CN110305978B - 一种与辣椒果实朝向紧密关联的snp位点及其通用性分子标记、获取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明利用基因组重测序数据和全基因组关联分析(GWAS)获得与果实朝向高度关联的单核苷酸多态性(SNP)位点，同时利用果实朝向性状的F2分离群体，通过构建朝向表型的两个极端混池，结合对混池进行RNA测序(BSR)，获得与辣椒果实朝向性状紧密连锁的SNP位点，利用两种策略获得的分子标记对朝向性状进行精细定位，开发得到1个紧密连锁的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记CaUP12。利用CaUP12对辣椒种质资源进行鉴定，其准确率达到95.6％，利用CaUP12对F2分离群体进行鉴定，准确率达到100％。因此，本发明为辣椒果实朝向控制基因的克隆和辣椒育种提供了紧密关联的分子标记，具有重要的应用价值。

Description

一种与辣椒果实朝向紧密关联的SNP位点及其通用性分子标 记、获取方法和应用

技术领域

本发明属于辣椒遗传育种和分子生物学领域，具体涉及一种与辣椒果实朝向紧密关联的SNP位点及其通用性分子标记、获取方法和应用。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L.)，又名番椒、海椒和辣茄等，属于茄科辣椒属一年生或多年生植物，是一类重要的蔬菜作物，在全球范围内广泛种植。研究证据表明，辣椒起源于南美洲，大约于明朝后期(16世纪)传入我国。辣椒作为一种蔬菜，含有丰富的维生素C、E，矿物质和类胡萝卜素等营养物质，具有很高的食用价值。同时，辣椒果实含有独特的辣椒素类物质，有抗炎症和抗氧化作用，因辣椒有辣味，能促进肾上腺素分泌，提高新陈代谢，兼具很好的药用价值。辣椒果实具有丰富的变异，特别是果实大小、形状、颜色，具有很好的基础研究价值。辣椒已经成为一种世界范围内的重要经济作物，我国鲜椒产量约占全球的一半。辣椒已成为解决就业、农业增效、农民增收、改善人民生活的重要蔬菜作物。

我国辣椒遗传育种工作自20世纪60年代起，经过几十年的发展和积累，在资源收集与评价、性状遗传与分析、种质资源创新和新品种选育等方面取得了显著成绩。但是，我国当前辣椒育种仍以传统育种方式为主，现代化的分子育种水平还比较低。近年来，辣椒全基因组学研究取得重要进展，特别是Zunla和CM334全基因组草图的公布，为辣椒分子标记的开发及其在遗传育种中的应用奠定了坚实基础。同时，我国辣椒的基础研究还很薄弱,与同属茄科的番茄和马铃薯相比，辣椒的基础研究还当相当落后，有很大的努力空间。

辣椒是在美洲地区最早被人工驯化的作物之一。野生的辣椒一般表现为朝天、红色、小果类型，有助于借助鸟类传播辣椒种子。经过长期的人工驯化栽培，如今，辣椒果实在颜色、大小和辣味等方面存在丰富的多样性。辣椒果实的朝向被认为是辣椒在驯化过程中的关键性状之一。在已知的5个辣椒栽培种中，除了C.frutescens基本仍表现为朝天类型之外，其他4个栽培种，即C.annuum、C.chinense Jacq、C.baccatum和C.pubescens Ruiz&Pav均出现了果实朝下的变异。这种转变可能与果实增大和生物(如鸟类啄食)或非生物(如阳光暴晒)的胁迫有关。辣椒果实朝向同时也影响机械化辅助采摘技术的应用，果实朝上的辣椒品种将更适于机械化辅助采摘技术。因此，研究辣椒果实朝向不仅对于理解辣椒的人工驯化具有重要理论意义，也对辣椒高效生产具有实际意义。

目前辣椒育种主要采用常规手段。传统的育种手段存在耗时、费力、准确性差、易受环境因素影响等弊端。而基于分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)技术的分子标记辅助育种，利用分子标记与目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记，即可检测到目的基因的存在，达到选择目标性状的目的，具有早期、快速、准确、不受环境条件干扰的优点。

SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)技术，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP，其数量多、多态性丰富、适于快速、自动化分析。SNP的检测方法有多种，但是由于技术难度高、成本费用高，阻碍了其应用。酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS)是一类以PCR为基础的共显性的分子标记，它的基本原理是先用已知SNP位点的DNA序列去设计一套特异性的PCR引物(19～27bp)。然后应用这些引物去扩增该位点上的某一DNA片段；接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得的扩增带并进行RFLP分析。CAPS标记的应用降低了SNP位点检测成本和难度。自1993年Konieczny和Ausubel在拟南芥上发展的CAPS标记以来，因具有共显性、位点特异性、操作简单、成本低、所需DNA样品量少和对DNA的纯度要求不高等优点成为现代生物学研究的一个非常重要的分子标记技术，在种质鉴定、辅助育种、基因鉴定和图谱构建等领域得到相当广泛的应用。

研究表明，辣椒果实的朝下相对于果实朝上为显性性状。在辣椒遗传和育种研究中，果实朝向常常被用作一个形态学标记，但有关该性状变异的分子遗传机理研究还比较少。辣椒朝向受遗传位点up控制，位于第12染色体，以往的研究也开发了一些与up位点连锁的分子标记，如A2C7₄₆₉(2006年)和upCAPS(2008年)，但也由于技术手段等原因，标记距离目标基因的距离还很远，分别为1.7cM(遗传距离单位，厘摩尔)和4.3cM。针对辣椒的朝向，也有相关的QTL研究(2016)，获得与朝向相关的6个QTL，最主效的QTL依然位于12染色体。最近的一个研究(2016)将up定位到了4.52M的物理区间。上述研究均是针对特定的材料，所开发的标记往往不具有通用性。目前尚没有利用规模化辣椒种质基因组重测序的报道，也没有利用全基因组关联分析和分离群体连锁定位开发与辣椒朝向紧密关联的分子标记的报道。

发明内容

为了克服现有技术缺陷，解决上述技术问题，本发明提供了一种与辣椒果实朝向紧密关联的SNP位点及其通用性分子标记、获取方法和应用。目前辣椒上具有通用性的分子标记还很少，申请人首次发明了可用于辣椒果实朝向鉴定的通用性分子标记。利用该标记可以有效区分当前辣椒资源中的果实朝向，可结合常规育种手段培育高效生产的辣椒新品种。同时，该发明也为解析辣椒的人工驯化过程，克隆辣椒果实朝向基因，进而解析辣椒果实朝向分子机理奠定了重要基础。

为了实现本发明上述第一个目的，本发明提供了一种与辣椒果实朝向紧密关联的SNP位点，所述的SNP位点对应于“遵辣1号”参考基因组2.0版本第12号染色体的第37458043位碱基，该位点能够转化为CAPS标记。

本发明还提供了一种与辣椒果实朝向紧密关联的通用性分子标记CaUP12，所述分子标记是根据上述SNP位点设计的基因分型引物转化而来。

进一步地，上述技术方案中所述的引物包含正向引物CaUP12-F和反向引物CaUP12-R，正反向引物分别如下：

正向引物CaUP12-F:5′-CCAAGTCCCTAGATGGTGGTG-3′，(SEQ ID NO.1)；

反向引物CaUP12-R:5′-TGCACAAGGACGTAGGTGTC-3′，(SEQ ID NO.2)。

本发明的另一目的在于提供上述所述的与辣椒果实朝向紧密关联的通用性分子标记CaUP12的获取方法，所述方法包括如下步骤：

(a)全基因组关联分析(GWAS)法：

1)种植管理超过300份辣椒材料的自然群体，并保存各个植株的叶片样品；

2)在辣椒植株果实绿熟期调查每份材料的果实朝向表型，每份材料至少调查5个单株，每个单株至少调查3个果实；

3)利用CTAB法分别提取所有辣椒材料的DNA，构建高通量测序文库并利用HiSeq4000(Illumina公司)进行测序分析，每份材料数据量为35G；

4)生物信息学和全基因组关联分析：使用bwa软件把每个样本的测序片段比对到于“遵辣1号”参考基因组2.0版本，比对之后使用软件samtools以及bcftools进行变异鉴定，对变异位点质量进行过滤后，获得全基因组SNP矩阵并转换为bed文件，使用EMMAX在栽培辣椒中(C.annuum)进行全基因组关联分析；

(b)BSR方法

1)以果实朝下材料YJ11为母本，果实朝上材料XJ10-12为父本杂交获得F₁，F₁自交获得F₂群体；

2)种植F₂群体，在辣椒植株果实绿熟期调查F₂每个单株的果实朝向表型，每株至少调查3个果实；

3)在F₂群体中，分别取30株果实朝上和30株果实朝下的植株的叶片，等量混合后提取RNA，构建高通量测序文库并利用HiSeq2500(Illumina公司)进行测序分析；

4)测试得到的读段序列通过Hisat2比对于“遵辣1号”参考基因组2.0版本，获得的数据利用samtools软件以及自主开发的Perl脚本提取SNP，计算两个混池中各SNP的基因型频率(SNP-index)，并且计算每个SNP位点的欧几里得距离(ED值)，过滤掉两池测序深度都低于10个reads以及SNP-index均大于0.7的SNP位点，最后对ED值取幂次方后进行线性回归拟合，以所有位点幂次方拟合值的中位值及标准差之和的3倍作为阈值线，高于阈值线的区段作为候选区间，进一步通过亲本间的基因组差异开发标记筛选重组单株，将辣椒果实朝向基因锁定到400kb的区间内；

通过比对GWAS关联和连锁定位的区间，发现结果一致，结合二者的结果，筛选到位于“遵辣1号”参考基因组2.0版本第12号染色体第37458043位碱基的SNP，结合该SNP上下游序列，利用Primer Premier 5.0设计正反向引物，并将其转化为CAPS标记。

进一步地，上述技术方案中提供的与该基因组区段序列匹配且目标为测该SNP变异的引物为优选方案，例如下述正反向引物：

CaUP12-F:5′-CCAAGTCCCTAGATGGTGGTG-3′；

CaUP12-R:5′-TGCACAAGGACGTAGGTGTC-3′。

本发明的还一目的在于提供上述所述的通用性分子标记CaUP12的应用，其应用于鉴定辣椒果实朝向。

进一步地，上述技术方案中所述的鉴定方法具体包括如下步骤：

(1)以辣椒基因组DNA为模板，采用分子标记CaUP12进行PCR扩增，其正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；

(2)对PCR产物进行PCR-RFLP限制酶(MspI)切扩增产物，并利用1％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行凝胶电泳；

(3)检测PCR-RFLP反应PCR扩增产物，如果出现2个特异条带，且2个条带大小分别为445bp、222bp时，可判断辣椒材料为纯合的果实朝上材料；如果只出现1个特异条带，且条带大小为667bp时，可判断所测试辣椒材料为纯合的果实朝下材料；如果同时出现三个条带，且3个条带大小分别为667bp、445bp和222bp时，则可判断所测试辣椒材料为杂合的果实朝下的材料。

进一步地，上述技术方案中所述的PCR扩增反应体系，按总体积为20μl计，包括如下各组分：

进一步地，上述技术方案中所述的PCR扩增反应条件为：95.0℃预变性3min；95.0℃变性30s，56.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，设置循环，跳至95℃，30s，循环32次；72.0℃延伸5min，4℃保存。

进一步地，上述技术方案中所述的酶切体系如下：

与现有技术相比，本发明涉及的一种与辣椒果实朝向紧密关联的SNP位点及其通用性分子标记、获取方法和应用具有以下优点和显著的进步：

(1)本发明对300多份辣椒材料进行果实朝向表型鉴定，利用基因组重测序数据和全基因组关联分析(GWAS)获得与果实朝向高度关联的单核苷酸多态性(SNP)位点；同时利用果实朝向性状的F₂分离群体，通过构建朝向表型的两个极端混池，结合对混池进行RNA测序(BSR)，获得与辣椒果实朝向性状紧密连锁的SNP位点。利用通过两种策略获得的分子标记对朝向性状进行精细定位，最终开发得到1个紧密连锁的酶切扩增多态性序列(CAPS)标记CaUP12；本发明利用CaUP12对辣椒种质资源进行鉴定，其准确率达到95.6％，利用CaUP12对F₂分离群体进行鉴定，准确率达到100％。因此，本发明为辣椒果实朝向控制基因的克隆和辣椒育种提供了紧密关联的分子标记，具有重要的应用价值。

(2)本发明有效解决了常规育种方法中存在的相关弊端，包括不能在苗期就判断果实朝向，不能有效区分杂合材料和纯合材料，有时候判断受到环境影响。利用本发明的分子标记CaUP12可以在苗期即可准确高效地进行辣椒果实朝向鉴定，进行选择，从而有效减少育种材料的种植规模，减轻后期田间表型鉴定的工作量，加快育种进程，提高育种效率。更为重要的是，该分子标记为通用性的分子标记，受遗传材料的限制小，应用面广泛。

附图说明

图1为本发明实施例1的辣椒果实朝向的GWAS关联结果图，其中12染色体上的峰为朝向性状的关联位置；

图2为本发明实施例1的辣椒F₂群体BSR分析结果图，其中12染色体上的峰为朝向性状控制基因所在的区段；

图3为本发明实施例2和实施例3中CaUP12标记扩增不同类型辣椒的带型，其中D代表纯合的果实朝下材料的带型，U代表纯合的果实朝上材料的带型，D/U代表杂合的果实朝下材料的带型，M表示分子量标记。

具体实施方式

下面对本发明的实施案例作详细说明。本实施案例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例，在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

实施例1：

本实施例提供了一种与辣椒果实朝向紧密关联的SNP位点，所述的SNP位点对应于“遵辣1号”参考基因组2.0版本第12号染色体的第37458043位碱基，该位点能够转化为CAPS标记。

本实施例还提供了一种与辣椒果实朝向紧密关联的通用性分子标记CaUP12，所述分子标记是根据上述SNP位点设计的基因分型引物转化而来。

上述所述的引物包含正向引物CaUP12-F和反向引物CaUP12-R，正反向引物分别如下：

正向引物CaUP12-F:5′-CCAAGTCCCTAGATGGTGGTG-3′，(SEQ ID NO.1)；

反向引物CaUP12-R:5′-TGCACAAGGACGTAGGTGTC-3′，(SEQ ID NO.2)。

上述所述的与辣椒果实朝向紧密关联的通用性分子标记CaUP12，采用如下方法获得，所述方法包括如下步骤：

(a)全基因组关联分析(GWAS)法：

1)种植管理超过300份辣椒材料的自然群体，并保存各个植株的叶片样品；

2)在辣椒植株果实绿熟期调查每份材料的果实朝向表型，每份材料至少调查5个单株，每个单株至少调查3个果实；

3)利用CTAB法分别提取所有辣椒材料的DNA，构建高通量测序文库并利用HiSeq4000(Illumina公司)进行测序分析，每份材料数据量为35G；

4)生物信息学和全基因组关联分析：使用bwa软件把每个样本的测序片段比对到辣椒参考基因组(Zunla)，比对之后使用软件samtools以及bcftools进行变异鉴定。对变异位点质量进行过滤后，获得全基因组SNP矩阵并转换为bed文件，使用EMMAX在栽培辣椒中(C.annuum)进行全基因组关联分析，图1为本实施例的辣椒果实朝向的GWAS关联结果图，其中12染色体上的峰为朝向性状的关联位置；

(b)BSR方法

1)以果实朝下材料YJ11为母本，果实朝上材料XJ10-12为父本杂交获得F₁，F₁自交获得F₂群体；

2)种植F₂群体，在辣椒植株果实绿熟期调查F₂每个单株的果实朝向表型，每株至少调查3个果实；

3)在F₂群体中，分别取30株果实朝上和30株果实朝下的植株的叶片，等量混合后提取RNA，构建高通量测序文库并利用HiSeq2500(Illumina公司)进行测序分析；

4)测试得到的读段序列通过Hisat2比对辣椒参考基因组(Zunla)，获得的数据利用samtools软件以及自主开发的Perl脚本提取SNP，计算两个混池中各SNP的基因型频率(SNP-index)，并且计算每个SNP位点的欧几里得距离(ED值)。过滤掉两池测序深度都低于10个reads以及SNP-index均大于0.7的SNP位点，最后对ED值取幂次方后进行线性回归拟合，以所有位点幂次方拟合值的中位值及标准差之和的3倍作为阈值线，高于阈值线的区段作为候选区间，图2为本实施例的辣椒F₂群体BSR分析结果图，其中12染色体上的峰为朝向性状控制基因所在的区段；进一步通过亲本间的基因组差异开发标记筛选重组单株，将辣椒果实朝向基因锁定到400kb的区间内；

通过比对GWAS关联和连锁定位的区间，发现结果一致，结合二者的结果，筛选到位于“遵辣1号”参考基因组2.0版本第12号染色体第37458043位碱基的SNP，结合该SNP上下游序列，利用Primer Premier 5.0设计正反向引物，并将其转化为CAPS标记，命名为CaUP12。

实施例2：

本实施例提供上述实施例1的辣椒果实朝向分子标记CaUP12在自然群体中的应用。

本实施例利用获得的果实朝向分子标记引物，对113份GWAS辣椒材料进行基因型鉴定，并通过鉴定结果预测果实朝向表型，其步骤如下：

(1)以辣椒基因组DNA为模板，浓度为80-150ng/μl；采用分子标记CaUP12进行PCR扩增，其正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2。PC R反应体系总体积为20μl，具体成分如下：ddH₂O 15.6μl，10×PCR Buffer 2.0μl，d NTPs(10mM)0.4μl，TaqDNA聚合酶0.2μl(5U/μl)，正向引物(10mM)0.4μl，反向引物(10 10mM)0.4μl以及1.0μl DNA模板；

(2)PCR反应在美国Bio-Rad公司生产的S1000型PCR仪上进行。PCR扩增程序如下：95.0℃预变性3min；95.0℃变性30s，56.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，设置循环，跳至95℃，30s，循环32次；72.0℃延伸5min，4℃保存；

(3)扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，均扩增出667bp的条带；

(4)对扩增出的667bp条带用MspI(Thermo Scientific，10U/μl)进行酶切。按照说明书配制酶切体系如下：PCR反应产物10μl，ddH₂O 18μl，10×Buffer Tango 2μl，MspI 1μl。置于37℃酶切4h；

(5)酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，若667bp条带未被酶切或者不能被完全酶切则判定该辣椒材料果实朝下；若667bp条带被完全酶切为445bp和222bp两条带，则判定该材料果实朝上；

(6)鉴定结果如表1，根据这批材料辣椒朝向的果实表型进行回验，发现该标记的准确率达95.6％(表1)。

上述鉴定结果表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，可以在幼苗期即可预测相关材料的果实朝向表型，可以根据结果选择目标材料，减少后期的辣椒种植规模，提高育种效率，加速育种进程。

表1辣椒果实朝向分子标记CaUP12在辣椒自然群体中的应用

注：UP代表果实朝上，DOWN代表果实朝下。

实施例3：

本实施例提供上述实施例1的辣椒果实朝向分子标记CaUP12在分离群体中的应用。

本实施例利用获得的果实朝向分子标记引物，对YJ11为母本(果实朝下)、XJ10-12为父本(果实朝上)的F₂代分离群体中进行标记检测，然后分别挑选经过分子标记分析判断为果实朝上和朝下的植株各25株并对果实朝向表型进行调查，标记分析的具体步骤同实施例2，统计结果见表2，其准确率达100％。

表2辣椒果实朝向分子标记CaUP12在分离群体材料中的验证结果表

注：UP代表果实朝上，DOWN代表果实朝下。

以上分析结果表明，在育种中通过分子标记鉴定和筛选，根据特异性条带进行判断，可以在幼苗期即可选择所需果实朝向的材料，可以提高选择效率，减少后期植株定植和筛选鉴定的工作量，加速育种进程。

同时，该标记具有很好的通用性，可准确用于各种辣椒材料果实朝向表型的预测。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种与辣椒果实朝向紧密关联的SNP位点及其通用性分子标记、获取方法和应用

<130> 无

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccaagtccct agatggtggt g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcacaagga cgtaggtgtc 20

Claims (4)

1.分子标记CaUP12在鉴定辣椒果实朝向中的应用，所述的应用方法具体包括如下步骤：

（1）以辣椒基因组DNA为模板，采用分子标记CaUP12进行PCR扩增，所述的分子标记为正向引物CaUP12-F和反向引物CaUP12-R，其正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；

（2）对PCR产物进行PCR-RFLP限制酶MspI酶切，并利用1%的琼脂糖凝胶对酶切产物进行凝胶电泳；

（3）检测PCR-RFLP反应酶切产物，如果出现2个特异条带，且2个条带大小分别为445bp、222 bp时，可判断辣椒材料为纯合的果实朝上材料；如果只出现1个特异条带，且条带大小为667 bp时，可判断所测试辣椒材料为纯合的果实朝下材料；如果同时出现三个条带，且3个条带大小分别为667 bp、445 bp和222 bp时，则可判断所测试辣椒材料为杂合的果实朝下的材料。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的PCR扩增反应体系，按总体积为20 μl计，包括如下各组分：

正向引物 0.4 μl

反向引物 0.4 μl

10×PCR Buffer 2.0 μl

dNTPs 0.4 μl

Taq DNA聚合酶 0.2 μl

DNA模板 1.0 μl

ddH₂O 补足20 μl。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的PCR扩增反应条件为：95.0℃预变性3 min；95.0℃变性30 s，56.0℃复性30 s，72.0℃延伸45s，设置循环，跳至95℃，30s，循环32次；72.0℃延伸5 min，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的酶切体系如下：

PCR反应产物 10 μl

10×Buffer Tango 2 μl

MspI 1 μl

ddH₂O 补足31 μl。

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