CN107460199A

CN107460199A - 水稻粒形调控基因gs9及其应用

Info

Publication number: CN107460199A
Application number: CN201710935680.XA
Authority: CN
Inventors: 刘巧泉; 赵冬生; 李钱峰; 张昌泉
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2017-12-12
Anticipated expiration: 2037-10-10
Also published as: CN107460199B

Abstract

本发明公开了一个水稻粒形调控基因GS9及其应用。该基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，该基因编码蛋白质具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。与野生型相比，GS9基因表达量上升，则籽粒粒长变短、粒宽增加，表现为短圆粒形；而GS9基因不表达，则籽粒粒长变长、粒宽降低，表现为细长粒形。本发明GS9基因能改良水稻粒形，显著减少稻米垩白状况，从而提高稻米外观品质，可在水稻遗传改良中开展应用。

Description

水稻粒形调控基因GS9及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一个水稻粒形调控基因GS9的分离克隆和应用。

背景技术

水稻粒形不仅是产量性状，同时也是稻米重要外观品质性状。籽粒形状，均匀性，透明度是稻米外观品质的重要方面。由于不同文化背景的消费者对籽粒形状偏好不同，总体来说，偏细长粒形的稻米更受大部分消费者的欢迎(Calingacion等2014)。

水稻品种类型丰富，稻米粒形变异也极为复杂。粒形性状以多基因控制为主，属于复杂的数量性状，育种家很难通过传统方法来高效地改良水稻粒形。目前已克隆了多个控制粒形的QTLs，基因效应各异，这可能有利于水稻品种的遗传改良(Xing和Zhang,2010)。例如影响粒长和粒重的基因GS3、GL3.1、GLW7(Fan等2006；Qi等2012；Zhang等2012；Si等2016)，影响粒宽和粒重的基因GW2、GW5/qSW5、GS5、GW8(Song等2007；Shomura等2008；Weng等2008；Li等2011；Wang等2012)，影响粒长、粒宽和粒重的基因GS2、BG1(Hu等2015；Liu等2015)，还有影响粒形和稻米品质，不影响粒重的基因GL7/GW7(Wang等2015)。

尽管已经克隆了许多水稻粒形相关基因，但调控粒形的分子机制，以及粒形调控网络还不清晰，仍然需要进一步挖掘控制粒形的基因，并解析其作用机制。因此，水稻粒形调控基因GS9的克隆和应用，对明确水稻中调控粒形的分子机制和其在育种中的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是分离克隆水稻中一个粒形调控基因GS9，该基因编码一个新的植物特有的未知表达蛋白。

本发明提供了水稻粒形调控基因GS9的应用，利用该基因对水稻籽粒大小及稻米品质的调控，用于改良水稻品种的稻米品质。

本发明提供了一个粒形调控基因GS9，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明所述的粒形调控基因GS9还包括其改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因和衍生物。

本发明同时还提供该基因编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明所述的粒形调控基因GS9编码的蛋白质还包括其改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID No.2所述的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

本发明提供了包含水稻粒形调控基因GS9的质粒。

本发明提供了包含水稻粒形调控基因GS9的植物表达载体。

本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含水稻粒形调控基因GS9。

本发明提供了水稻粒形调控基因GS9的应用，用于改良水稻粒形、稻米品质。具体为：用水稻粒形调控基因GS9转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株；或者利用常规杂交和回交方法将GS9基因导入目标水稻品种中，培育的水稻新品系。

本发明可通过调节植物中GS9基因的表达或活性，调节水稻的籽粒形状，从而改良稻米品质。促进还是抑制GS9的表达活性主要取决于水稻所需改良的形状而定。当需要水稻籽粒细长时，可以通过抑制所述水稻中GS9基因的表达或活性来实现；当需要水稻籽粒短圆时，可以通过提高所述水稻中GS9基因的表达或活性来实现。

增加GS9基因的表达的方法是本领域周知的，包括但不限于：通过强启动子驱动从而增强GS9基因的表达等。抑制GS9基因的表达的方法也是本领域周知的，包括但不限于：通过RNA干扰或基因敲除等实现。

附图说明

图1是日本晴和N138成熟籽粒的表型。

图2是GS9基因的定位图。A为初步定位；B为精细定位；C为区间内存在的候选基因及其基因结构分析。

图3是N138背景表达野生型GS9基因互补实验验证。

图4是日本晴背景过表达GS9基因和CRISPR/Cas9技术靶向敲除GS9基因的转基因植株收获籽粒比较图。

图5是GS9基因在水稻遗传改良中的应用；A-C为近等基因系NIL的主要农艺性状；D-E为近等基因系NIL的稻米外观观察；F-I为近等基因系NIL的稻米外观品质。

图6是一种GS9基因的无义突变形式用于水稻粒形的改良。

具体实施方式

为理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。通过实例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果。

实施例1：GS9基因的定位与克隆

以粳稻品种日本晴为受体亲本，籼稻品种清芦占11为供体亲本(日本晴，清芦占11详见中国作物种质信息网http://icgr.caas.net.cn/)，构建了一套染色体片段替换系，从中发现了一个片段替换系N138，该系表现为籽粒细长(图1)。将N138与日本晴杂交，得到F₁杂合植株，F₁植株表现为正常籽粒。对来源于F₁植株的F₂分离群体进行遗传分析并初定位该目标基因，从F₂群体中随机选取部分植株，发现正常籽粒植株:细长籽粒植株符合3:1的分离比例，表明该片段替换系N138含有一个控制籽粒细长的隐性基因。利用F₃群体中2400个隐性单株，在初定位基础上继续设计分子标记，最终将该目标基因精细定位在分子标记IN0927和IN0929之间约5.9kb的物理范围内，并命名为GS9基因。

我们设计了测序引物NIL(SEQIDNO.3和SEQIDNO.4)，采用PCR的方法分别从日本晴和N138基因组中扩增出该基因，序列比对分析发现在N138中该基因的编码区发生了长片段插入，该变异导致了GS9基因完全不表达，最终出现籽粒细长的表型。该GS9基因编码一个新的植物特有的未知表达蛋白。野生型日本晴中GS9基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质序列为SEQ ID No.2。将N138来源的GS9基因命名为gs9^N138。该gs9^N138基因是在野生型GS9基因编码区的第392位核苷酸位置插入了约7kb的无义的重复片段，是GS9基因的一种无义突变形式。

以野生型日本晴的RNA为模板，合成第一链cDNA，用该GS9基因编码序列5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物(SEQIDNO.5和SEQIDNO.6)，然后将得到的1133bp包含GS9基因全长cDNA的扩增产物连接进克隆载体，并测序验证。确认无误后将该片段用KpnI和EcoRI双酶切，同时也用这两种内切酶对植物双元表达载体pCAMBIA1300(详见www.cambia.org)进行双酶切，再将两个酶切片段连接，得到重组载体p1300-GS9；紧接着以野生型日本晴的基因组DNA为模板，用该GS9基因上游5’和3’端的寡核苷酸作为PCR引物(SEQIDNO.7和SEQIDNO.8)，然后将得到的2283bp包含GS9基因上游启动子区的基因组DNA的扩增产物连接进克隆载体，并测序验证。确认无误后将该片段用HindIII和KpnI双酶切，同时也用这两种内切酶对p1300-GS9载体进行双酶切，再将两个酶切片段连接，得到重组载体p1300-Pro-GS9，把构建好的载体通过电击转入农杆菌菌株中。通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(刘巧泉等，植物生理学报.1998，24:259-271)将重组载体p1300-Pro-GS9导入染色体片段替换系N138，获得转基因植株N138-C。对籽粒进行表型观察，发现转基因植株N138-C的籽粒与对照N138相比变为短圆，而与野生型日本晴籽粒相似，野生型GS9基因回复了N138细长籽粒的表型。据此，判断GS9基因(LOC_Os09g27590基因)就是目的基因。

实施例2GS9基因功能分析

采用实施例1中的重组载体p1300-GS9用HindIII和KpnI双酶切，获得线性化载体片段，再通过PCR扩增获得烟草花椰菜病毒组成型启动子CaMV 35S片段，同样用HindIII和KpnI双酶切后，将PCR产物连接到p1300-GS9载体，获得重组载体p1300-35S-GS9，用相同的水稻遗传转化方法将重组载体p1300-35S-GS9导入日本晴亲本，获得转基因植株OE-1。对籽粒表型进行观察，发现转基因植株OE-1的籽粒与野生型日本晴相比变的更短圆。表明过量表达GS9基因会使籽粒变短圆(图4)。

利用CRISPR/Cas9系统构建GS9基因敲除载体，首先设计并生成gRNA靶序列，在GS9基因的基因组序列上寻找目标序列，并选择特异性序列SEQIDNO.9(GTCCTGGCCTTTCCACGCGATGG下划线TGG为PAM序列)作为识别的靶序列，并按照文献描述方法(Wang等，J Genet Genomics，2015,42:703-706)获得重组载体pC1300-Cas9-GS9。采用实施例1中相同的遗传转化方法将重组载体pC1300-Cas9-GS9导入野生型日本晴，获得水稻GS9基因功能缺失的转基因植株Cas9-1。观察水稻籽粒表型，发现与对照日本晴相比，GS9基因功能缺失突变植株的籽粒粒长变长、粒宽变窄。说明GS9基因功能缺失会使籽粒变细长(图4)。

实施例3gs9^N138基因改良水稻粒形

以含有gs9^N138基因的水稻替换系N138为供体亲本，以日本晴为轮回亲本，进行连续回交选育，用实施例1中的与目标基因gs9^N138及其籽粒细长的目标性状相连锁的分子标记IN0927和IN0929(IN0927-F:SEQIDNO.10，IN0927-R:SEQIDNO.11，IN0929-F:SEQIDNO.12，IN0929-R:SEQIDNO.13)进行辅助选择，构建gs9^N138基因的近等基因系NIL。通过分子标记背景检测(Zhang等，J Genet Genomics.2011，38:603-611)，证明该近等基因系遗传背景与日本晴基本一致，只在目的基因gs9^N138附近含有一个较小的供体片段，片段大小约100Kb，其中含有来自N138的gs9^N138基因。保持植株生长条件一致，观察近等基因系NIL及日本晴的农艺性状表现，结果近等基因系NIL籽粒较日本晴细长，稻米也表现为细长，垩白状况明显改善，同时其他农艺性状没有显著差异。因此认为，N138中的gs9^N138基因可改善稻米外观品质，包括粒形和垩白，同时保持其他农艺性状不变，有特异性改良稻米粒形的潜力，能够用于改良稻米的外观品质(图5)。

实施例4一种GS9基因突变形式可用于改良水稻粒形

以盐稻8号为对照(中国作物种质信息网http://icgr.caas.net.cn/)，其具有和野生型日本晴相同的GS9基因编码序列。采用实施例2中相同的CRISPR/Cas9基因敲除载体pC1300-Cas9-GS9。采用实施例1中相同的遗传转化方法将重组载体pC1300-Cas9-GS9导入盐稻8号，获得水稻GS9基因功能缺失的突变基因gs9^Y8，及其转基因植株Cas9-Y8-1。该gs9^Y8基因特征是在于其在野生型GS9基因编码区的第70位核苷酸位置插入了单碱基A，导致移码突变，是GS9基因的一种无义突变形式。观察水稻籽粒表型，发现与对照盐稻8号相比，Cas9-Y8-1植株的籽粒粒长变长、粒宽变窄。说明GS9基因无义突变会使籽粒变细长，具有改良水稻粒形的效应(图6)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的如干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员从本发明公开的内容之间导出或联想的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 水稻粒形调控基因GS9及其应用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 水稻 Oryza sativa

<400> 1

atggaggcag cagcccaaga aagggagctg cagctgctgc agctgcaggg agtgtcctgg 60

cctttccacg cgatggaggc agcgagaagc agcagctggg acgccaccac cagcagcggc 120

agcagcagcg gcgccagcgg cggcggcggc ggcgattgct tcctgctcgg ttgggagccg 180

ccgttcgccg ccggctgcct cggcgtcctc gccgccgacg tccacggcct cttcccactc 240

tacatggagt cgccgccggc gccgccgcag caggacgcgg tggcattgcc ggaggagctc 300

gacgaccttc tcctgaattt ctgggacgca agcagcgacc agcagcaaca acaacaacag 360

gtcgccttca attccagctg catcctgcag gagaagacga gcagcaccac tgccactgca 420

accaccacca actccaactc caacttcttc tacgacgacg atgatctcct gggctcgatt 480

ttctcgacgg gtcccacatt gccagagaaa ggcgtggcag agccactact cagcagctca 540

tcctccaact gccaggcgga cccacaggtc agtgaggtta gtggggccca gccgcaggcc 600

actccggccg cgccaggtgt cgcgcgggcc ccacctcgct gctcctcctc ctcgtcgctg 660

aagcgcgccg cgccggcgga ggacgcggcg gcggaggcgg agtactgcag acagagcagc 720

agcaagcggc gaagggaggc ggagacgccg acgccggaga agtcggcggc ggcggcggcg 780

gcgccggcgt gcagggtgct gcgcccgttc gcggtgctga agccggacgg gctggacggc 840

ggcgcgacgc tggcggacat caacgcgcgg atcctgatgc ggccgtcgcg gccggtgcgc 900

caccccgtcg gcgagttcgc gtgcgcgccg cgcgtgtcgg cggacaagcc ggggctctcc 960

ggcaaggccg tcgccggctt caccaggctg cacaccccgg gacgcggcac catcaccatc 1020

atacgaacca gaggctag 1038

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> 水稻 Oryza sativa

<400> 2

Met Glu Ala Ala Ala Gln Glu Arg Glu Leu Gln Leu Leu Gln Leu Gln

1 5 10 15

Gly Val Ser Trp Pro Phe His Ala Met Glu Ala Ala Arg Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Asp Ala Thr Thr Ser Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Ser Gly Gly

35 40 45

Gly Gly Gly Asp Cys Phe Leu Leu Gly Trp Glu Pro Pro Phe Ala Ala

50 55 60

Gly Cys Leu Gly Val Leu Ala Ala Asp Val His Gly Leu Phe Pro Leu

65 70 75 80

Tyr Met Glu Ser Pro Pro Ala Pro Pro Gln Gln Asp Ala Val Ala Leu

85 90 95

Pro Glu Glu Leu Asp Asp Leu Leu Leu Asn Phe Trp Asp Ala Ser Ser

100 105 110

Asp Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Val Ala Phe Asn Ser Ser Cys Ile

115 120 125

Leu Gln Glu Lys Thr Ser Ser Thr Thr Ala Thr Ala Thr Thr Thr Asn

130 135 140

Ser Asn Ser Asn Phe Phe Tyr Asp Asp Asp Asp Leu Leu Gly Ser Ile

145 150 155 160

Phe Ser Thr Gly Pro Thr Leu Pro Glu Lys Gly Val Ala Glu Pro Leu

165 170 175

Leu Ser Ser Ser Ser Ser Asn Cys Gln Ala Asp Pro Gln Val Ser Glu

180 185 190

Val Ser Gly Ala Gln Pro Gln Ala Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Ala

195 200 205

Arg Ala Pro Pro Arg Cys Ser Ser Ser Ser Ser Leu Lys Arg Ala Ala

210 215 220

Pro Ala Glu Asp Ala Ala Ala Glu Ala Glu Tyr Cys Arg Gln Ser Ser

225 230 235 240

Ser Lys Arg Arg Arg Glu Ala Glu Thr Pro Thr Pro Glu Lys Ser Ala

245 250 255

Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Cys Arg Val Leu Arg Pro Phe Ala Val

260 265 270

Leu Lys Pro Asp Gly Leu Asp Gly Gly Ala Thr Leu Ala Asp Ile Asn

275 280 285

Ala Arg Ile Leu Met Arg Pro Ser Arg Pro Val Arg His Pro Val Gly

290 295 300

Glu Phe Ala Cys Ala Pro Arg Val Ser Ala Asp Lys Pro Gly Leu Ser

305 310 315 320

Gly Lys Ala Val Ala Gly Phe Thr Arg Leu His Thr Pro Gly Arg Gly

325 330 335

Thr Ile Thr Ile Ile Arg Thr Arg Gly

340 345

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcatcctact cggcaactca ctctg 25

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catcgtcttc gtcttcgtcg tca 23

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtacctcat cctactcggc aactcactct g 31

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaattccatc gtcttcgtct tcgtcgtca 29

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagctttgtc gctctgaacc aggatg 26

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtaccgccg agtaggatga gtgagga 27

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gtcctggcct ttccacgcga 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aatgtcgctc tgaaccagga tg 22

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaggtggcgt tgccgatg 18

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcagtggcgt ggagaac 17

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttcagcaaga aagaccaat 19

Claims

1.一种水稻粒形调控基因GS9，其特征在于该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.一种水稻粒形调控基因GS9的突变体、等位基因或衍生物，其特征在于，是在SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

3.一种水稻粒形调控基因GS9编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

4.一种水稻粒形调控基因GS9编码的蛋白质，，其特征在于，其氨基酸序列是在SEQ IDNo.2所述的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其它物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

5.含有权利要求1或2所述的基因在改良水稻粒形、稻米品质中的应用。

6.含有权利要求3或4所述的粒形调控蛋白GS9在制备转基因植株中的应用。