CN112899390B

CN112899390B - 一种番茄节间长短早期鉴定的scar标记及鉴定方法

Info

Publication number: CN112899390B
Application number: CN202110137268.XA
Authority: CN
Inventors: 杨欢欢; 姜景彬; 王特; 许向阳; 张萍; 李景富; 赵婷婷; 张贺
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN112899390A

Abstract

本发明属于植物分子标记技术领域，特别是涉及一种番茄节间长短早期鉴定的SCAR标记及鉴定方法。本发明公开了番茄节间长短早期鉴定的SCAR标记TTHH‑F0R0，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明还进一步提供了所述SCAR标记的扩增引物对以及番茄节间长短早期鉴定的方法。本发明鉴定得到一个与番茄节间长短紧密连锁的SCAR标记。采用该标记进行鉴定不需要经番茄株型稳定时期，在苗期就可以准确快速的鉴定出番茄节间长短的株型情况,可大大加快番茄优异株型品种的选育进程。本发明SCAR标记引物不需要酶切，只需要PCR一步法检测，检测成本低、准确率较高等优点，可较好的用于番茄节间株型分子标记辅助选择育种。

Description

一种番茄节间长短早期鉴定的SCAR标记及鉴定方法

技术领域

本发明属于植物分子标记技术领域，特别是涉及一种番茄节间长短早期鉴定的SCAR标记及鉴定方法。

背景技术

广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。SCAR标记是通常是由RAPD、SRAP、SSR标记转化而来的一种分子标记。由于其不需要酶切，省钱省时，结果稳定性好，可重复性强，已成为分子标记辅助选择育种的首选标记。番茄属于茄科，番茄属，已成为世界性蔬菜作物之一，然而在番茄育种过程中可用的分子标记较少，仍以传统选择育种为主，效率较低，难以快速获得满足市场需求的新品种。番茄短节间品种其株型疏松，夹角大，单位面积种植数量少，而且侧枝易相互遮阴引发病虫害。番茄长节间品种，其株型紧凑，夹角小，可以提高单位面积种植数量，通风透光效果良好，极大的促进果实产量和品质的提高(图1A)。因此，番茄节间长短早期鉴定在生产上具有重要的实际应用价值。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种分子标记，用于番茄节间长短的早期鉴定。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明的技术方案是一种番茄节间长短早期鉴定的SCAR标记TTHH-F0R0，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了所述SCAR标记的扩增引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了所述SCAR标记在番茄节间长短早期鉴定中的应用。

本发明还提供了所述SCAR标记的扩增引物对在番茄节间长短早期鉴定中的应用。

本发明还提供了番茄节间长短早期鉴定的方法，包括如下步骤：提取待测番茄的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸为引物，进行PCR扩增；将扩增产物进行鉴定，产物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的为长节间番茄品种，产物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的为短节间番茄品种。

进一步的，采番茄叶片提取基因组DNA。

具体的，PCR扩增的反应体系为：10μL 2×Mix Master，1μL DNA模板，上、下游引物各1μL，7μL ddH₂O。

具体的，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火40s；72℃延伸50s；循环35次；72℃延伸10min；结束反应，扩增产物置于冰箱4℃保存。

本发明的有益效果：本发明鉴定得到一个与番茄节间长短紧密连锁的SCAR标记。采用该标记进行鉴定不需要经番茄株型稳定时期，在苗期就可以准确快速的鉴定出番茄节间长短的株型情况,可大大加快番茄优异株型品种的选育进程。本发明SCAR标记引物不需要酶切，只需要PCR一步法检测，检测成本低、准确率较高等优点，可较好的用于番茄节间株型分子标记辅助选择育种。并进一步基于该SCAR标记提供了番茄节间长短早期鉴定的方法，通过提取番茄叶片、茎、根等植株中任意可取材的器官或组织的DNA，然后通过PCR的方法准确地对番茄节间长短进行鉴定，该发明提供的技术准确性可以达到100％，低至10mg的番茄新鲜组织就可以达到鉴定要求，不影响番茄的生长发育，而且取材的时间不受限制。

附图说明

图1、番茄品种16615(节间正常野生型)和16578(节间长突变体)的表型变异比较；A为番茄品种16615(节间正常野生型)和16578(节间长突变体)的田间株型表现；B为番茄品种16615)和突变体16578从第一个节间到第五个节间的比较；C为番茄品种16615)和突变体16578第一个节间到第五个节间长度的统计。

图2、SCAR标记THH-F0R0在节间长亲本P₁(16578)，短节间P₂(16615)，F₁，F₂群体中的扩增情况；样品是F2群体，1-23号。

图3、SCAR标记THH-F0R0标记在节间长、短之间的扩增情况。

具体实施方式

本发明中PCR扩增酶Mix Master,琼脂购买与Genstar公司提供。

实施例1SCAR标记的获得

利用野生型番茄16615和长节间田间自然突变体16578为材料，构建P₁、P₂、F₁和F₂四世代群体，利用亲本重测序结合F₂群体分离群体分组分析法(Bulked SegregantAnalysis,BSA)进一步筛选候选区间。具体操作是如下：选择亲本亲本P₁、P₂各一株，F₂极端混池各25株，进行DNA提取；进行文库构建及测序，BGISEQ平台全基因组重测序由深圳华大公司完成；进一步生物信息分析，将过滤后的reads与参考基因组进行比对。NCBI:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv/browser/genome/？id＝GCF_000188115.4作为参考基因组。通过生物信息分析，过滤掉不合格的数据，获取高质量的有效数据。最后进行SNP标记检测及开发，利用华大分析软件GATK检测SNPs和InDels，并对其进行注释和统计SNP信息，明确同义突变和非同义突变的SNP数量。最终通过BSA关联分析筛选得到番茄九号染色体19-21cM的候选区间，发现在目标区域突变体(节间长)Solyc09g020000基因的内含子有42bp片段的缺失。根据这一突变，在其前后设计引物进行扩增，最后得到了稳定连锁的分子标记THH-F0R0。上游引物THH-F0R0-F：aacccaagggaacatgcgaa(SEQ ID No.3)。下游引物THH-F0R0-R：tggacgacttgagccacatc(SEQ ID No.4)。PCR扩增的反应体系为：10μL 2×MixMaster，1μL DNA模板，上、下游引物各1μL，7μL ddH₂O。PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火40s；72℃延伸50s；循环35次；72℃延伸10min。用0.1％的琼脂糖电泳进行检测标记带型。

经测序，长节间植株特异条带的DNA序列(SEQ ID No.1)为：

atgagaaagaagaacatcacttataaaggcgatggatgttttggctcaaagtccaatgttatttctacatttcatatttggtacaaggagaaccatccagctagtcatatgatattttgaaagttttttttgcattctgacacttggtatcttgagaaagacctaacttactcacttagaagcacttaagtagaaacaattagaaaattccccttttgacttcgcatgttcccttggg

短节间植株特异条带DNA序列(SEQ ID No.2)为：

atgcatttggatgagaaagaagaacatcacttataaaggcgatggatgttttggctcaaagtccaatgttatttctacatttcatatttggtacaaggagaaccatccagctagtcatataatattttgagagtttttttgcattctgacactttgtatcttgagaaagacctacaatacctgaaatttgttgtacccagtccagaactaaatgacactttactcacttagaagcacttaagtagaaacaattagaaaattccccttttgacttcgcatgttcccttggg

根据THH-F0R0标记序列，进一步设计了扩增引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

上游引物：AACCCAAGGGAACATGCGAA(SEQ ID No.3)。

下游引物：TGGACGACTTGAGCCACATC(SEQ ID No.4)。

实施例2THH-F0R0标记的应用

通过亲本节间长亲本P1(16578)和短节间P2(16615)杂交获得F₁，F₁自交获得F₂群体。利用所述SCAR标记引物组对210份F₂分离群体进行节间长度鉴定。具体方法如下：首先利用CTAB法提取带鉴定番茄的叶片DNA；以叶片DNA为模板、以实施例中引物对进行扩增。PCR扩增的反应体系为：10μL 2×Mix Master，1μL DNA模板，上、下游引物各1μL，7μLddH₂O。PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火40s；72℃延伸50s；循环35次；72℃延伸10min；结束反应，扩增产物置于冰箱4℃保存。然后对扩增产物进行鉴定。

结果显示，分子鉴定和田间表型鉴定吻合率为100％，部分检测结果见图2。如图2所示：长节间番茄亲本P₁以及F₂群体均能扩增出一条324bp的特异条带，而短节间番茄亲本P₂以及F₂群体扩增出366bp特异条带，杂合F₁番茄植株可同时扩增出324bp和366bp两种带型。同时，对10株节间长、10份节间短的番茄材料进行分子标记鉴定，结果表明10株番茄长节间植株均能扩增出一条324bp的特异条带，而10株短节间植株扩增出366bp特异条带，由此可鉴定番茄长节间植株和短节间植株(图3)。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种番茄节间长短早期鉴定的SCAR标记及鉴定方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 238

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagaaaga agaacatcac ttataaaggc gatggatgtt ttggctcaaa gtccaatgtt 60

atttctacat ttcatatttg gtacaaggag aaccatccag ctagtcatat gatattttga 120

aagttttttt tgcattctga cacttggtat cttgagaaag acctaactta ctcacttaga 180

agcacttaag tagaaacaat tagaaaattc cccttttgac ttcgcatgtt cccttggg 238

<210> 2

<211> 290

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcatttgg atgagaaaga agaacatcac ttataaaggc gatggatgtt ttggctcaaa 60

gtccaatgtt atttctacat ttcatatttg gtacaaggag aaccatccag ctagtcatat 120

aatattttga gagttttttt gcattctgac actttgtatc ttgagaaaga cctacaatac 180

ctgaaatttg ttgtacccag tccagaacta aatgacactt tactcactta gaagcactta 240

agtagaaaca attagaaaat tccccttttg acttcgcatg ttcccttggg 290

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacccaaggg aacatgcgaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggacgactt gagccacatc 20

Claims

1.一种番茄节间长短早期鉴定的SCAR标记TTHH-F0R0，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述SCAR标记在番茄节间长短早期鉴定中的应用。

3.番茄节间长短早期鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待测番茄的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸为引物，进行PCR扩增；将扩增产物进行鉴定，产物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的为长节间番茄品种，产物核苷酸序列如SEQID No.2所示的为短节间番茄品种。

4.如权利要求3所述番茄节间长短早期鉴定的方法，其特征在于，采番茄叶片提取基因组DNA。

5.如权利要求4所述番茄节间长短早期鉴定的方法，其特征在于，PCR扩增的反应体系为：10µL 2×Mix Master，1µL DNA模板，上、下游引物各1µL，7µL ddH₂O。