CN109485710B

CN109485710B - 水稻种子休眠性调控基因OsAnn3及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN109485710B
Application number: CN201811553959.2A
Authority: CN
Inventors: 沈春修; 却志群; 卢其能; 李生强; 陈刚; 刘小林; 张进兵; 陈丽; 黄贵忠
Original assignee: Yichun University
Current assignee: Yichun University
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: CN109485710A

Abstract

本发明公开了一种水稻种子休眠性调控基因编码的蛋白，该蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后但功能不变的氨基酸序列。本发明还公开了水稻种子休眠性调控基因OsAnn3。本发明还提供了一种提高水稻种子休眠性的方法和调控基因OsAnn3及其编码蛋白在提高植物种子休眠性中的应用。本发明利用调控基因OsAnn3及其编码蛋白参与水稻种子休眠调控的特点及CRISPR/Cas9基因编码的功能，使得水稻中的调控基因OsAnn3活性降低或者失活，从而获得种子休眠性得到提高的水稻株系，有利于防止水稻收获前穗发芽。

Description

水稻种子休眠性调控基因OsAnn3及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及一种水稻种子休眠性调控基因OsAnn3及其编码的蛋白和应用。

背景技术

种子休眠是植物生长发育中的自然现象，是避免种子在不适宜环境下萌发的一种生理机能。种子休眠受外部环境(光，温度，湿度)、内部因素(如激素GA，ABA等)以及种子结构(种皮，胚效应)等多因素影响。

生产中，重要禾谷类作物(如水稻、小麦、大麦和玉米等)在种子成熟期如遇高温高湿时容易引发穗发芽，严重影响作物的产量和品质。不同年份穗发芽对水稻生产造成不同程度的危害，据资料统计，我国水稻生产每年因穗发芽造成的损失率达5％以上，某些年份严重时甚至达50％。因此，研究解决水稻穗发芽抗性问题对促进水稻生产、确保我国的粮食安全有重大意义。

水稻的穗发芽抗性与种子休眠性密切相关。研究水稻品种的次生休眠特性，发掘出休眠性弱的品种，可以有利于防止自生苗；选择休眠性强的品种，则有利于防止收获前穗发芽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻种子休眠性调控基因编码的蛋白及其应用。

本发明提供了一种水稻种子休眠性调控基因编码的蛋白，该蛋白具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后但功能不变的氨基酸序列。

在一个实施方案中，该蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种水稻种子休眠性调控基因OsAnn3，该调控基因OsAnn3具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者该调控基因OsAnn3具有编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一个实施方案中，该调控基因OsAnn3具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

另一方面，本发明还提供了一种提高水稻种子休眠性的方法，该方法包括通过CRISPR/Cas9基因编辑系统干扰或敲除上述调控基因OsAnn3，降低或破坏所述调控基因OsAnn3的生物学功能，获得水稻OsAnn3突变体。

在一个实施方案中，上述方法还包括构建种子休眠性调控基因OsAnn3的编辑载体并导入水稻细胞中，筛选后代，获得种子休眠性得到提高的水稻株系。

在一个实施方案中，上述方法包括以下步骤：

1)所述调控基因OsAnn3的编辑载体构建:参照CRISPR/Cas9基因编辑技术，选定靶标序列，构建编辑载体；

2)采用农杆菌介导的遗传转化方法将所述调控基因OsAnn3的编辑载体转入水稻中；

3)培养和筛选所述调控基因OsAnn3基因敲除成功的水稻OsAnn3突变体，繁殖所述水稻OsAnn3突变体的水稻突变体。

另一方面，本发明还提供了上述蛋白和上述调控基因OsAnn3在提高植物种子休眠性中的应用。

在一个实施方案中，上述植物为水稻。

在一个实施方案中，上述应用包括使所述水稻种子休眠性调控基因OsAnn3失活，从而获得水稻OsAnn3突变体。

本发明利用调控基因OsAnn3及其编码蛋白参与水稻种子休眠调控的特点及CRISPR/Cas9基因编码的功能，使得水稻中的调控基因OsAnn3活性降低或者失活，从而获得种子休眠性得到提高的水稻株系，有利于防止水稻收获前穗发芽。

附图说明

图1为本发明的一个实施例的植物基因编辑表达载体pSK51-Cas9-OsAnn3的构建流程示意图；

图2为本发明的一个实施例获得的敲除OsAnn3基因的水稻后代种子打破休眠前的发芽率；

图3为本发明的一个实施例获得的敲除OsAnn3基因的水稻后代种子打破休眠后的发芽率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施方案通过构建OsAnn3基因的编辑表达载体pSK51-Cas9-OsAnn3，再通过农杆菌介导的遗传转化方法将编辑表达载体pSK51-Cas9-OsAnn3导入易穗发芽水稻材料TP309，从后代中筛选获得OsAnn3双等位基因成功敲除的纯合株系，繁殖收获后代种子，最后通过测定新收获后代种子的发芽率考察其种子休眠性。

1.具体方法包括如下步骤:

1.1构建基因编辑表达载体pSK51-Cas9-OsAnn3

a参照CRISPR/Cas9编辑技术，根据对照材料中OsAnn3基因碱基序列在PAM序列CGG前选定靶标序列“AGGCAGCCGGAGAAGCT"，根据靶标序列合成两条携带接头的寡聚引物OsAnn3-Oligo1和OsAnn3-Oligo2(接头序列与经Bbs I酶切后的载体粘性末端互补)

b将合成好的接头引物TE溶解成100μM母液，各取1μL加入到98μL 0.5×TE混合稀释到1μM，约90℃，30Sec，移至室温冷却完成退火，作为下一步与克隆载体连接的靶点接头引物(TAM)。

c将制备好的靶点接头引物(TAM)与经BbsI酶切后回收的CRISPR/Cas9克隆载体psgR-Cas9-Os(见图1)进行连接，连接程序为22℃3h，16℃过夜连接；使用M13-F和靶点接头引物Oligo2于2％琼脂糖凝胶上进行PCR阳性克隆鉴定并测序。

d将测序正确的重组CRISPR/Cas9克隆载体使用EcoR I和Hind III双酶切，回收包含Cas9和引导RNA的载体片断，然后与经EcoRI和Hind III双酶切后回收的pSK51载体大片断连接，热激转化大肠杆菌细胞，涂板后挑取单菌落，摇菌；抽提质粒，使用EcoR I和HindIII双酶切鉴定阳性克隆，即为基因编辑表达载体pSK51-Cas9-OsAnn3。

以上步骤中所用到的引物序列如下:

OsAnn3-Oligo1:TGGCAGGCAGCCGGAGAAGCT

OsAnn3-Oligo2:AAACAGCTTCTCCGGCTGCCT

M13-F:TGTAAAACGACGGCCAGT

1.2转基因获水稻OsAnn3突变体

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将基因编辑表达载体pSK51-Cas9-OsAnn3导入野生型水稻材料TP309，To代，提取DNA，用引物Hpt-F和Hpt-R扩增，琼脂糖凝胶检测扩增产物，扩增条带清晰的为阳性转化植株；再以阳性株DNA为模板，利用引物TB-OsAnn3F和TB-OsAnn3R扩增靶标位点片段测序，以受体材料DNA序列为对照，比较测序结果，选择OsAnn3基因突变株。

Hpt-F:GCTTCTGCGGGCGATTTGTG

Hpt-R:CTGAACTCACCGCGACGTCTG

TB-OsAnn3F:GTGTGTGCATTTATGCTGCTG

TB-OsAnn3R:GCCATTGAAGCTCTTCCTG

2.结果分析

2.1.水稻OsAnn3突变体的DNA分析:

继代繁殖OsAnn3基因突变体，自交得到T1代株系，提取DNA，用引物Hpt-F和Hpt-R扩增，琼脂糖凝胶检测扩增产物，扩增条带清晰的为含潮霉素标记基因后代；筛选没有潮霉素标记的单株，再以无潮霉素标记株的DNA为模板，利用引物TB-OsAnn3F和TB-OsAnn3R扩增OsAnn3基因靶标位点片段，测序筛选OsAnn3基因双等位敲除突变株。本次实施例获得双等位纯合三碱基缺失后代(---为缺失碱基)，导致编码氨基酸发生移码突变，OsAnn3基因被敲除。

对照TP309:GCGCAGGCAGCCGGAGAAGCTCGGGTT

敲除后代:GCGCAGGCAGCCGGAGA---TCGGGTT

2.2.种子休眠性分析

继续繁殖OsAnn3基因双等位纯合敲除单株，分别收获OsAnn3敲除纯合子以及野生型TP309种子，每个网袋装100粒，浸水48小时；用湿毛巾包裹于37℃催芽两天，期间保持毛巾湿润，后置于9CM铺有湿润滤纸的培养皿中统计发芽率(打破休眠前)并于37℃培养箱保湿培养，两星期内每隔2-3天统计一次发芽率，后续发芽率变化逐渐减缓直至无明显变化，以两周内的最后统计结果作为纯合双等位突变体打破休眠后的发芽率，以种子芽长超过种子长度一半作为发芽标准，3个生物学重复。以受体材料TP309为野生型对照，比较不同材料的发芽率。

如图2所示，相对于野生型TP309，打破休眠前OsAnn3敲除纯合后代的种子发芽率为零；如图3所示，打破休眠后，OsAnn3敲除后代发芽率与野生型TP309相近。由此可见，OsAnn3敲除纯合后代的种子休眠性大大提高，通过敲除OsAnn3基因可改善植物的抗穗发芽能力。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 宜春学院

<120> 水稻种子休眠性调控基因OsAnn3及其编码的蛋白和应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctgatg aaatccagca tctgaccagg gccttctcag ggctcggtgg cctcggcgtg 60

gacgagccgg cgatggtgtc ggcgctggcc aagtggcgca ggcagccgga gaagctgtcc 120

gggttcagga agagcttcaa tggcttcttc aaggatcatg gcggcgtcat cgagaagtgc 180

gaggaggagt acatgctcca cctcgccgcc gagttctcgc ggttcaagaa cctgatggtg 240

atgtgggcga tgcacccgtg ggagcgcgac gcgcggctgg cgcaccacgt gctccaccag 300

gcgcacccgg cggccatcgt cgtggagatc gcttgcaccc ggacggcgga ggagctcctc 360

ggcgctcgca aggcgtacca ggcgctgttc caccactccc tcgaggagga cgtcgcctac 420

cgcgccaggg acaagcccta ctgcggcctg ctggtcgggc tggtgagcgc gtaccggtac 480

gagggcccga gggtgagcga ggagacggcg cgcgcggagg cgaaggcgct cgtcgccgcg 540

gtgaagagcg ccggccacgc ggcggcgaag ctggtggaga acgacgacgt cgtcaggatc 600

ctcaccaccc ggagcaagcc gcacctcgtc gagaccttca agcactacaa ggaaatccat 660

ggccgccaca tcgaagagga tcttgggcac gaggagacac tgagggaggc ggcgctgtgc 720

ctggcgacgc cggcgaggta cttcagcgag gtggtggcgg cggcggtgag cgacggcgcc 780

gaccaccacg cgaaggaggc gctgacgcgg gtggcggtga cgcgggcgga cgtggacatg 840

gacgccatcc gcgcggccta ccacgagcag ttcggcggga ggctggagga cgccgtcgcc 900

gggaaggcgc acggctacta cagagacgcg ctcctctcgc tcgtcgccgg cggcaagtga 960

<210> 2

<211> 319

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Asp Glu Ile Gln His Leu Thr Arg Ala Phe Ser Gly Leu Gly

1 5 10 15

Gly Leu Gly Val Asp Glu Pro Ala Met Val Ser Ala Leu Ala Lys Trp

20 25 30

Arg Arg Gln Pro Glu Lys Leu Ser Gly Phe Arg Lys Ser Phe Asn Gly

35 40 45

Phe Phe Lys Asp His Gly Gly Val Ile Glu Lys Cys Glu Glu Glu Tyr

50 55 60

Met Leu His Leu Ala Ala Glu Phe Ser Arg Phe Lys Asn Leu Met Val

65 70 75 80

Met Trp Ala Met His Pro Trp Glu Arg Asp Ala Arg Leu Ala His His

85 90 95

Val Leu His Gln Ala His Pro Ala Ala Ile Val Val Glu Ile Ala Cys

100 105 110

Thr Arg Thr Ala Glu Glu Leu Leu Gly Ala Arg Lys Ala Tyr Gln Ala

115 120 125

Leu Phe His His Ser Leu Glu Glu Asp Val Ala Tyr Arg Ala Arg Asp

130 135 140

Lys Pro Tyr Cys Gly Leu Leu Val Gly Leu Val Ser Ala Tyr Arg Tyr

145 150 155 160

Glu Gly Pro Arg Val Ser Glu Glu Thr Ala Arg Ala Glu Ala Lys Ala

165 170 175

Leu Val Ala Ala Val Lys Ser Ala Gly His Ala Ala Ala Lys Leu Val

180 185 190

Glu Asn Asp Asp Val Val Arg Ile Leu Thr Thr Arg Ser Lys Pro His

195 200 205

Leu Val Glu Thr Phe Lys His Tyr Lys Glu Ile His Gly Arg His Ile

210 215 220

Glu Glu Asp Leu Gly His Glu Glu Thr Leu Arg Glu Ala Ala Leu Cys

225 230 235 240

Leu Ala Thr Pro Ala Arg Tyr Phe Ser Glu Val Val Ala Ala Ala Val

245 250 255

Ser Asp Gly Ala Asp His His Ala Lys Glu Ala Leu Thr Arg Val Ala

260 265 270

Val Thr Arg Ala Asp Val Asp Met Asp Ala Ile Arg Ala Ala Tyr His

275 280 285

Glu Gln Phe Gly Gly Arg Leu Glu Asp Ala Val Ala Gly Lys Ala His

290 295 300

Gly Tyr Tyr Arg Asp Ala Leu Leu Ser Leu Val Ala Gly Gly Lys

305 310 315

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggcaggcag ccggagaagc t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaacagcttc tccggctgcc t 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcttctgcgg gcgatttgtg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctgaactcac cgcgacgtct g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtgtgtgcat ttatgctgct g 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gccattgaag ctcttcctg 19

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcgcaggcag ccggagaagc tcgggtt 27

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcgcaggcag ccggagatcg ggtt 24

Claims

1.一种提高水稻种子休眠性的方法，其特征在于，该方法包括通过CRISPR/Cas9基因编辑系统干扰或敲除所述调控基因OsAnn3，降低或破坏所述调控基因OsAnn3的生物学功能，获得水稻OsAnn3突变体，其中所述调控基因OsAnn3的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括构建种子休眠性调控基因OsAnn3的编辑载体并导入水稻细胞中，筛选后代，获得种子休眠性得到提高的水稻株系。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)所述调控基因OsAnn3的编辑载体构建: 参照CRISPR/Cas9编辑技术，选定靶标序列，构建编辑载体;

2)采用农杆菌介导的遗传转化方法将所述调控基因OsAnn3的编辑载体转入水稻中;

3)培养和筛选所述调控基因OsAnn3基因敲除成功的水稻OsAnn3突变体，繁殖所述水稻OsAnn3突变体的水稻突变体。

4.所述调控基因OsAnn3在提高植物种子休眠性中的应用，其特征在于，所述植物为水稻，其中所述调控基因OsAnn3的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括使所述水稻种子休眠性调控基因OsAnn3失活，从而获得水稻OsAnn3突变体。