CN114231557B - 水稻种子休眠性调控基因及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及水稻种子休眠性调控基因中的及其用途。本发明提供一种水稻的选育方法，包括：1)提供OsbZIP09或OsHXK6敲减的突变植株；2)提供纯合的水稻株系。本发明通过对水稻中OsbZIP09或OsHXK6相关基因的敲减，通过突变该基因核苷酸序列，筛选具有抗穗发芽特性且正常种子萌发不受影响的水稻改良株系，其整个育种方式快速、高效，且在改良水稻种子休眠特性的同时，还对水稻粒形具有一定改良效果，使其更加细长，符合目前水稻粒形改良的方向，在农业生产上具有十分重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及水稻种子休眠性调控基因及其用途。
背景技术
种子休眠是一个重要的农艺性状。水稻生产对种子休眠性具有双重要求，首先要求播种后水稻种子发芽整齐、迅速、成苗快，以获得较高的经济产量；同时，又要求种子具有一定的休眠性，确保水稻种子在成熟前或收获期间遇到高温高湿的生长环境防止或减少穗发芽现象，从而保证水稻的产量和品质。近年来，在培育水稻品种时往往强调产量等指标，忽视了种子休眠的重要性，培育的高产品种往往表现出较强的穗发芽特性，特别我国南方杂交稻制种、繁种过程中，广泛使用赤霉素，减弱了种子休眠性，穗发芽现象日趋严重。水稻穗发芽会造成种子贮藏物质的大量消耗，直接导致减产；同时胚乳中主要贮藏物质淀粉的水解，也促进了腐生真菌的繁殖与生长，造成稻米加工品质、营养品质和食用品质的显著下降，失去商用价值。此外，尚未穗萌的籽粒因其内部多个代谢通路已被激活，种子活力和储藏特性等也显著下降。此前研究显示，正常年份沿海地区水稻穗发芽率达5％，如在水稻成熟过程中遇到高温多雨天气，穗发芽率最高可达30％，严重影响稻米的产量和品质。因此，研究水稻休眠机制、克隆调控水稻休眠的重要基因，从而解决水稻穗发芽问题对于确保稻米的高产优质，保证我国的粮食安全具有重大意义。
目前水稻中已成功克隆的影响水稻穗发芽的基因仍很少，其中能明显减弱穗发芽性状的基因往往会造成播种时种子萌发不良、植株生长不正常等负面效应，因此无法用于水稻育种和生产。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供水稻种子休眠性调控基因及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供用于敲减OsbZIP09的物质在水稻选育中的用途。
在本发明一些实施方式中，所述用途具体为水稻种子休眠性调控和/或稻米粒形调控中的用途，所述水稻种子休眠性调控优选为增强水稻种子休眠性，所述稻米粒形调控优选为增加稻米的长宽比；
和/或，所述水稻选自粳稻和/或籼稻，优选选自粳稻品种中花11、南粳46、或日本晴。
在本发明一些实施方式中，所述OsbZIP09的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的序列；
和/或，所述OsbZIP09的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明另一方面提供一种水稻的选育方法，包括：
1)提供OsbZIP09敲减的突变植株；
2)提供纯合的水稻株系。
在本发明一些实施方式中，所述OsbZIP09的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的序列；
和/或，所述OsbZIP09的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述OsbZIP09敲减的突变植株来源于粳稻和/或籼稻，优选来源于粳稻品种中花11、南粳46、或日本晴。
在本发明一些实施方式中，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术提供OsbZIP09敲减的突变植株，优选的，提供OsbZIP09敲减的突变植株的方法具体包括：提供针对OsbZIP09基因的编辑载体，将编辑载体转入水稻受体品种中。
在本发明一些实施方式中，通过农杆菌介导转化法将编辑载体转入水稻受体品种中；
和/或，编辑载体的靶标序列的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述水稻的选育方法还包括：提供纯合的水稻株系的穗子和/或种子。
在本发明一些实施方式中，所述水稻的选育方法用于调控水稻种子休眠性和/或稻米粒形。
本发明另一方面提供用于敲减OsHXK6的物质在水稻选育中的用途。
在本发明一些实施方式中，所述用途具体为水稻种子休眠性调控，所述水稻种子休眠性调控优选为增强水稻种子休眠性；
和/或，所述水稻选自粳稻和/或籼稻，优选选自粳稻品种中花11、南粳46、或日本晴。
在本发明一些实施方式中，所述OsHXK6的编码序列包括SEQ ID NO.9所示的序列；
和/或，所述OsHXK6的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。
本发明另一方面提供一种水稻的选育方法，包括：
1)提供OsHXK6敲减的突变植株；
2)提供纯合的水稻株系。
在本发明一些实施方式中，所述OsHXK6的编码序列包括SEQ ID NO.9所示的序列；
和/或，所述OsHXK6的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述OsHXK6敲减的突变植株来源于粳稻和/或籼稻，优选来源于粳稻品种中花11、南粳46、或日本晴。
在本发明一些实施方式中，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术提供OsHXK6敲减的突变植株，优选的，提供OsHXK6敲减的突变植株的方法具体包括：提供针对OsHXK6基因的编辑载体，将编辑载体转入水稻受体品种中。
在本发明一些实施方式中，通过农杆菌介导转化法将编辑载体转入水稻受体品种中；
和/或，编辑载体的靶标序列的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。
在本发明一些实施方式中，继代繁殖以提供纯合的水稻株系；
和/或，所述水稻的选育方法还包括：提供纯合的水稻株系的穗子和/或种子。
在本发明一些实施方式中，所述水稻的选育方法用于调控水稻种子休眠性。
本发明还提供OsbZIP09基因或OsHXK6基因及它们表达的蛋白在水稻种子休眠性调控和/或稻米粒形调控中的用途。
附图说明
图1显示为本发明实施例中OsbZIP09的突变位点示意图。
图2显示为本发明实施例中osbzip09-1突变体与ZH11的种子粒形分析示意图。
图3显示为本发明实施例中osbzip09-1突变体与ZH11的穗发芽实验结果示意图。
图4显示为本发明实施例中osbzip09-1突变体与ZH11的种子正常萌发实验结果示意图。
图5显示为本发明实施例中OsHXK6的突变位点示意图。
图6显示为本发明实施例中OsHXK6敲除突变株与ZH11的穗发芽实验结果示意图。
图7显示为本发明实施例中OsHXK6敲除突变株与ZH11的种子正常萌发实验结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本发明发明人经过大量实践研究，意外发现OsbZIP09、OsHXK6的敲减可以显著改良水稻种子的休眠特性，在显著减弱高温高湿条件下穗发芽率的同时，对正常条件下种子的萌发影响很小，从而可以有效解决水稻穗发芽问题，因此具有重要的育种应用价值，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供用于敲减OsbZIP09(水稻碱性亮氨酸拉链蛋白09，(Oryzasativa L.)basic leucine zipper 09)的物质在水稻选育中的用途，更具体可以为在水稻种子休眠性调控(例如，增强等)中的用途，也可以为稻米粒形调控(例如，增加稻米的长宽比等)中的用途。本发明发明人发现，水稻穗发芽相关基因OsbZIP09可以用于调控水稻种子的休眠性，可用于解决水稻穗发芽问题，还可以用于调控稻米粒形，可用于改善稻米品质。在相关实施例中证实，OsbZIP09基因功能明确，OsbZIP09的敲减可以明显增强种子的休眠性，且在降低穗发芽率的同时，基本不影响打破休眠后种子的正常萌发，还对水稻粒形具有一定改良效果，且生产应用便利。
本发明所提供的用途中，所涉及的水稻(Oryza sativa L.)通常具有明显的OsbZIP09活性，例如，具有明显的OsbZIP09的表达。而在植株敲减OsbZIP09以后，其种子的休眠性可以明显被增强，植株形成的稻米粒形(例如，长宽比等)可以发生明显的改变。OsbZIP09基因在不同的水稻品种中通常具有很高的保守性，所以对于该基因的敲减可以适用于各种水稻品种或者来源于这些水稻品种的杂交稻亲本等，这些水稻品种通常具有易穗发芽的特性。例如，所适用的水稻可以是粳稻(Oryza sativa subsp.geng)、籼稻(Oryzasativa L.subsp.indica)等。在本发明一具体实施例中，所适用的水稻可以是粳稻品种中花11、南粳46、或日本晴等。
本发明所提供的用途中，用于敲减OsbZIP09的物质通常可以是各种能够用于抑制水稻植株中OsbZIP09表达和/或功能的物质。例如，用于抑制OsbZIP09表达和/或功能的物质可以是部分抑制，即降低OsbZIP09的表达和/或功能，也可以完全抑制，即完全消除OsbZIP09的表达和/或其功能。再例如，用于抑制OsbZIP09表达和/或功能的物质可以是在OsbZIP09基因核酸分子水平(例如，mRNA水平、DNA水平等)，也可以是在OsbZIP09蛋白分子水平上表达水平的抑制。可以用于抑制OsbZIP09表达和/或功能的物质对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，上述物质可以是核酸分子、蛋白分子或化合物等。在本发明一具体实施例中，用于抑制OsbZIP09表达和/或功能的物质可以是核酸分子，具体可以是sgRNA、基因敲除载体、基因表达载体(例如，能够表达sgRNA、siRNA、shRNA、干扰RNA等)等。在本发明另一具体实施例中，核酸分子的靶序列可以靶向OsbZIP09外显子，靶序列可以包括SEQ ID No.3所示的序列，更具体可以是在目标位置添加一个或多个核苷酸。在本发明另另一具体实施例中，核酸分子的多核苷酸序列可以包括SEQ ID No.3所示的序列的互补序列。
本发明所提供的用途中，OsbZIP09可以是：a)氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列的蛋白(NCBI ID:XM_015772268)；或，b)氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的序列具有80％以上序列一致性、且具有a)所限定的蛋白的功能的蛋白。具体的，上述b)中的蛋白具体指：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白的功能的蛋白，例如，可以是调控水稻种子穗萌发、种子萌发和粒形调控的功能。上述b)中的蛋白的氨基酸序列可以与SEQID No.1具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性。两个多肽之间的“序列一致性(sequence identity)”通常指示序列之间相同氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列一致性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列一致性通常使用序列分析软件来测量，具体可使用NCBI数据库的BLAST等程序来确定一致性。通常来说，上述OsbZIP09可以来源于水稻。
MASKAGGGGVARRGGGRMRSLGRQGSMYSLTLDEVQSQLGEPLHSMNLDELLRSVFPDGLAIADGAGATTSSQQHQPGSGLLRQGSITMPPELSKKTVDEVWKGIQAAPKRNAETGGGGGGGRRRRERQPTLGEVTLEDFLVKAGVVTQGSLKELSDVGNVDPVGRGVTATGTVDLAPGSHWIEQYKQQIASTDAHHHGQQGVQGAYFPNRLVPQPLNVGPGAILEPSYSDGQTSSGMIGGMSDSQTPGRKRGMSGDVADKLMERRQKRMIKNRESAARSRARKQAYTNELENKVSRLEEENVRLKRQKELDELICAVPVPEPKYQLRRTSSADF(SEQ ID NO.1)
在本发明一具体实施例中，OsbZIP09的编码基因包括SEQ ID NO.2所示的序列。
ATGGCGTCGAAGGCCGGAGGCGGGGGCGTCGCGCGGCGCGGAGGAGGGCGGATGCGGAGTCTGGGGAGGCAGGGATCCATGTACAGCCTCACCCTCGACGAGGTGCAGAGCCAGCTGGGCGAGCCGCTGCACAGCATGAACCTCGACGAGCTGCTCCGGAGCGTGTTCCCTGACGGCCTGGCCATCGCCGACGGTGCCGGTGCCACCACCAGTAGCCAGCAGCATCAGCCGGGCTCGGGCCTCCTGCGGCAGGGGAGCATCACGATGCCGCCTGAGCTCAGCAAGAAGACGGTGGACGAGGTGTGGAAGGGGATCCAGGCTGCTCCGAAGAGGAATGCCGAAACGGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGTCGACGGCGGCGAGAGAGGCAGCCGACGCTTGGGGAGGTGACGCTCGAGGATTTCCTGGTCAAAGCTGGGGTTGTCACCCAAGGATCTCTCAAGGAGCTTAGTGATGTAGGCAATGTGGATCCGGTTGGAAGAGGTGTTACAGCAACCGGGACTGTGGATCTGGCACCTGGATCACACTGGATAGAGCAGTATAAGCAGCAGATTGCATCTACTGATGCTCATCACCATGGGCAGCAAGGTGTGCAGGGTGCTTATTTTCCGAATCGATTGGTCCCTCAGCCACTTAATGTTGGCCCCGGTGCTATTCTGGAGCCATCCTACTCTGATGGCCAGACTTCTTCAGGAATGATCGGCGGAATGTCCGATTCGCAGACGCCTGGAAGGAAGCGAGGCATGTCAGGGGATGTGGCAGATAAGTTGATGGAGAGAAGGCAGAAGAGGATGATCAAGAACAGGGAGTCAGCTGCCCGTTCAAGAGCCAGGAAGCAGGCCTACACTAATGAACTTGAAAACAAGGTTTCTCGTTTAGAAGAGGAGAATGTGAGGCTAAAGAGGCAAAAGGAGTTGGATGAATTAATTTGCGCTGTGCCTGTACCAGAACCCAAGTATCAACTCAGGAGAACAAGCTCCGCAGATTTCTGA(SEQ ID NO.2)
本发明第二方面提供一种水稻的选育方法，包括：
1)提供OsbZIP09敲减的突变植株；
2)提供纯合的水稻株系。本发明所提供的水稻的选育方法可以用于调控水稻种子的种子休眠性和/或稻米粒形。如上所述，用于敲减OsbZIP09的物质可以被应用于水稻选育中，通过提供OsbZIP09敲减的突变植株，并可以进一步继代繁殖，以提供纯合的水稻株系，从而可以提供改良的水稻株系，改良的水稻株系的种子通常具有明显增强的种子休眠性，且打破休眠后对种子的正常萌发影响很小，还对水稻粒形具有一定改良效果。例如，在高温高湿处理一段时间(例如，6～8天)以后，相对于野生型植株来说，OsbZIP09敲减的突变植株种子的穗发芽率可以被降低30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、37％以上、38％以上、39％以上、40％以上、42％以上、44％以上、46％以上、48％以上、或50％以上。再例如，相对于野生型植株来说，OsbZIP09敲减的突变植株打破休眠后对种子的正常萌发比例基本没有，相互之间的差别可以为5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、0.3％以下、或0.1％以下。再例如，相对于野生型植株来说，OsbZIP09敲减的突变植株的籽粒长宽比可以增加6％以上、6.5％以上、7％以上、7.5％以上、8％以上、8.5％以上、9％以上、9.5％以上、或10％以上。
本发明所提供的水稻的选育方法中，所涉及的水稻(Oryza sativa L.)通常具有明显的OsbZIP09的表达，而在植株敲减OsbZIP09以后，其种子的休眠性可以明显被增强，植株形成的稻米粒形(例如，长宽比等)可以发生明显的改变。OsbZIP09基因在不同的水稻品种中具有很高的保守性，所以对于该基因的敲减可以适用于各种水稻品种或者来源于这些水稻品种的杂交稻亲本等，这些水稻品种通常具有易穗发芽的特性。例如，OsbZIP09敲减的突变植株可以来源于粳稻(Oryza sativa subsp.geng)、籼稻(Oryza sativaL.subsp.indica)等。在本发明一具体实施例中，OsbZIP09敲减的突变植株可以来源于粳稻品种中花11、南粳46、或日本晴等。
本发明所提供的水稻的选育方法中，可以包括：提供OsbZIP09敲减的突变植株。合适的提供OsbZIP09敲减的突变植株的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，可以通过CRISPR/Cas9基因编辑技术提供OsbZIP09敲减的突变植株。在本发明一具体实施例中，可以提供针对OsbZIP09基因的编辑载体，将编辑载体转入水稻受体品种中，以提供OsbZIP09敲减的突变植株。在本发明另一具体实施例中，可以通过农杆菌介导转化法将编辑载体转入水稻受体品种中。在本发明另一具体实施例中，编辑载体的靶标序列的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
本发明所提供的水稻的选育方法中，还可以包括：提供纯合的水稻株系。上述纯合的水稻株系通常指其同一位点上(例如，OsbZIP09基因或其被敲减的靶标片段等)的两个等位基因相同的基因型个体。合适的提供纯合的水稻株系的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，可以通过继代繁殖的方法以提供纯合的水稻株系。
本发明所提供的水稻的选育方法中，水稻的选育方法还可以包括：提供纯合的水稻株系的穗子和/或种子。通过上述选育方法，可以提供各种改良的产品(例如，植株、稻穗、种子等)，这些改良的产品的种子通常具有明显增强的种子休眠性。
本发明通过对水稻中OsbZIP09相关基因的敲减，通过突变该基因核苷酸序列，筛选具有抗穗发芽特性且正常种子萌发不受影响的水稻改良株系，其整个育种方式快速、高效，且在改良水稻种子休眠特性的同时，还对水稻粒形具有一定改良效果，使其更加细长，符合目前水稻粒形改良的方向，在农业生产上具有十分重要的应用价值。
本发明第三方面提供用于敲减OsHXK6(水稻己糖激酶6，(Oryza sativa L.)Hexokinase6)的物质在水稻选育中的用途，更具体可以为在水稻种子休眠性调控(例如，增强等)中的用途。本发明发明人发现，水稻穗发芽相关基因OsHXK6可以用于调控水稻种子的休眠性，可用于解决水稻穗发芽问题。在相关实施例中证实，OsHXK6基因功能明确，OsHXK6的敲减可以明显增强种子的休眠性，且在降低穗发芽率的同时，基本不影响打破休眠后种子的正常萌发，且生产应用便利。
本发明所提供的用途中，所涉及的水稻(Oryza sativa L.)通常具有明显的OsHXK6活性，例如，具有明显的OsHXK6的表达，而在植株敲减OsHXK6以后，其种子的休眠性可以明显被增强。OsHXK6基因在不同的水稻品种中通常具有很高的保守性，所以对于该基因的敲减可以适用于各种水稻品种或者来源于这些水稻品种的杂交稻亲本等，这些水稻品种通常具有易穗发芽的特性。例如，所适用的水稻可以是粳稻(Oryza sativasubsp.geng)、籼稻(Oryza sativa L.subsp.indica)等。在本发明一具体实施例中，所适用的水稻可以是粳稻品种中花11、南粳46、或日本晴等。
本发明所提供的用途中，用于敲减OsHXK6的物质通常可以是各种能够用于抑制水稻植株中OsHXK6表达和/或功能的物质。例如，用于抑制OsHXK6表达和/或功能的物质可以是部分抑制，即降低OsHXK6的表达和/或功能，也可以完全抑制，即完全消除OsHXK6的表达和/或其功能。再例如，用于抑制OsHXK6表达和/或功能的物质可以是在OsHXK6基因核酸分子水平(例如，mRNA水平、DNA水平等)，也可以是在OsHXK6蛋白分子水平上表达水平的抑制。可以用于抑制OsHXK6表达和/或功能的物质对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，上述物质可以是核酸分子、蛋白分子或化合物等。在本发明一具体实施例中，用于抑制OsHXK6表达和/或功能的物质可以是核酸分子，具体可以是sgRNA、基因敲除载体、基因表达载体(例如，能够表达sgRNA、siRNA、shRNA、干扰RNA等)等。在本发明另一具体实施例中，核酸分子的靶序列可以靶向OsHXK6外显子，靶序列可以包括SEQ ID No.10所示的序列，更具体可以是在目标位置添加一个或多个核苷酸。在本发明另一具体实施例中，核酸分子的多核苷酸序列可以包括SEQ ID No.10所示的序列的互补序列。
本发明所提供的用途中，OsHXK6可以是：a)氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示序列的蛋白；或，b)氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示的序列具有80％以上序列一致性、且具有a)所限定的蛋白的功能的蛋白(NCBI ID：DQ116388)。具体的，上述b)中的蛋白具体指：氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的蛋白的功能的蛋白，例如，可以是调控水稻种子穗萌发、种子萌发、催化己糖磷酸化等功能。上述b)中的蛋白的氨基酸序列可以与SEQID No.8具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性。两个多肽之间的“序列一致性(sequence identity)”通常指示序列之间相同氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列一致性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列一致性通常使用序列分析软件来测量，具体可使用NCBI数据库的BLAST等程序来确定一致性。通常来说，上述OsHXK6可以来源于水稻。
MGKGTVVGTA VVVCAAAAAA VGVAVVVSRR RRSKREAEEE RRRRAAAVIE 50EVEQRFSTPTALLRGIADAM VEEMERGLRA DPHAPLKMLI SYVDNLPTGD 100EHGLFYALDL GGTNFRVIRVQLGGREKRVV SQQYEEVAIP PHLMVGTSME 150LFDFIAAELE SFVKTEGEDF HLPEGRQRELGFTFSFPVHQ TSISSGTLIK 200WTKGFSINGT VGEDVVAELS RAMERQGLDM KVTALVNDTVGTLAGGRYVD 250NDVAAAVILG TGTNAAYVEH ANAIPKWTGL LPRSGNMVIN MEWGNFKSER300LPRSDYDNAL DFESLNPGEQ IYEKMISGMY LGEIVRRILL KLAHDASLFG 350DVVPTKLEQRFILRTPDMSA MHHDTSHDLK HLGAKLKDIL GVADTSLEAR 400YITLHVCDLV AERGARLAAAGIYGILKKLG RDRVPSDGSQ KQRTVIALDG 450GLYEHYKKFR TCLEATLADL LGEEAASSVVVKLANDGSGI GAALLAASHS 500QYASVE 506（SEQ ID NO. 8） 在本发明一具体实施例中，OsHXK6的编码基因包括SEQ ID NO. 9所示的序列。 ATGGGGAAGGGGACGGTAGTGGGGACGGCGGTGGTGGTGTGCGCTGCAGCGGCCGCGGCGGTTGGGGTGGCGGTGGTGGTGTCGCGGAGGAGGAGGAGCAAGCGGGAGGCGGAGGAGGAGCGGCGGAGGAGGGCCGCCGCTGTGATCGAGGAGGTGGAGCAGAGGTTCTCGACGCCCACGGCGCTGCTGCGCGGCATCGCGGACGCCATGGTGGAGGAGATGGAGCGCGGCCTCCGCGCCGACCCTCACGCCCCGCTCAAGATGCTCATCAGCTACGTCGACAACCTCCCCACCGGGGATGAGCACGGACTGTTCTATGCTCTCGATCTTGGGGGCACCAATTTCCGTGTTATACGTGTTCAGCTTGGAGGAAGGGAAAAGCGTGTTGTTAGTCAACAGTACGAAGAGGTTGCCATTCCACCTCACCTGATGGTTGGGACTTCTATGGAACTGTTTGACTTCATTGCGGCTGAGTTGGAAAGTTTTGTCAAGACCGAGGGAGAGGATTTCCACTTGCCAGAGGGCAGGCAGAGAGAGTTAGGCTTCACCTTTTCTTTCCCAGTGCACCAAACATCAATATCATCAGGCACTCTTATTAAGTGGACAAAGGGATTTTCCATCAATGGCACGGTGGGGGAAGATGTTGTGGCTGAATTGAGCAGGGCTATGGAAAGGCAAGGGCTTGATATGAAAGTTACAGCTCTTGTTAATGACACTGTAGGCACATTGGCTGGCGGAAGATATGTTGATAATGACGTTGCTGCTGCTGTAATATTAGGCACTGGCACAAACGCAGCCTACGTGGAGCATGCAAATGCAATTCCAAAATGGACTGGATTACTACCTAGATCAGGAAATATGGTGATTAACATGGAATGGGGAAACTTCAAGTCAGAAAGGCTTCCTCGTTCAGATTACGATAATGCCTTGGACTTTGAAAGTTTAAACCCAGGCGAGCAGATATATGAAAAGATGATTTCCGGCATGTATCTTGGAGAGATTGTGCGCAGAATCTTGCTTAAGCTTGCTCATGATGCTTCCTTGTTTGGAGATGTTGTTCCAACAAAGCTGGAGCAGCGCTTTATACTGAGGACGCCGGACATGTCAGCGATGCATCATGATACCTCACATGATCTGAAACACCTGGGAGCTAAGCTGAAGGATATCCTGGGGGTCGCTGATACTTCCCTGGAAGCACGATACATCACCCTTCATGTCTGCGACCTCGTTGCAGAGAGAGGTGCACGCTTAGCTGCTGCTGGTATATATGGCATTCTAAAGAAGCTGGGCAGGGACAGAGTGCCAAGTGACGGTAGTCAAAAGCAGAGGACTGTCATTGCTCTGGATGGTGGTCTCTATGAGCATTACAAGAAGTTCAGAACCTGCCTAGAAGCAACGCTTGCAGACCTGCTTGGAGAGGAGGCTGCCTCATCAGTTGTTGTCAAGTTGGCAAACGATGGCTCTGGCATCGGAGCTGCACTTCTTGCAGCATCTCACTCCCAGTATGCTAGCGTCGAGTAG(SEQ ID NO.9)
本发明第四方面提供一种水稻的选育方法，包括：
1)提供OsHXK6敲减的突变植株；
2)提供纯合的水稻株系。本发明所提供的水稻的选育方法可以用于调控水稻种子的种子休眠性。如上所述，用于敲减OsHXK6的物质可以被应用于水稻选育中，通过提供OsHXK6敲减的突变植株，并进一步继代繁殖提供纯合的水稻株系，从而可以提供改良的水稻株系，改良的水稻株系的种子通常具有明显增强的种子休眠性，且打破休眠后对种子的正常萌发影响很小。例如，在高温高湿处理一段时间(例如，6～8天)以后，相对于野生型植株来说，OsHXK6敲减的突变植株种子的穗发芽率可以被降低30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、37％以上、38％以上、39％以上、40％以上、42％以上、44％以上、46％以上、48％以上、或50％以上。再例如，相对于野生型植株来说，OsbZIP09敲减的突变植株打破休眠后对种子的正常萌发比例基本没有，相互之间的差别可以为5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、0.3％以下、或0.1％以下。
本发明所提供的水稻的选育方法中，所涉及的水稻(Oryza sativa L.)通常具有明显的OsHXK6的表达，而在植株敲减OsHXK6以后，其种子的休眠性可以明显被增强。OsHXK6基因在不同的水稻品种中具有很高的保守性，所以对于该基因的敲减可以适用于各种水稻品种或者来源于这些水稻品种的杂交稻亲本等，这些水稻品种通常具有易穗发芽的特性。例如，OsHXK6敲减的突变植株可以来源于粳稻(Oryza sativa subsp.geng)、籼稻(Oryzasativa L.subsp.indica)等。在本发明一具体实施例中，OsHXK6敲减的突变植株可以来源于粳稻品种中花11、南粳46、或日本晴等。
本发明所提供的水稻的选育方法中，可以包括：提供OsbZIP09敲减的突变植株。合适的提供OsHXK6敲减的突变植株的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，可以通过CRISPR/Cas9基因编辑技术提供OsHXK6敲减的突变植株。在本发明一具体实施例中，可以提供针对OsHXK6基因的编辑载体，将编辑载体转入水稻受体品种中，以提供OsHXK6敲减的突变植株。在本发明另一具体实施例中，可以通过农杆菌介导转化法将编辑载体转入水稻受体品种中。在本发明另一具体实施例中，编辑载体的靶标序列的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。
本发明所提供的水稻的选育方法中，还可以包括：提供纯合的水稻株系。上述纯合的水稻株系通常指其同一位点上(例如，OsHXK6基因或其被敲减的靶标片段等)的两个等位基因相同的基因型个体。合适的提供纯合的水稻株系的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，可以通过继代繁殖的方法以提供纯合的水稻株系。
本发明所提供的水稻的选育方法中，水稻的选育方法还可以包括：提供纯合的水稻株系的穗子和/或种子。通过上述选育方法，可以提供各种改良的产品(例如，植株、稻穗、种子等)，这些改良的产品的种子通常具有明显增强的种子休眠性。
本发明通过对水稻中OsHXK6相关基因的敲减，通过突变该基因核苷酸序列，筛选具有抗穗发芽特性且正常种子萌发不受影响的水稻改良株系，其整个育种方式快速、高效，且在改良水稻种子休眠特性的同时，还对水稻粒形具有一定改良效果，使其更加细长，符合目前水稻粒形改良的方向，在农业生产上具有十分重要的应用价值。
下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
osbzip09突变体水稻的创建、鉴定及其萌发特性分析
本发明通过构建OsbZIP09基因的编辑载体CRISPR-OsbZIP09，再通过农杆菌介导的遗传转化方法将编辑载体CRISPR-OsbZIP09导入受体水稻品种ZH11中，随后从后代中筛选获得OsbZIP09敲除的突变植株，继代繁殖获得该株系的纯合后代，最后通过测定新收获穗子和种子的发芽率考察其种子休眠性。具体步骤如下：
1.水稻材料
粳稻(Oryza sativa subsp.geng)品种中花11(ZH11)。
2.基因编辑载体的构建
参照CRISPR/Cas9编辑技术，根据对照材料中OsbZIP09基因碱基序列选定特异性靶标序列“GTACAGCCTCACCCTCGACG”(SEQ ID NO.3)，根据靶标序列设计成反向互补引物后连入中间载体SK-gRNA中；利用限制性核酸内切酶Aar I酶切中间载体，回收包含靶位点的gRNA片段连入最终载体pC1300-Cas9，测序无误后用农杆菌介导的遗传转化方法(刘巧泉，张景六，王宗阳，洪孟民，顾铭洪.根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立.植物生理学报,1998,24(3):259-271.)将重组载体转入水稻中。(SK-gRNA载体和pC1300-Cas9载体信息参见Wang C,Shen L,Fu Y,Yan C,Wang K.A Simple CRISPR/Cas9 System for MultiplexGenome Editing in Rice.J Genet Genomics,2015,42(12):703-706.)
3.osbzip09突变体的鉴定及粒形分析
继代繁殖osbzip09突变株，自交得到T1代株系。
用CTAB方法从T1代株系的水稻叶片中快速提取其基因组DNA，用引物Hyg-F和Hyg-R扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增条带清晰的为含潮霉素标记基因后代。筛选没有潮霉素标记的单株，再以无潮霉素标记株的DNA为模板，利用引物CAS-OsbZIP09-F和CAS-OsbZIP09-R扩增OsbZIP09基因片段，测序筛选获得OsbZIP09基因敲除纯合子株系osbzip09-1。收获osbzip09-1株系(突变体纯合子)及其对照株系ZH11的种子继续种成纯合系，用于后续穗发芽和种子萌发实验。
本实验获得单碱基A插入突变突变体osbzip09-1(如图1所示)，导致编码氨基酸发生移码突变，OsbZIP09基因被敲除。osbzip09-1株系种子的粒长显著长于野生型ZH11，粒宽略窄于ZH11，整体呈现更为细长的粒形(如图2所示)，符合目前稻米优质育种的要求。
所用引物具体序列为：
Hyg-F：5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGGT-3'(SEQ ID NO.4)
Hyg-R：5'-GGTCGCGGAGGCTATGGATGC-3'(SEQ ID NO.5)
CAS-OsbZIP09-F：5'-ATCTCGTCTCGATCATGGGG-3'(SEQ ID NO.6)
CAS-OsbZIP09-R：5'-CCCCAGCTTTGACCAGGAAA-3'(SEQ ID NO.7)
4.水稻穗子和种子发芽特性分析
穗发芽实验：每种材料(即第三部分中的筛选获得的osbzip09-1突变体纯合子株系及其对照株系ZH11)收取5个生长状态一致的成熟主穗直接用于穗萌发分析，实验前统计好每穗的籽粒数及空瘪粒数。通过在人工气候室设置高温条件(白天最高温38℃，晚上最低温28℃)，并将收获的水稻成熟主穗浸没于水中，从而模拟高温高湿的生长环境，促进穗发芽的发生，每隔两天统计每个穗子上发芽的籽粒数直至第8天。
种子正常萌发实验：如上所述的每种材料收获的成熟种子经过后熟烘干，挑选整齐一致的种子用于萌发分析。每个培养皿30粒种子，置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，加6ml水，进行暗处萌发培养，以胚芽伸出2cm作为发芽参考标准。从浸种24小时后开始，每隔12小时统计一次发芽率，直至108小时。3个生物学重复，以受体材料ZH11为对照，比较突变体与ZH11的发芽率。
穗发芽实验的结果如图3所示。由图3可知，相对于对照ZH11，穗发芽模拟试验结果显示osbzip09-1株系的水稻穗发芽率显著低于对照ZH11。
种子正常萌发实验的结果如图4所示。由图4可知，种子经烘干打破休眠后，尽管osbzip09-1株系的种子萌发稍慢于野生型ZH11，但浸种84小时后发芽率与对照ZH11一样均可达到100％。
由此可见，osbzip09-1株系的种子休眠性大大提高，通过敲除OsbZIP09基因可增强受体水稻品种的休眠特性，增强其抗穗发芽能力，且打破休眠后对种子的正常萌发影响很小，具有良好的育种应用价值。
实施例2
编辑载体pC1300-Cas9-OsHXK6的构建、转化和突变植株的筛选
本发明通过构建OsHXK6基因的编辑载体pC1300-Cas9-OsHXK6，再通过农杆菌介导的遗传转化方法将编辑载体pC1300-Cas9-OsHXK6导入受体水稻品种ZH11中，随后从后代中筛选获得OsHXK6敲除的突变植株，继代繁殖获得该株系的纯合后代，最后通过测定新收获穗子和种子的发芽率考察其种子休眠性。具体步骤如下：
1)扩增合成表达盒片段：
参照CRISPR/Cas9编辑技术，根据对照材料中OsHXK6基因碱基序列选定特异性靶标序列“GTCCACCTCCTCGATCACAG”(SEQ ID NO.10)，根据靶标序列合成反向互补引物Crispr-OsHXK6-F和Crispr-OsHXK6-R后，连入中间载体SK-gRNA中；利用限制性核酸内切酶Aar I酶切中间载体，回收包含靶位点的gRNA片段连入最终载体pC1300-Cas9载体。(SK-gRNA载体和pC1300-Cas9载体信息参见Wang C,Shen L,Fu Y,Yan C,Wang K.A SimpleCRISPR/Cas9 System for Multiplex Genome Editing in Rice.J Genet Genomics,2015,42(12):703-706.)
2)获得含正确sg表达盒的pC1300-Cas9-OsHXK6载体：
取连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，转化产物涂布卡那霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养过夜，挑选10个单克隆进行提取质粒并酶切验证。选择3个阳性克隆进行测序检测，选择测序正确的最终表达载体pC1300-Cas9-OsHXK6质粒进行下一步的转化。
3)农杆菌介导的水稻遗传转化：
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(刘巧泉，张景六，王宗阳，洪孟民，顾铭洪.根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立.植物生理学报,1998,24(3):259-271.)将编辑载体pC1300-Cas9-OsHXK6导入受体水稻ZH11(粳稻(Oryza sativa subsp.geng)品种中花11)中，提取转基因植株的基因组DNA，用引物Hyg-F和Hyg-R扩增，琼脂糖凝胶检测扩增产物，扩增条带清晰的为阳性转化植株：再以阳性株DNA为模板，利用引物CAS-OsHXK6-F和CAS-OsHXK6-R扩增OsHXK6基因编辑目标区段DNA序列，进一步测序分析，并以受体ZH11相应的DNA序列为对照，比较测序结果，选择OsHXK6基因成功突变的植株。
所用引物具体序列为：
Crispr-OsHXK6-F：5'-ggcaGTCCACCTCCTCGATCACAG-3'(SEQ ID NO.11)
Crispr-OsHXK6-R：5'-aaacCTGTGATCGAGGAGGTGGAC-3'(SEQ ID NO.12)
Hyg-F：5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGGT-3'(SEQ ID NO.13)
Hyg-R：5'-GGTCGCGGAGGCTATGGATGC-3'(SEQ ID NO.14)
CAS-OsHXK6-F：5'-CCCGAAGAGAAACACCCCTC-3'(SEQ ID NO.15)
CAS-OsHXK6-R：5'-ATCGAGAGGGAGGCCAGG-3'(SEQ ID NO.16)
实施例3
突变后代的DNA序列分析
继代繁殖OsHXK6基因突变株，自交得到T1代株系。
提取其基因组DNA，用引物Hyg-F和Hyg-R扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增条带清晰的为含潮霉素标记基因后代。筛选没有潮霉素标记的单株，再以无潮霉素标记株的DNA为模板，利用引物CAS-OsHXK6-F和CAS-OsHXK6-R扩增OsHXK6基因片段，测序筛选OsHXK6敲除突变株。本次实验获得单碱基插入后代I1，导致编码氨基酸发生移码突变，OsHXK6基因被敲除。其中获得的两个OsHXK6敲除突变纯合株，分别为hxk6-3和hxk6-5(OsHXK6突变株的基因型如图5所示)，收获hxk6-3、hxk6-5及其对照ZH11的种子继续种植成纯合系，用于后续穗发芽和种子萌发实验。
实施例4
一并收获2个OsHXK6敲除突变株(突变体纯合子，实施例2中筛选获得)及其对照株系ZH11的穗子和种子。
水稻穗子和种子发芽特性分析：
穗发芽实验：每种材料收取5个生长状态一致的成熟主穗直接用于穗萌发分析，实验前统计好每穗的籽粒数及空瘪粒数。通过在人工气候室设置高温条件(白天最高温38℃，晚上最低温28℃)，并将收获的水稻成熟主穗浸没于水中，从而模拟高温高湿的生长环境，促进穗发芽的发生，第6天统计每个穗子上发芽的籽粒数。
种子正常萌发实验：如上所述的每种材料收获的成熟种子经过后熟烘干，挑选整齐一致的种子用于萌发分析。每个培养皿30粒种子，置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，加6ml水，进行暗处萌发培养，以胚芽伸出2cm作为发芽参考标准。3个生物学重复，以受体材料ZH11为对照，比较突变体与ZH11的发芽率。
穗发芽实验的结果如图6所示。由图6可知，相对于对照ZH11，穗发芽模拟试验结果显示两个OsHXK6敲除突变株的水稻穗发芽率均显著低于对照ZH11。
种子正常萌发实验的结果如图7所示。由图7可知，种子经过后熟烘干，两个OsHXK6敲除突变株的发芽率均与对照ZH11相近。
由此可见，OsHXK6敲除纯合后代的种子休眠性大大提高，通过敲除OsHXK6基因可改善受体水稻品种的抗穗发芽能力，且打破休眠后对种子的正常萌发影响很小，具有良好的育种应用价值。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 水稻种子休眠性调控基因及其用途
<150> 2021100756019
<151> 2021-01-20
<150> 2021100756038
<151> 2021-01-20
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 335
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 1
Met Ala Ser Lys Ala Gly Gly Gly Gly Val Ala Arg Arg Gly Gly Gly
1 5 10 15
Arg Met Arg Ser Leu Gly Arg Gln Gly Ser Met Tyr Ser Leu Thr Leu
20 25 30
Asp Glu Val Gln Ser Gln Leu Gly Glu Pro Leu His Ser Met Asn Leu
35 40 45
Asp Glu Leu Leu Arg Ser Val Phe Pro Asp Gly Leu Ala Ile Ala Asp
50 55 60
Gly Ala Gly Ala Thr Thr Ser Ser Gln Gln His Gln Pro Gly Ser Gly
65 70 75 80
Leu Leu Arg Gln Gly Ser Ile Thr Met Pro Pro Glu Leu Ser Lys Lys
85 90 95
Thr Val Asp Glu Val Trp Lys Gly Ile Gln Ala Ala Pro Lys Arg Asn
100 105 110
Ala Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg Arg Arg Glu Arg
115 120 125
Gln Pro Thr Leu Gly Glu Val Thr Leu Glu Asp Phe Leu Val Lys Ala
130 135 140
Gly Val Val Thr Gln Gly Ser Leu Lys Glu Leu Ser Asp Val Gly Asn
145 150 155 160
Val Asp Pro Val Gly Arg Gly Val Thr Ala Thr Gly Thr Val Asp Leu
165 170 175
Ala Pro Gly Ser His Trp Ile Glu Gln Tyr Lys Gln Gln Ile Ala Ser
180 185 190
Thr Asp Ala His His His Gly Gln Gln Gly Val Gln Gly Ala Tyr Phe
195 200 205
Pro Asn Arg Leu Val Pro Gln Pro Leu Asn Val Gly Pro Gly Ala Ile
210 215 220
Leu Glu Pro Ser Tyr Ser Asp Gly Gln Thr Ser Ser Gly Met Ile Gly
225 230 235 240
Gly Met Ser Asp Ser Gln Thr Pro Gly Arg Lys Arg Gly Met Ser Gly
245 250 255
Asp Val Ala Asp Lys Leu Met Glu Arg Arg Gln Lys Arg Met Ile Lys
260 265 270
Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr
275 280 285
Asn Glu Leu Glu Asn Lys Val Ser Arg Leu Glu Glu Glu Asn Val Arg
290 295 300
Leu Lys Arg Gln Lys Glu Leu Asp Glu Leu Ile Cys Ala Val Pro Val
305 310 315 320
Pro Glu Pro Lys Tyr Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ser Ala Asp Phe
325 330 335
<210> 2
<211> 1008
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
atggcgtcga aggccggagg cgggggcgtc gcgcggcgcg gaggagggcg gatgcggagt 60
ctggggaggc agggatccat gtacagcctc accctcgacg aggtgcagag ccagctgggc 120
gagccgctgc acagcatgaa cctcgacgag ctgctccgga gcgtgttccc tgacggcctg 180
gccatcgccg acggtgccgg tgccaccacc agtagccagc agcatcagcc gggctcgggc 240
ctcctgcggc aggggagcat cacgatgccg cctgagctca gcaagaagac ggtggacgag 300
gtgtggaagg ggatccaggc tgctccgaag aggaatgccg aaacgggcgg cggcggcggc 360
ggaggtcgac ggcggcgaga gaggcagccg acgcttgggg aggtgacgct cgaggatttc 420
ctggtcaaag ctggggttgt cacccaagga tctctcaagg agcttagtga tgtaggcaat 480
gtggatccgg ttggaagagg tgttacagca accgggactg tggatctggc acctggatca 540
cactggatag agcagtataa gcagcagatt gcatctactg atgctcatca ccatgggcag 600
caaggtgtgc agggtgctta ttttccgaat cgattggtcc ctcagccact taatgttggc 660
cccggtgcta ttctggagcc atcctactct gatggccaga cttcttcagg aatgatcggc 720
ggaatgtccg attcgcagac gcctggaagg aagcgaggca tgtcagggga tgtggcagat 780
aagttgatgg agagaaggca gaagaggatg atcaagaaca gggagtcagc tgcccgttca 840
agagccagga agcaggccta cactaatgaa cttgaaaaca aggtttctcg tttagaagag 900
gagaatgtga ggctaaagag gcaaaaggag ttggatgaat taatttgcgc tgtgcctgta 960
ccagaaccca agtatcaact caggagaaca agctccgcag atttctga 1008
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtacagcctc accctcgacg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttctgcgg gcgatttggt 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtcgcggag gctatggatg c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atctcgtctc gatcatgggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccccagcttt gaccaggaaa 20
<210> 9
<211> 506
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 9
Met Gly Lys Gly Thr Val Val Gly Thr Ala Val Val Val Cys Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Val Gly Val Ala Val Val Val Ser Arg Arg Arg Arg
20 25 30
Ser Lys Arg Glu Ala Glu Glu Glu Arg Arg Arg Arg Ala Ala Ala Val
35 40 45
Ile Glu Glu Val Glu Gln Arg Phe Ser Thr Pro Thr Ala Leu Leu Arg
50 55 60
Gly Ile Ala Asp Ala Met Val Glu Glu Met Glu Arg Gly Leu Arg Ala
65 70 75 80
Asp Pro His Ala Pro Leu Lys Met Leu Ile Ser Tyr Val Asp Asn Leu
85 90 95
Pro Thr Gly Asp Glu His Gly Leu Phe Tyr Ala Leu Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Thr Asn Phe Arg Val Ile Arg Val Gln Leu Gly Gly Arg Glu Lys Arg
115 120 125
Val Val Ser Gln Gln Tyr Glu Glu Val Ala Ile Pro Pro His Leu Met
130 135 140
Val Gly Thr Ser Met Glu Leu Phe Asp Phe Ile Ala Ala Glu Leu Glu
145 150 155 160
Ser Phe Val Lys Thr Glu Gly Glu Asp Phe His Leu Pro Glu Gly Arg
165 170 175
Gln Arg Glu Leu Gly Phe Thr Phe Ser Phe Pro Val His Gln Thr Ser
180 185 190
Ile Ser Ser Gly Thr Leu Ile Lys Trp Thr Lys Gly Phe Ser Ile Asn
195 200 205
Gly Thr Val Gly Glu Asp Val Val Ala Glu Leu Ser Arg Ala Met Glu
210 215 220
Arg Gln Gly Leu Asp Met Lys Val Thr Ala Leu Val Asn Asp Thr Val
225 230 235 240
Gly Thr Leu Ala Gly Gly Arg Tyr Val Asp Asn Asp Val Ala Ala Ala
245 250 255
Val Ile Leu Gly Thr Gly Thr Asn Ala Ala Tyr Val Glu His Ala Asn
260 265 270
Ala Ile Pro Lys Trp Thr Gly Leu Leu Pro Arg Ser Gly Asn Met Val
275 280 285
Ile Asn Met Glu Trp Gly Asn Phe Lys Ser Glu Arg Leu Pro Arg Ser
290 295 300
Asp Tyr Asp Asn Ala Leu Asp Phe Glu Ser Leu Asn Pro Gly Glu Gln
305 310 315 320
Ile Tyr Glu Lys Met Ile Ser Gly Met Tyr Leu Gly Glu Ile Val Arg
325 330 335
Arg Ile Leu Leu Lys Leu Ala His Asp Ala Ser Leu Phe Gly Asp Val
340 345 350
Val Pro Thr Lys Leu Glu Gln Arg Phe Ile Leu Arg Thr Pro Asp Met
355 360 365
Ser Ala Met His His Asp Thr Ser His Asp Leu Lys His Leu Gly Ala
370 375 380
Lys Leu Lys Asp Ile Leu Gly Val Ala Asp Thr Ser Leu Glu Ala Arg
385 390 395 400
Tyr Ile Thr Leu His Val Cys Asp Leu Val Ala Glu Arg Gly Ala Arg
405 410 415
Leu Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Ile Leu Lys Lys Leu Gly Arg Asp
420 425 430
Arg Val Pro Ser Asp Gly Ser Gln Lys Gln Arg Thr Val Ile Ala Leu
435 440 445
Asp Gly Gly Leu Tyr Glu His Tyr Lys Lys Phe Arg Thr Cys Leu Glu
450 455 460
Ala Thr Leu Ala Asp Leu Leu Gly Glu Glu Ala Ala Ser Ser Val Val
465 470 475 480
Val Lys Leu Ala Asn Asp Gly Ser Gly Ile Gly Ala Ala Leu Leu Ala
485 490 495
Ala Ser His Ser Gln Tyr Ala Ser Val Glu
500 505
<210> 9
<211> 1521
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 9
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gttggggtgg cggtggtggt gtcgcggagg aggaggagca agcgggaggc ggaggaggag 120
cggcggagga gggccgccgc tgtgatcgag gaggtggagc agaggttctc gacgcccacg 180
gcgctgctgc gcggcatcgc ggacgccatg gtggaggaga tggagcgcgg cctccgcgcc 240
gaccctcacg ccccgctcaa gatgctcatc agctacgtcg acaacctccc caccggggat 300
gagcacggac tgttctatgc tctcgatctt gggggcacca atttccgtgt tatacgtgtt 360
cagcttggag gaagggaaaa gcgtgttgtt agtcaacagt acgaagaggt tgccattcca 420
cctcacctga tggttgggac ttctatggaa ctgtttgact tcattgcggc tgagttggaa 480
agttttgtca agaccgaggg agaggatttc cacttgccag agggcaggca gagagagtta 540
ggcttcacct tttctttccc agtgcaccaa acatcaatat catcaggcac tcttattaag 600
tggacaaagg gattttccat caatggcacg gtgggggaag atgttgtggc tgaattgagc 660
agggctatgg aaaggcaagg gcttgatatg aaagttacag ctcttgttaa tgacactgta 720
ggcacattgg ctggcggaag atatgttgat aatgacgttg ctgctgctgt aatattaggc 780
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aagcttgctc atgatgcttc cttgtttgga gatgttgttc caacaaagct ggagcagcgc 1080
tttatactga ggacgccgga catgtcagcg atgcatcatg atacctcaca tgatctgaaa 1140
cacctgggag ctaagctgaa ggatatcctg ggggtcgctg atacttccct ggaagcacga 1200
tacatcaccc ttcatgtctg cgacctcgtt gcagagagag gtgcacgctt agctgctgct 1260
ggtatatatg gcattctaaa gaagctgggc agggacagag tgccaagtga cggtagtcaa 1320
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acctgcctag aagcaacgct tgcagacctg cttggagagg aggctgcctc atcagttgtt 1440
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cagtatgcta gcgtcgagta g 1521
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 14
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<210> 15
<211> 20
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<400> 15
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atcgagaggg aggccagg 18
Claims (12)
1.用于敲除OsbZIP09的物质在水稻选育中的用途，所述用途为水稻种子休眠性调控和/或稻米粒形调控中的用途，所述水稻种子休眠性调控为增强水稻种子休眠性，所述稻米粒形调控为增加稻米的长宽比，所述OsbZIP09的编码序列为SEQ ID NO. 2所示的序列。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述水稻选自粳稻和/或籼稻。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述水稻选自粳稻品种中花11、南粳46、或日本晴。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述OsbZIP09的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的序列。
5.一种水稻的选育方法，所述选育方法为增强水稻种子休眠性和/或增加稻米的长宽比的方法，包括：
1）提供OsbZIP09敲除的突变植株，所述OsbZIP09的编码序列为SEQ ID NO. 2所示的序列；
2）提供纯合的水稻株系。
6.如权利要求5所述的水稻的选育方法，其特征在于，所述OsbZIP09的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的序列。
7.如权利要求5所述的水稻的选育方法，其特征在于，所述OsbZIP09敲减的突变植株来源于粳稻和/或籼稻。
8.如权利要求5所述的水稻的选育方法，其特征在于，所述OsbZIP09敲减的突变植株来源于粳稻品种中花11、南粳46或日本晴。
9.如权利要求5所述的水稻的选育方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术提供OsbZIP09敲减的突变植株。
10.如权利要求5所述的水稻的选育方法，其特征在于，提供OsbZIP09敲减的突变植株的方法具体包括：提供针对OsbZIP09基因的编辑载体，将编辑载体转入水稻受体品种中。
11.如权利要求9所述的水稻的选育方法，其特征在于，通过农杆菌介导转化法将编辑载体转入水稻受体品种中；
和/或，编辑载体的靶标序列的多核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示的序列。
12.如权利要求5所述的水稻的选育方法，其特征在于，继代繁殖以提供纯合的水稻株系；
和/或，所述水稻的选育方法还包括：提供纯合的水稻株系的穗子和/或种子。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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