CN104450739B - 一种水稻源抗虫相关基因OsHR1及其编码产物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻源抗虫相关基因<i>OsHR1</i>及其编码产物与应用。<i>OsHR1</i>具有SEQ？ID？No.1的DNA序列，长度为1019？bp；该基因的完整编码框由SEQ？ID？No.1中第81-875位的核苷酸组成，编码264个氨基酸残基的小分子量蛋白。研究发现<i>OsHR1</i>与水稻的抗虫性密切相关，该基因的表达产物能增强水稻对二化螟和褐飞虱的抗性。本发明将在作物育种，特别是在水稻抗虫育种中得到广泛应用。

Description

一种水稻源抗虫相关基因 OsHR1 及其编码产物与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种水稻源抗虫相关基因OsHR1及其编码产物与应用。

背景技术

水稻（Oryza sativa）是我国乃至世界重要的粮食作物，其生产的丰欠盈余直接关系到我国的粮食安全。进入本世纪以来，水稻害虫，特别是稻飞虱的日益猖獗，对我国的水稻生产造成了极大破坏。据统计，2005年浙江省褐飞虱（Nilaparvata lugens, brown plant hopper, BPH）发生量在每亩30万头以上的占水稻总种植面积的86％，每亩在100万头以上的占42％，最高田块发生量达到每亩1000万头以上，造成直接产量损失120万吨。而另一水稻“劲敌”-二化螟（Chilo suppressalis, striped stem borer, SSB），近几年的发生面积及危害程度也日益加大，轻时造成减产约5-10%，严重时减产35-40%，甚至绝收。截至目前，农药防治仍是控制稻田有害生物最为常用的手段之一。然而，事实证明，农药的大量使用非但没有有效地遏制害虫危害，反而引发了更为严重的环境污染，并且加速了害虫的抗药性演变。因此，发掘水稻抗虫相关基因，培育抗性水稻品种成为我国有害生物可持续治理的迫切需求；另一方面，水稻基因组测序的完成及功能基因组研究的推进，以及遗传学、功能基因组学、反向遗传学等相关技术的日益完善，特别是植物诱导抗性研究领域取得的突破性进展，为加速水稻抗性品种的培育提供了有力的理论与技术支持。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种水稻源抗虫相关基因OsHR1及其编码产物与应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种水稻源抗虫相关基因OsHR1，具有SEQ ID No.1的DNA序列。

一种抗虫相关基因编码的蛋白，它包含SEQ ID No.2的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与SEQ ID No.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。

一种水稻源抗虫相关基因OsHR1在转基因植物中的应用。

一种水稻源抗虫相关基因OsHR1在作物育种中的应用。

本发明的有益效果是，利用抑制消减杂交（SSH）并结合RACE和RT-PCR技术，克隆得到了OsHR1基因；利用荧光定量PCR（QPCR）明确了OsHR1基因在二化螟和褐飞虱为害后的表达情况；通过农杆菌转化法获得了OsHR1基因过量表达的转基因水稻植株，并进一步揭示了OsHR1基因在水稻防御二化螟和褐飞虱中的重要作用。该基因的分离克隆，对于抗虫水稻品种的培育，具有十分重要的促进作用。

附图说明

图1是OsHR1基因的PCR产物电泳图。1-2泳道为1019 bp的OsHR1基因片段。

图2是二化螟（SSB）和褐飞虱（BPH）为害后OsHR1基因的表达情况（平均值+标准误，n=5）。Con：对照；Non-infested，水稻茎秆套入空玻璃罩；星号表示处理与对照间存在显著差异（*, P< 0.05; **, P< 0.01, 学生氏t-检验）。

图3是OsHR1基因的过量表达转化载体示意图。

图4是转基因品系和野生型植株（WT）的DNA印迹分析。基因组DNA分别用EcoR I（E）和Xba I（X）酶切，以GUS基因片段作为探针进行检测。

图5是转基因品系和野生型植株中OsHR1基因的表达量（平均值+标准误，n=5）。星号表示转基因品系与WT存在显著差异（**, P< 0.01, 学生氏t-检验）。

图6是转基因品系增强了水稻对SSB的抗性。SSB幼虫取食转基因品系及WT 12 d后的生长量（平均值+标准误，n=60）；星号表示转基因品系与WT存在显著差异（**, P< 0.01, 学生氏t-检验）。

图7是转基因品系降低了褐飞虱雌成虫的取食和产卵嗜好性。褐飞虱怀卵雌成虫在转基因品系及WT上的取食头数和产卵率（平均值+标准误，n=10）；星号表示转基因品系与WT存在显著差异（*, P< 0.05; **, P< 0.01, 学生氏t-检验）。

具体实施方式

本发明利用抑制消减杂交（SSH）技术，获得了OsHR1基因的部分片段，进一步通过RACE和RT-PCR技术，克隆得到了包含5'和3'非编码区的OsHR1基因全长片段；利用荧光定量PCR（QPCR）技术，证实了二化螟和褐飞虱为害均能诱导OsHR1基因表达；通过农杆菌转化法获得了OsHR1过量表达的水稻突变体植株；生物学测定结果表明过表达OsHR1能够增强水稻对二化螟和褐飞虱的抗性。综上所述，OsHR1基因的分离克隆及生物学功能分析，对于作物的抗虫育种，特别是水稻抗虫育种将具有重要的促进作用。

实现本发明的具体技术步骤如下：

（1） OsHR1基因的分离及克隆。利用抑制消减杂交（SSH）方法构建了SSB为害后水稻差异表达基因文库，从中分离获得了OsHR1基因的部分片段；利用5’-RACE和3’-RACE，分别扩增得到了该基因5’端和3’端的片段，通过DNAStar软件拼接得到含有5'和3'非编码区的OsHR1的全长序列；进一步地，以二化螟为害后的水稻茎秆cDNA为模板，重新设计引物，PCR扩增得到OsHR1基因。

（2） OsHR1基因的表达特征分析。分别对水稻进行二化螟和褐飞虱为害处理，剪取二化螟为害后的茎秆和褐飞虱为害后的叶鞘，以及相应的对照植株茎秆（叶鞘）进行总RNA提取，反转录得到cDNA；利用QPCR技术，以水稻OsACTIN为内参基因，测定OsHR1基因的诱导表达情况。

（3） OsHR1过表达水稻突变体的获得。将OsHR1的全长ORF插入到pCAMBIA1301的35S启动子后，通过农杆菌转化法获得了OsHR1过表达的突变体水稻，并进一步结合GUS染色、Southern blot及QPCR分析，最终筛选得到了2个单拷贝插入的T2代纯合品系HR1-1和HR1-2。

（4） OsHR1基因的生物学功能研究。二化螟生长量测定：将二化螟初孵幼虫分别接入野生型和突变体水稻中进行取食，12 d后剥出进行称重；褐飞虱雌成虫取食和产卵选择性测定：在小塑料杯中分别放入1株野生型和1株突变体水稻，2株水稻茎秆基部固定一个圆筒形玻璃罩，在玻璃罩内接入15头褐飞虱怀卵雌成虫，观察并记录两株苗的着虫数，48 h后统计每株苗上的产卵量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例 1 、 OsHR1 基因的克隆和序列分析

（1）水稻茎杆总RNA的提取及cDNA合成

称取100mg研磨后的水稻茎秆（经SSB为害），利用SV Total RNA Isolation System（Promega）提取总RNA并进行浓度及纯度检测；1 μg总RNA用于cDNA合成（PrimeScript™ RT-PCR Kit, TaKaRa），具体操作参照产品说明书。

（2） OsHR1基因克隆

以上述cDNA为模板，扩增含5'和3'非编码区的OsHR1片段，反应体系及程序参照PrimeSTAR^® HS DNA Polymerase（TaKaRa）说明书。扩增产物经电泳检测后（图1），利用AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit（Axygen）进行回收纯化；纯化后的片段连入pMD19-T载体（TaKaRa）并转入大肠杆菌TG1细胞；挑选阳性克隆保存、测序。引物序列如下：

HR1-F1（SEQ ID No.3）：5'-ACGATGGAGATGGTGCTG-3'

HR1-R1（SEQ ID No.4）：5'-TCAGGGATCGAAAGAGGC-3'

（3）OsHR1基因序列分析

测序结果见SEQ ID No.1。根据该序列的开放阅读框（ORF），推算出该基因编码蛋白的氨基酸序列，见SEQ ID No.2。

实施例 2 、二化螟和褐飞虱为害后的 OsHR1 表达特征分析

（1）二化螟处理：将1头3龄SSB幼虫接入水稻茎杆基部，待SSB钻蛀后开始计时，取食后0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h剪取为害部位2-3 cm的茎秆，立即浸入液氮，-80℃保存备用；以未接入SSB的健康水稻茎杆作为对照。

（2）褐飞虱处理：在水稻的茎杆基部固定一个圆筒形玻璃罩（直径4 cm，高8 cm，筒壁均匀分布48个直径为 0.8 mm的透气小孔），玻璃罩内接入15头BPH怀卵雌成虫，顶部以海绵密封；处理后0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h剪取为害部位的外层叶鞘，立即浸入液氮，-80℃保存备用；以套入空玻璃罩的健康水稻叶鞘作为对照。

（3）QPCR分析：RNA提取cDNA合成方法同前。QPCR使用SsoFast^TM probes supermix试剂盒（BIO-RAD），以水稻OsACTIN基因（TIGR ID：Os03g50885）作为内参基因，通过CFX96^TM Real-Time system（BIO-RAD）荧光定量PCR仪进行检测；反应体系及程序参照产品说明书。引物及探针信息如下：

HR1-F（SEQ ID No.5）：5’-GGCATGGATGCGCTCGGCTT-3’

HR1-R（SEQ ID No.6）：5’-ATGACTACAGCAAGAGGTGGT-3’

HR1-P（SEQ ID No.7）：5’-GAGGCCTCCATAGGTACCCCATGG-3’

ACT-F（SEQ ID No.8）：5’-TGGACAGGTTATCACCATTGGT-3’

ACT -R（SEQ ID No.9）：5’-CCGCAGCTTCCATTCCTATG-3’

ACT-P（SEQ ID No.10）：5’-CGTTTCCGCTGCCCTGAGGTCC-3’

如图2所示，二化螟取食能够迅速诱导OsHR1基因表达，其中为害1 h后表达量达到最高；褐飞虱为害4 h后OsHR1显著上调，且随着为害时间的延长表达量持续增加。

实施例 3 、 OsHR1 基因过表达水稻品系的获得

（1）载体构建

设计引物HR1-F3和HR1-R3扩增OsHR1的ORF片段，产物经ClaⅠ和BamHⅠ双酶切后，插入表达载体pCAMBIA1301的CaMV35S启动子后（图3），并转入农杆菌菌株中保存、测序。引物信息如下：

HR1-F3（SEQ ID No.11）：5’-CCATCGATATGACTATAGAACTTCTT-3’

HR1-R3（SEQ ID No.12）：5’-CGGGATCCTCACGGCGAGGCCGCTG-3’

（2）植物转化

水稻种子去壳消毒后，置于NBD培养基中，28℃，避光培养；10 d后，剥离生成的愈伤组织，与上述农杆菌置于NBDC上进行共培养；3 d后，洗去多余农杆菌，将共侵染后的愈伤放在含有潮霉素的NBDS培养基上筛选；约28 d后，将新生成的抗性愈伤从母体上剥离，经GUS染色鉴定后，转入MS-RG培养基中进行分化，30℃，光照14 h；分化幼苗长至8-10 cm后（约25 d），切去基部愈伤，转入生根培养基MS-RT中，30℃，光照14 h，培养15 d；洗去培养基，炼苗3 d后，移入土中栽培，所得植株即为T₀代突变体。

（3）纯合子筛选及鉴定

T₀代自交产生的种子催芽7 d后，剪取根尖进行GUS染色，选择分离比接近3:1的品系，同时提取基因组DNA进行PCR鉴定，阳性植株初步判断为T₁代单拷贝插入突变体。T₁代自交产生的T₂代种子同样进行GUS染色和PCR鉴定，全部为阳性的即为纯合突变体；利用QPCR分析纯合品系中OsHR1的表达水平；同时利用Southern-blot（DIG DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ, Roche）方法，以0.7 kb的GUS基因片段（NCBI: AF234297）作为探针，检测纯合品系中的插入拷贝数，具体操作依照产品说明书进行。最终筛选得到了2个单拷贝插入的T₂代纯合品系HR1-1和HR1-2（图4，图5）。

实施例 4 、 OsHR1 转基因品系的抗虫功能研究

（1）二化螟生长量测定

每株水稻接入3头SSB初孵幼虫，生长12 d后，剥出SSB幼虫称重。每品系重复20次（60头虫）。结果显示，与WT相比，取食HR1-1和HR1-2的SSB幼虫生长量则减少了50%左右（图6）。

（2）褐飞虱雌成虫取食选择性及产卵选择性测定

在小塑料杯中分别放入1株野生型和1株突变体水稻，苗间距1 cm，2株水稻茎秆基部固定一个圆筒形玻璃罩，在玻璃罩内接入15头褐飞虱怀卵雌成虫后，顶部以海绵密封；接虫后观察并记录两株苗的着虫数；48 h后，去除所有褐飞虱，统计每株苗上的产卵量；本试验重复10次。结果显示，与转基因品系相比，BPH雌成虫更喜欢WT上取食和产卵：HR1-1和HR1-2的产卵率仅为WT的41.5% 和7.1%（图7）。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种水稻源抗虫相关基因OsHR1及其编码产物与应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1019

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gggaccgaaa gaggcagcac aaaataaaga aattaaacat tgaagttggc aatgaactta 60

agtgtcccac cgtacagtat atgactatag aacttcttct ctttgcctac cttgatgtct 120

ctctattcta ttttacaaat atgtcctttg tacatgtaca atttattgca tcttccatat 180

gtcctctaga ctccatagag tttcggacaa accctcagaa aaaccttgca cccaaccgtt 240

cagctgttgg tcctgacact gttcattatc aggctgaatc tctgttgacc aacactcatc 300

gtccaccttt tgcatccagt ctgcagagtc catcttctca tcatcaccat gcacatgtaa 360

gttcctcttc ttcaactcat gtgactccga agtacaccga acggaagatg agctggtcac 420

catgctcgga gagacatcag accaatcagc aacagtggcc attgttacac cagatccaca 480

tgatacgtcg ttgttgctgt cgtctccgct atcatcaaca gcgtcagctc tggcatggat 540

gcgctcggct tggcgaggcc tccataggta ccccatggca tcaaccacct cttgctgtag 600

tcatcacaat tcaaatgctc ggcatgctta tgcactctgg tcctccaaca gttcttcatc 660

tcgttgtcgg tcctcccagg cacatgttgt gctatcttgg accatcggtt gccccatcgg 720

gagtggaggt cgaggatttg cagctgctcc tctgcggtac agttgcagcg cttcacatcc 780

cgccggagat agttcagcca caggagctgg cagctcttcc cagtcctttt cagaccggcg 840

gcgcgtgcga gtccgttcca gcggcctcgc cgtgatcaga gatgtagttg atgagggtga 900

ggttttcgtc gacggtccac ggctcgccgg agctcagccg acgacagctc cgccgacgcc 960

tcctgctgct ctccgggcac cgggtggtgg ctcgttctct gcagcaccat ctccatcct 1019

<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Thr Ile Glu Leu Leu Leu Phe Ala Tyr Leu Asp Val Ser Leu Phe

1 5 10 15

Tyr Phe Thr Asn Met Ser Phe Val His Val Gln Phe Ile Ala Ser Ser

20 25 30

Ile Cys Pro Leu Asp Ser Ile Glu Phe Arg Thr Asn Pro Gln Lys Asn

35 40 45

Leu Ala Pro Asn Arg Ser Ala Val Gly Pro Asp Thr Val His Tyr Gln

50 55 60

Ala Glu Ser Leu Leu Thr Asn Thr His Arg Pro Pro Phe Ala Ser Ser

65 70 75 80

Leu Gln Ser Pro Ser Ser His His His His Ala His Val Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Thr His Val Thr Pro Lys Tyr Thr Glu Arg Lys Met Ser Trp

100 105 110

Ser Pro Cys Ser Glu Arg His Gln Thr Asn Gln Gln Gln Trp Pro Leu

115 120 125

Leu His Gln Ile His Met Ile Arg Arg Cys Cys Cys Arg Leu Arg Tyr

130 135 140

His Gln Gln Arg Gln Leu Trp His Gly Cys Ala Arg Leu Gly Glu Ala

145 150 155 160

Ser Ile Gly Thr Pro Trp His Gln Pro Pro Leu Ala Val Val Ile Thr

165 170 175

Ile Gln Met Leu Gly Met Leu Met His Ser Gly Pro Pro Thr Val Leu

180 185 190

His Leu Val Val Gly Pro Pro Arg His Met Leu Cys Tyr Leu Gly Pro

195 200 205

Ser Val Ala Pro Ser Gly Val Glu Val Glu Asp Leu Gln Leu Leu Leu

210 215 220

Cys Gly Thr Val Ala Ala Leu His Ile Pro Pro Glu Ile Val Gln Pro

225 230 235 240

Gln Glu Leu Ala Ala Leu Pro Ser Pro Phe Gln Thr Gly Gly Ala Cys

245 250 255

Glu Ser Val Pro Ala Ala Ser Pro

260

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

acgatggaga tggtgctg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tcagggatcg aaagaggc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ggcatggatg cgctcggctt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atgactacag caagaggtgg t 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gaggcctcca taggtacccc atgg 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

tggacaggtt atcaccattg gt 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccgcagcttc cattcctatg 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgtttccgct gccctgaggt cc 22

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ccatcgatat gactatagaa cttctt 26

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cgggatcctc acggcgaggc cgctg 25

Claims (4)

1.一种水稻源抗虫相关基因OsHR1，其特征在于，所述OsHR1的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述的抗虫相关基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种权利要求1所述水稻源抗虫相关基因OsHR1在转基因植物中的应用。

4.一种权利要求1所述水稻源抗虫相关基因OsHR1在作物育种中的应用。