。叶绿体除了进行光合作用以外，它还与细胞核以及线粒体存在着复杂的信号交流，以便协同作用维持植物的正常生长发育。ATP是细胞中最主要的能量来源，是所有遗传物质的组成分子，还是许多酶的辅助因子，可作为信号传递中的次级信使，因此在植物新陈代谢上起着至关重要的作用。由于ATP本身电荷和大小的限制，它不能自由穿梭于生物膜，满足其他异养器官的生长要求，就需要一种特定的蛋白对ATP进行跨膜运输。
BT蛋白是线粒体转运家族(MCF)的重要成员，在高等植物中具有较保守的序列和结构。这类蛋白一般定位于细胞器的膜上，负责一些大分子物质的跨膜运输，对植物的生长发育起到重要的供能作用。目前已报到的BT蛋白数量很少，研究最为清楚的就是玉米的ZmBT1蛋白，该蛋白镶嵌在造粉体膜上向内转运ADP葡萄糖，从而促进籽粒中淀粉的合成，对于谷类作物籽粒淀粉的形成起到关键作用。另外还有一类BT蛋白，如拟南芥的AtBT1，具有叶绿体和线粒体双重定位信号，负责能量物质ATP/ADP/AMP的转运，对于拟南芥的生长发育发挥重要功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种与水稻ATP运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，命名为OsBT3蛋白，来自水稻品种Nipponbare，是如下(a)或(b)：
(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与叶绿体ATP运输和叶绿体发育相关的由序列1衍生的蛋白质；
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。
编码所述OsBT3蛋白的基因(OsBT3)也属于本发明的保护范围。
所述OsBT3基因是如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：
(1)编码区如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
(2)基因组如SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码与植物叶绿体ATP运输和叶绿体发育相关的蛋白的DNA分子；
(4)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码与植物叶绿体ATP运输和发育相关蛋白的DNA分子。
所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，为抑制目的植物中编码所述OsBT3蛋白的基因的表达，得到ATP运输能力降低的转基因植物。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，为抑制目的植物中编码所述OsBT3蛋白的基因的表达，得到叶绿体发育受限的转基因植物。
所述“抑制目的植物中编码所述OsBT3蛋白的基因的表达”是通过在所述目的植物中导入干扰载体实现的；所述干扰载体为将特异DNA片段甲和特异DNA片段乙分别插入表达载体的不同多克隆位点得到的重组质粒；所述DNA片段甲如序列表的序列2自5’末端第853至1260位核苷酸所示；所述DNA片段甲和所述DNA片段乙反向互补。
所述表达载体具体可为pCUbi1390‐ΔFAD2载体。
所述干扰载体具体可为如下重组质粒：骨架载体为pCUbi1390‐ΔFAD2载体，在其Kpn Ⅰ酶切位点正向插入了SEQ ID NO.2中自5’末端第853至1260位核苷酸所示的双链DNA片段，在其BamH Ⅰ酶切位点插入了与SEQ ID NO.2自5’末端第853至1260位核苷酸所示的双链DNA片段反向互补的双链DNA片段。
含有所述OsBT3基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述OsBT3蛋白在调节植物质体ATP运输和叶绿体发育中的应用也属于本发明的保护范围。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为水稻，如水稻Nipponbare。
有益效果：
本发明的实验证明，缺失OsBT3基因的植株叶片呈现白条纹，叶绿素含量降低，叶绿体发育出现严重缺陷，光合能力下降，植物逆行信号受阻，参与叶绿素合成和光合作用的基因表达下调；另外ATP/ADP转运能力下降，植物整体新陈代谢速率下降。即OsBT3蛋白参与叶绿体ATP的转运，另外对叶绿体分化发育也具有重要作用。本发明对于进一步阐明植物叶绿体发育的分子机理并通过基因工程的技术和手段培育高光合效率的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。
附图说明
图1为野生型9311和突变体bt3的苗期叶片表型。
图2为野生型9311和突变体bt3的苗期叶绿体超微结构观察。
图3为野生型9311和突变体bt3叶绿体ATP转运活性分析。
图4为转基因干扰载体pCUbi1390‐ΔFAD2结构图。
图5为转基因植株表型观察及表达水平检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、水稻叶绿体ATP运输及发育相关蛋白及其编码基因的发现
一、水稻叶色突变体bt3表型分析
1、在9311突变体库中筛选出叶色表型的株系bt3。
与野生型相比较，bt3的主要特征是叶片苗期呈现白条纹表型(见图1A)，叶绿素含量显著下降(见图1B)。透射电镜观察显示叶绿体发育异常，类囊体片层结构排列松散，基粒堆叠减少(见图2)。
叶绿素测定方法参照(Lichtenthaler HK.Chlorophylls and carotenoids:Pigments of photosynthetic biomembranes.Nature.1987；148:350-382.)。
叶绿体超微结构的观察参考(Wu Z,Zhang X,He B,Diao L,Sheng S,Wang J,GuoX,Su N,Wang L,Jiang L,Wang C,Zhai H,Wan J.A chlorophyll-deficient rice mutantwith impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis.PlantPhysiol.2007Sep；145(1):29-40)。
2、突变体bt3中叶绿体ATP转运活性下降。
从野生型水稻品种9311和突变体植株两周大叶片中分离了叶绿体，然后利用荧光素酶试剂盒检测ATP的含量。结果发现，野生型叶绿体中大概含有0.7μM/g protein的ATP，而bt3突变体植株中则积累了5.3μM/g protein的ATP，其差异达到极显著水平(图3A)。同时在胞质中，我们发现bt3突变体中的ATP含量则略低于野生型，前者约含有0.053μM ATP/gprotein，而后者则含有0.18μM ATP/g protein，差异到达显著水平(图3B)。
二、突变基因的定位
1、突变基因初步定位
用突变体bt3与粳稻品种02428杂交，在bt3/02428的F2分离群体中随机选取苗期叶片白条纹的单株，分别将各株的叶片等量混合后提取DNA，构成1个混合基因组池。首先，用覆盖水稻全基因组的565对SSR引物在bt3和02428之间进行多态性分析，之后每间隔10cM左右挑选一对在两个亲本间有多态的引物。两个亲本DNA连同混池DNA共计三个DNA样本，利用挑选好的覆盖12条染色体的且具有多态的引物进行分析，最后将OsBT3定位在第6染色体标记LV1和LV9之间。
上述SSR标记分析的方法如下所述：
(1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：
①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。
②加入660μL提取液(含100mM Tris‐Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。
③加入40μL 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。
④加入100μL 5M NaCl，温和混匀。
⑤加入100μL 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。
⑥加入900μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。
⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μL异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。
⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。
⑨加入100μL 1×TE(121g Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。
⑩取2μL电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Bechman InstrumentInc.U.S.A)。
(2)将上述提取的DNA稀释成约20ng/μL，作为模板进行PCR扩增；
PCR反应体系(10μL)：DNA(20ng/uL)1uL，上游引物(2pmol/uL)1ul，下游引物(2pmol/μL)1μL，10xBuffer(MgCl2free)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，MgCl2(25mM)0.6μL，rTaq(5u/ul)0.1μL，ddH2O 5.1μL，共10μL。
PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC‐225热循环仪中进行。
(3)SSR标记的PCR产物检测
扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比较扩增产物的分子量大小，银染显色。
2、突变基因精细定位
根据初步定位的结果，在突变位点所在区域间隔一定区段自行开发SSR标记，以便在该染色体的相关区段筛选更多标记进一步定位突变体位点。从bt3/02428杂交组合获得的F2分离群体中挑出确认为突变表型的F2单株，用于突变位点的精细定位。利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、Indel分子标记对突变位点进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变位点，具体方法如下：
(1)SSR标记开发
将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列(重复次数≥6)；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用PrimerPremier 5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在bt3和02428之间的多态性，表现多态者用作精细定位OsBT3基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表1。
(2)CAPS/dCAPS标记的开发
在较小的定位区间内，为了获得更多多态性标记来进行基因的精细定位，就需要利用基于特异引物PCR与限制性酶切相结合的CAPS标记以及通过引入错配创造限制性内切酶作用位点的dCAPS标记。具体开发方法是首先通过PCR扩增到需要开发标记的区段，亲本02428扩增获得的PCR产物在华大生物公司进行测序，测序所得02428的扩增序列与从NCBI网站上获得的9311相应片段的核苷酸序列进行比对，并设计CAPS标记。同样的，在进行PCR扩增并测序后，利用dCAPS Finder2.0软件在线设计dCAPS标记，引入碱基错配数一般控制在1～3个。PCR扩增的引物仍然运用Primer Premier5.0软件进行设计，由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR产物的纯化与回收按照试剂盒(TIANGEN)说明进行(北京天根生化科技有限公司)。
表1用于精细定位的分子标记
| 标记名称 | 正向引物(5’-3’) | 反向引物(5’-3’) | 引物类型 |
| LV1 | GGAAGTCGGAATTGTAAATAGC | CTCATGGTTGAATCTGGGAGTA | SSR |
| LV2 | CCAGGGTTTGCCTTTTTTTG | CGAGCGGTACGACGTTGATC | SSR |
| LV3 | TGTGCTTTATGATGGACCC | GCAAGAATCAGCGAGGTTA | SSR |
| LV4 | ATTTCCTTATTCAACCTCC | TGTGCTACGGCTATCAACT | SSR |
| LV5 | TCTGTTATGTTAAATGACTTAATGGTG | GTTTGGTTCGTCTGTGCGTAG | SSR |
| LV6 | TTGGATGTGACATTTTTCAATAC | GCTATCTGACAGCAAAGAGTTAT | dCAPS |
| LV7 | AGCTACTCTCTTCGTAAG | CCACTATAAAAACTCACC | dCAPS |
| LV8 | CTCCCACACATACGGATTTT | TGGAAAGAGGAGGAAAGGTT | SSR |
| LV9 | GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG | CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG | SSR |
(3)突变基因的获得
根据定位的位点设计引物，序列如下所述：
primer1：5'‐ATGGTGGCGATGTCG‐3'(SEQ ID NO.4)
primer2：5'‐TCACTCACTATCCTGA‐3'(SEQ ID NO.5)
以primer1和primer2为引物，以9311的cDNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。
扩增反应在PTC‐200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃1.5min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后克隆到载体pEASY(北京全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(北京Tiangen公司CB101)，挑选阳性克隆后，进行测序。
序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，编码419个氨基酸残基组成的蛋白质(从ATG到TGA)(见序列表的SEQ ID NO.1)。将SEQID NO.1所示的蛋白命名为OsBT3(即为基因定位中所述的OsBT3基因)，将SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因命名OsBT3。
实施例2、OsBT3基因抑制表达植株的获得和鉴定
一、OsBT3基因RNA干扰载体(重组质粒pCUbi1390‐ΔFAD2‐OsBT3)的构建
1、OsBT3基因干扰片段的获得
(1)使用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)，提取水稻Nipponbare(Oryza sativa)的14天幼苗的总RNA，反转录得到cDNA。
(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用OsBT3‐sense‐F和OsBT3‐sense‐R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
OsBT3‐sense‐F:5’‐GGGGTACCTACCGCGGGCTGACACCG‐3’(SEQ ID NO.6)；
OsBT3‐sense‐R:5’‐CGAGCTCTCACTCACTATCCTGATC‐3’(SEQ ID NO.7)。
(3)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用OsBT3‐antisense‐F和OsBT3‐antisense‐R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
OsBT3‐antisense‐F:5’‐CGGGATCCTACCGCGGGCTGACACCG‐3’(SEQ ID NO.8)；
OsBT3‐antisense‐R:5’‐AACTGCAGTCACTCACTATCCTGATC‐3’(SEQ ID NO.9)。
2、OsBT3基因RNA干扰载体(重组质粒pCUbi1390‐ΔFAD2‐OsBT3)的构建
(1)用限制性内切酶Kpn Ⅰ和Sac Ⅰ酶切pCUbi1390‐ΔFAD2载体，回收其线性质粒，同时酶切“1、OsBT3基因干扰片段的获得”步骤(2)中的PCR扩增产物，回收约408bp的线性质粒。
(2)利用pMD18‐T载体(TAKARA公司，按说明书操作)将上一步得到的酶切产物通过连接得到重组质粒pCUbi1390‐ΔFAD2‐sense‐OsBT3。
(3)用限制性内切酶BamH Ⅰ和Pst Ⅰ酶切上一步的重组质粒pCUbi1390‐ΔFAD2‐sense‐OsBT3，回收其酶切产物，同时酶切“1、OsBT3基因干扰片段的获得”步骤(3)中的PCR扩增产物，回收约408bp的线性质粒。
(4)利用pMD18-T载体(TAKARA公司，按说明书操作)将上一步得到的酶切产物通过连接得到最终的重组质粒pCUbi1390-ΔFAD2-OsBT3。
根据测序结果，对重组质粒pCUbi1390-ΔFAD2-OsBT3进行结构描述如下：骨架载体为pCUbi1390-ΔFAD2载体，在其Kpn Ⅰ酶切位点正向插入了SEQ ID NO.2中自5’末端第853至1260位核苷酸所示的双链DNA片段，在其BamH Ⅰ酶切位点插入了与SEQ ID NO.2中自5’末端第853至1260位核苷酸所示的双链DNA片段反向互补的双链DNA片段。
所用转基因干扰载体pCUbi1390-△FAD2结构图见图4。
二、OsBT3基因抑制表达植株的获得
1、将重组质粒pCUbi1390‐ΔFAD2‐OsBT3导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pCUbi1390‐ΔFAD2‐OsBT3。
2、OsBT3基因抑制表达植株的获得
将EHA105/pCUbi1390‐ΔFAD2‐OsBT3转入水稻Nipponbare(以下简称野生型水稻)胚的愈伤组织中，具体步骤如下：
(1)用含50μmol/L卡那霉素的液体LB培养基悬浮重组农杆菌EHA105/pCUbi1390‐ΔFAD2‐OsBT3，得到OD600nm≈0.5的菌悬液。
(2)取水稻Nipponbare的成熟胚愈伤组织与步骤(1)得到的菌悬液混合，侵染30min，用滤纸吸干菌液后将愈伤组织放置于共培养培养基(含0.03924mg/L乙酰丁香酮的固体N6培养基)上，24℃培养3天。
(3)将步骤(2)得到的愈伤接种至含150mg/L G418的固体N6培养基上，24℃培养16天。
(4)取步骤(3)得到的健康愈伤，接种至含200mg/L G418的固体N6培养基上，24℃培养，每15天继代一次。
(5)取步骤(4)得到的健康愈伤，接种至分化培养基(含150mg/L G418、2mg/L激动素、0.05mg/L萘乙酸的固体N6培养基)上，24℃培养45天(此时植株地上部分高度约为15cm)，打开瓶口炼苗3天，然后移栽至温室栽培，即为T0代植株。
(6)将T0代植株自交，收获种子并培育为植株，即为T1代植株。
(7)将T0代植株和T1代植株提取基因组DNA并采用1390-F和FAD2-R组成的引物对进行PCR鉴定。1390-F对应于图1的10707-10730bp,FAD2-R引物对应于图1中的第10827-10846bp,如果扩增出大小约为728bp的条带，则说明为阳性植株。
1390-F：5'-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3'(SEQ ID NO.10)；
FAD-R：5'-GAAGCGACGGACCTGGAGAT-3'(SEQ ID NO.11)。
对于某一T0代植株，如果该植株及其T1代植株PCR鉴定均为阳性，该植株为纯合的OsBT3基因抑制表达植株，该植株及其自交后代为一个OsBT3基因抑制表达株系。
三、转空载体水稻的获得
用pCUbi1390‐ΔFAD2载体代替重组质粒pCUbi1390‐ΔFAD2‐OsBT3进行步骤二，得到转空载体植株。
四、转基因干扰植株的鉴定和表型分析
1、PCR分子鉴定
将步骤二获得的T1代植株提取RNA进行反转录PCR，反应体系：RNA(1μg/μL)2μL，OligodT2μL，dNTPs(10mM)2μL，5×Buffer 8μL，RNase Inhibitor 1μL，Transcriptase 2μL，ddH2O 23μL，总体积40μL。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：65℃，5min；冰上放置2min；42℃，1h；4℃保持。
获得的CDNA模板进行OsBT3基因表达量的分析。
BT3‐F:GCTTATTGCTGGAGCACTTG(SEQ ID NO.12)
BT3‐R:ACGAAAGCATGGAGGAAGTT(SEQ ID NO.13)
2、表型鉴定
将T1代转pCUbi1390‐ΔFAD2‐OsBT3植株和日本晴种植在南京农业大学试验田内。在苗期观察其叶片表型，结果发现pCUbi1390‐ΔFAD2‐OsBT3阳性植株叶片出现白条纹表型，与突变体一致(见图5)。由此验证了OsBT3表达受到抑制是造成植株叶片白条纹的原因，即OsBT3基因为控制水稻叶绿体发育相关基因。
Claims (4)
1.一种培育转基因植物的方法，其特征在于：该方法通过抑制目的植物中编码SEQ IDNO.1所示蛋白的基因的表达，得到叶绿体发育严重缺陷的转基因植物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述“抑制目的植物中编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因的表达”是通过在所述目的植物中导入干扰载体实现的；所述干扰载体为将特异DNA片段甲和特异DNA片段乙分别插入表达载体的不同多克隆位点得到的重组质粒；所述DNA片段甲如SEQ ID NO.2中自5’末端第853至1260位核苷酸所示；所述DNA片段甲和所述DNA片段乙反向互补。
3.SEQ ID NO.1所示蛋白在人工调节植物叶绿体发育中的应用。
4.编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因在人工调节植物叶绿体发育中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510068039.1A CN104650204B (zh) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 与水稻atp运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510068039.1A CN104650204B (zh) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 与水稻atp运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104650204A CN104650204A (zh) | 2015-05-27 |
| CN104650204B true CN104650204B (zh) | 2018-02-06 |
Family
ID=53241887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510068039.1A Active CN104650204B (zh) | 2015-02-09 | 2015-02-09 | 与水稻atp运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104650204B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107286230B (zh) * | 2017-08-08 | 2020-02-18 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种水稻叶绿体核糖体蛋白及其编码基因和应用 |
| CN107936102A (zh) * | 2017-11-21 | 2018-04-20 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 水稻高光效基因ceo1及其应用 |
-
2015
- 2015-02-09 CN CN201510068039.1A patent/CN104650204B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Characterization of a novel eukaryotic ATP/ADP translocator located in the plastid envelope of Arabidopsis thaliana L.;Neuhaus H.E.等;《The Plant Journal》;19971231;73-82 * |
| GenBank: BAD35459.1，putative mitochondrial energy transfer protein [Oryza sativa Japonica Group];Sasaki,T.等;《Genbank Database》;20080216;序列，FEATURES * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104650204A (zh) | 2015-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bragg et al. | Generation and characterization of the Western Regional Research Center Brachypodium T-DNA insertional mutant collection | |
| CN108165554B (zh) | 控制玉米叶宽基因ZmNL4及其应用 | |
| CN105755021A (zh) | 一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用 | |
| CN106432447B (zh) | 一种植物淀粉合成相关蛋白OsPKp1及其编码基因与应用 | |
| CN102617717B (zh) | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA3及其编码基因与应用 | |
| CN104628839B (zh) | 一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN109112146A (zh) | 控制甘蓝型油菜角果长和粒重性状的基因qSLWA9的克隆与育种应用 | |
| CN115612695A (zh) | GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物盐胁迫耐受性中的应用 | |
| CN104650204B (zh) | 与水稻atp运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN111087457B (zh) | 提高氮素利用率和作物产量的蛋白ngr5及其编码基因与应用 | |
| CN106589085A (zh) | 一种植物淀粉合成相关蛋白OsFLO8及其编码基因与应用 | |
| CN104087605B (zh) | 培育分蘖数增加的转基因禾本科植物的方法及其相关生物材料 | |
| CN106432444A (zh) | 一个植物谷蛋白转运储藏相关蛋白gpa4及其编码基因与应用 | |
| CN112662687B (zh) | 推迟玉米花期的方法、试剂盒、基因 | |
| CN107446031A (zh) | 一种植物谷蛋白转运储藏相关蛋白OsVHA‑E1及其编码基因与应用 | |
| CN104651366B (zh) | 小麦microRNA408及其编码基因与应用 | |
| CN106632627A (zh) | Lnsm蛋白及其编码基因在植物转基因中的应用 | |
| Gho et al. | Tissue-specific enhancement of OsRNS1 with root-preferred expression is required for the increase of crop yield | |
| CN106381299B (zh) | 一种水稻种子休眠基因OsQSOXL1及其编码蛋白质和应用 | |
| CN104450739B (zh) | 一种水稻源抗虫相关基因OsHR1及其编码产物与应用 | |
| CN105420207B (zh) | 与水稻叶绿体rna聚合酶pep及叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN106349353A (zh) | 一种调控植物淀粉合成相关蛋白OsFSE及其编码基因与应用 | |
| CN112724216B (zh) | 改变玉米开花期的基因及方法 | |
| CN114516906B (zh) | 玉米与菌根真菌共生相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN115851821B (zh) | Bbx16基因在提高植物盐耐受性中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |