CN109811076A - 用于鉴定水稻细长粒形的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定水稻粒形的分子标记，本发明还公开了利用上述分子标记鉴定水稻粒形的方法，包括以下步骤：以需要改良粒形的水稻材料与细长粒sg3杂交后的后代作为待测水稻，提取待测水稻的基因组DNA；利用分子标记对水稻基因组DNA进行PCR扩增；当PCR扩增所得的条带与细长粒sg3的带型一致时，判定其为细长粒形；当PCR扩增所得的条带为与需要改良粒形的水稻材料的带型一致时，判定其为非细长粒形；当PCR扩增所得的条带同时出现需要改良粒形水稻的带型和细长粒sg3的带型时，判定其为携带了两个亲本的调控粒型的等位基因。该方法具有检测准确性高，操作简单，成本低廉的特点。

Description

用于鉴定水稻细长粒形的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于基因领域，具体涉及一种改良水稻粒形的分子辅助育种方法。

背景技术

粒形是稻米外观品质的重要组成部分，主要指稻米的粒长、粒宽和粒厚。不同国家、地区消费者对于粒形有各自的喜好，进而决定了水稻的商品价值。同时，粒形也影响着稻米产量。

需要改良的水稻品种为短圆形；不能满足对长粒形有偏好的人群的需求，因此需要对其进行相应粒形改良。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种改良水稻粒形的分子辅助育种方法及所用的分子标记。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于鉴定水稻粒形的分子标记，以水稻作为物种，所述分子标记引物选自下列引物对：

正向引物为：5’-ACGTGTCGCCGTTTAACAAGG-3’；

反向引物为：5’-GGTGGGTTCGGAGGCCATTTG-3’。

本发明还同时提供了利用上述分子标记鉴定水稻粒形的方法，包括以下步骤：

1)、提取待测水稻的基因组DNA；

以需要改良粒形的水稻材料与细长粒sg3杂交后的后代作为待测水稻；

2)、利用分子标记对水稻基因组DNA进行PCR扩增；

3)、当PCR扩增所得的条带与细长粒sg3的带型一致时(即，为aa时)，判定其为细长粒形；

当PCR扩增所得的条带为与需要改良粒形的水稻材料的带型一致时(即，为AA时)，判定其为非细长粒形；

当PCR扩增所得的条带同时出现需要改良粒形水稻的带型和细长粒sg3的带型时(即，为Aa时)，判定其为携带了两个亲本的调控粒型的等位基因，需要在后代分离后进一步PCR扩增，分析带型。

备注说明：sg3的细长粒粒形是隐性遗传，aa为细长粒。

作为本发明的鉴定水稻粒形的方法的改进，步骤2)的PCR扩增反应体系和程序为：

PCR反应体系(10μl)为：DNA模板体积0.5μl，浓度10μM的分子标记的正向引物和反向引物各0.15μl，dNTPs 0.15μl，10×PCR buffer 1μl，Taq酶0.2μl，最后用超纯水定容至10μl；

PCR程序：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec、72℃30sec，30个循环；72℃5min；4℃反应停止。

作为本发明的鉴定水稻粒形的方法的进一步改进：所述需要改良粒形的水稻材料为浙农大104。

备注说明：浙农大104籽粒为短圆形。

在本发明中，细长粒性的籼稻材料突变体sg3，该材料来自于甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理的籼稻浙农41，经过多代连续自交筛选，表型稳定。与野生型浙农41相比，突变体sg3的粒长增加、粒宽减小，但是粒厚没有明显变化，稻米长宽比由2.6左右上升到3.9左右(图1，图2)。该籼稻材料突变体sg3在已经公开的论文《A Novel and Pleiotropic FactorSLENDER GRAIN3 Is Involved in Regulating Grain Size in Rice》(公开日为2018年5月)中有明确告知。

本发明涉及细长粒水稻材料sg3和分子标记Slg1的配套使用，尤其涉及一种检测水稻细长粒基因的分子标记方法。将需要改良粒形的水稻材料与细长粒sg3杂交后构建F₂群体，在群体中的每个植株利用Slg1分子标记进行筛选。检测水稻细长粒的分子标记方法包括水稻植株DNA提取，将提取的DNA模板和特异性分子标记PCR扩增，对PCR反应产物检测判断水稻植株粒形的基因型，细长粒水稻材料sg3和分子标记Slg1配套使用，可检测AA、Aa和aa三种不同的基因型。本发明设计特异性分子标记Slg1，对水稻苗期提取的DNA进行PCR扩增后，根据其PCR产物，检测不同水稻植株的基因型，该方法具有检测准确性高，操作简单，成本低廉的特点。

在本发明中，需要改良粒形的水稻材料与细长粒sg3杂交后，得F1；将F1与需改良粒形的水稻材料进行回交，得F₂，连续回交，用Slg1分子标记筛选，直至获得改良粒形的水稻材料。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为野生型浙农41和突变体sg3的粒形比较图；

A：野生型浙农41的稻米扫描图；

B：突变体sg3的稻米扫描图；

C：粒长对比图；

D：粒宽对比图；

E：粒厚对比图；

*：在0.05水平上差异显著；**：在0.01的水平上差异显著。

图2野生型浙农41与突变体sg3性状比较图；

A：成熟稻米；B：成熟穗子；C：开花期植株；D：精米形状；E：精米横切面；F：粒长；

A和F标尺为1mm，B标尺为2cm，C标尺为10cm，D和E标尺为1mm，F标尺为1cm；

图3利用分子标记Slg1检测水稻植株基因型。母本、sg3和1-29分别代表母本材料、sg3细长粒材料和群体中的1-29个植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、

1、构建杂交群体：

以需要进行粒形改良的水稻材料为母本，细长粒sg3材料为父本，构建杂交群体。

具体为：

需要改良粒形的水稻材料与细长粒sg3杂交后，得F1；将F1与需改良粒形的水稻材料进行回交，得F₂，连续回交，用Slg1分子标记筛选，直至获得改良粒形的水稻材料。

2、选择水稻单株，提取DNA，具体步骤如下：

1)取新鲜的水稻叶片0.5g，把叶片剪碎后，转移到2ml离心管中，并加入65℃预热的CTAB溶液800μl，加入小铁珠后研磨成匀浆。

2)在65℃水浴中处理匀浆35min，在这期间每隔10min充分摇匀离心管一次。

3)水浴完成后在离心管中加入等体积(800μl)的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，充分混匀离心管后，12000r离心10min。

4)取离心后的上清液500μl于1.5ml离心管中，加入450μl异丙醇溶液和50μl的醋酸钠(3mol/L)溶液，并轻轻摇匀，于4℃条件下放置10min，于4℃条件下12000r离心5min。

5)倒掉离心管上清液后加入400μl 75％的乙醇溶液，12000r离心3min，再次弃上清，室温中晾干离心管。

6)在离心管中加入150μl超纯水，得到水稻基因组DNA，并用2％琼脂糖凝胶电泳来检测目的DNA的纯度，于4℃下保存。长时间保存的DNA需放置于-20℃的条件下。

3.通过引物Slg1杂交群体中的植株进行检测，检测水稻粒型的分子标记方法。

1)PCR反应扩增目标片段：PCR反应体系(10μl)为：DNA模板体积0.5μl，浓度10μM的分子标记Slg1的正向引物(5’-ACGTGTCGCCGTTTAACAAGG-3’)和反向引物(5’-GGTGGGTTCGGAGGCCATTTG-3’)各0.15μl，dNTPs 0.15μl，10×PCR buffer 1μl，Taq酶0.2μl，最后用超纯水定容至10μl。PCR克隆需要的程序：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec、72℃30sec，30个循环；72℃5min；4℃反应停止。

2)跑胶及显色：10μl的PCR扩增体系中加入1μl的10×DNA loading buffer(0.2％溴酚蓝，0.2％二甲苯青，200mmol/L EDTA，0.5mol/L EDTA(pH8.0)，0.1％SDS 10％SDS，50％甘油)，并取1μl的混合液进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳约1.5h，接着在水平震荡仪上用0.1％硝酸银溶液处理凝胶10min，再用去离子水漂洗凝胶，最后用包含1.5％NaOH、0.019％碳酸氢钠和0.375％甲醛的显色液处理凝胶5min，直至肉眼可区分的条带结果出现，记录数据并拍照。

4、水稻基因型分型：

凡是与突变体sg3对应的条带大小一致的基因型标记为aa，与母本带型的为AA，杂合基因型则为Aa。在群体筛选过程中，根据特异性分子标记Slg1的带型，检测显性基因A和隐性基因a的存在与否。

即，当PCR扩增所得的条带为aa时(即，与细长粒sg3的带形一致时)，判定其为细长粒形；当PCR扩增所得的条带为AA时(需要改良粒形的水稻材料的带型一致时)，判定其为非细长粒形；当PCR扩增所得的条带为Aa时(即，同时出现要改良粒形水稻的带型和细长粒sg3的带型时)，判定其为判定其为携带了两个亲本的调控粒型的基因，需要在后代分离后进一步PCR扩增，分析带型。

因此，上述扩增出来条带为aa时对应水稻籽粒为“细长粒形”。

实验1、需要进行粒形改良的水稻材料为浙农大104(浙农大104籽粒为短圆形)，按照上述实施例1所述方法进行检测，

将收获的F₂随机选择29个植株进行检测，分别获得以下3种类型：

条带为aa(即，与细长粒sg3的带形一致)；

条带为AA(即，与日本晴的带型一致)；

条带为Aa(即，同时出现日本晴的带型和细长粒sg3的带型)。

如图3所述，1～29中，

“4、15、18”为aa，“6、7、9、13、17、19、22、24、25、26”为AA，其余为Aa。

将上述条带为aa或AA的水稻材料按照常规方式进行种植，所得结果如下：

条带为aa的水稻材料，所得籽粒均为细长粒；

条带为AA的水稻材料，所得籽粒均为短圆粒。

检测数据如下：

表1

	粒长	粒宽
			细长粒sg3	10.13±0.10	2.60±0.14
浙农大104	8.25±0.11	3.85±0.12
			条带为AA	8.65±0.10	3.80±0.10
条带为aa	10.10±0.14	2.68±0.13

实验2、将实验1中的F₂换成F₅，其余等同于实验1。所得结果为：

条带为aa的水稻材料，所得籽粒均为细长粒；

条带为AA的水稻材料，所得籽粒均为短圆粒。

对比例1、将分子标记引物改成为RM545，引物序列如下：

正向引物为：5’-CAATGGCAGAGACCCAAAAG-3’

反向引物为：5’-CTGGCATGTAACGACAGTGG-3’。

其余等同于实施例1和实验1。

条带aa的40个水稻材料，其中5个水稻材料最终种植所得的籽粒为短圆粒，因此正确率仅为87.5％。

对比例2、将分子标记引物改成为R3M23，引物序列如下：

正向引物为：5’-TGCTTACAAGGGTCCAAT--3’

反向引物为：5’-GGAGGTGCCTACCAAGAG-3’。

其余等同于实施例1和实验1。

条带aa的40个水稻材料，其中2个水稻材料最终种植所得的籽粒为短圆粒，因此正确率仅为95％。

对比例3、将分子标记引物改成为RM130，引物序列如下：

正向引物为：5’-TGTTGCTTGCCCTCACGCGAAG-3’

反向引物为：5’-GGTCGCGTGCTTGGTTTGGTTC-3’。

其余等同于实施例1和实验1。

条带aa的40个水稻材料，其中3个水稻材料最终种植所得的籽粒为短圆粒，因此正确率仅为92.5％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 用于鉴定水稻细长粒形的分子标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgtgtcgcc gtttaacaag g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtgggttcg gaggccattt g 21

Claims (4)

1.用于鉴定水稻粒形的分子标记，以水稻作为物种，其特征是：所述分子标记引物选自下列引物对：

正向引物为：5’-ACGTGTCGCCGTTTAACAAGG-3’；

反向引物为：5’-GGTGGGTTCGGAGGCCATTTG-3’。

2.利用如权利要求1所述的分子标记鉴定水稻粒形的方法，其特征是包括以下步骤：

1)、提取待测水稻的基因组DNA；

以需要改良粒形的水稻材料与细长粒sg3杂交后的后代作为待测水稻；

2)、利用分子标记对水稻基因组DNA进行PCR扩增；

3)、当PCR扩增所得的条带与细长粒sg3的带型一致时，判定其为细长粒形；

当PCR扩增所得的条带为与需要改良粒形的水稻材料的带型一致时，判定其为非细长粒形；

当PCR扩增所得的条带同时出现需要改良粒形水稻的带型和细长粒sg3的带型时，判定其为携带了两个亲本的调控粒型的等位基因。

3.根据权利要求2所述的鉴定水稻粒形的方法，其特征是步骤2)的PCR扩增反应体系和程序为：

PCR反应体系为：DNA模板体积0.5μl，浓度10μM的分子标记的正向引物和反向引物各0.15μl，dNTPs 0.15μl，10×PCR buffer 1μl，Taq酶0.2μl，最后用超纯水定容至10μl；

PCR程序：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec、72℃30sec，30个循环；72℃5min；4℃反应停止。

4.根据权利要求2或3所述的鉴定水稻粒形的方法，其特征是：

所述需要改良粒形的水稻材料包括浙农大104。