CN115852032B - 与豇豆豆荚颜色相关的基因、kasp标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及与豇豆豆荚颜色相关的基因、KASP分子标记及其应用。本发明公开了与豇豆豆荚颜色相关的关键基因Vu05G004180，在该基因上的第1393和1394核苷酸位点之间存在CT碱基插入/缺失多态性，同时基于该SNP位点开发了与豇豆豆荚颜色相关的KASP标记，利用该标记只需要对待测植株DNA进行一次PCR扩增即可得到鉴定结果，操作简单，在荧光定量PCR仪中通过荧光检测到的基因分型值和分布图就可以简便、准确地鉴选出具有目的基因的植株，实现了有利基因的转移和基因聚合，实现了由“经验育种”到定向“精确育种”的转变。

Description

与豇豆豆荚颜色相关的基因、KASP标记及其应用

技术领域

本发明属于植物分子标记辅助育种技术领域，具体涉及与豇豆豆荚颜色相关的基因、KASP标记及其应用。

背景技术

豇豆豆荚富含蛋白质、磷脂、膳食纤维等有益成份，是保健疗疾的佳蔬，被列为亚洲十大栽培蔬菜之一，在农业生产中占有重要地位。豇豆嫩荚颜色是豇豆重要的品质特征，在不同品种间呈白色、绿色、紫色和斑纹等多种颜色。不同程度的紫色与花青素积累的程度有关。富含花青素不仅赋予植物斑斓的色彩，还能在预防与年龄相关的退行性疾病方面发挥重要作用，深受消费者的青睐。目前，现有的豇豆品种生产上仍以高产绿荚为主。因此，选育富含花青素的豇豆新品种，改善其内在营养和外观品质，是豇豆育种的主要目标之一，对豇豆产业发展具有重要意义。之前有研究通过整合代谢组学和转录组学分析研究了紫色荚果颜色的可能机制，发现一些转录因子(TF)可能参与了紫色荚果中花青素积累的调节。然而，控制紫荚的关键候选基因仍然未知。现有与豇豆荚色基因紧密连锁的分子标记为dCAPS标记，该标记需要先进行PCR扩增，然后再进行酶切处理，最后再进行电泳检测，步骤较多，程序繁琐，且所需内切酶成本较高，同时还可能会产生气溶胶污染环境，也不适用于高通量的分子检测平台。因此，挖掘控制长豇豆荚色的关键基因，并开发操作便捷、周期短、通量高的功能分子标记，对于提高豇豆育种效率、缩短育种年限至关重要。

竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele-specific PCR，KASP)技术是近些年来发展起来的一种主要基于SNP的高通量基因分型技术。相较于传统的分子标记(RFLP，STS、SSR等)有其独特的优势，KASP不依赖于凝胶电泳，不需要酶切及专门的设备，可以使用常规的qPCR仪器进行SNP基因分型，因具有成本低，灵活性高，兼容性好，准确性高，周期短、可操作性强等优点而在农作物性状改良等领域具有巨大的应用潜力。因此，开发适合于高通量分子检测平台的豇豆荚色KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用，提高豇豆荚色育种效率和育种水平具有重要意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明挖掘了与豇豆豆荚颜色相关的关键基因Vu05G004180，在该基因上的第1393:1394核苷酸位点间存在CT双碱基插入/缺失多态性，同时基于该SNP位点开发了于豇豆豆荚颜色相关的KASP标记，为豇豆豆荚颜色的鉴定以及豇豆豆荚颜色的选育提供了新的途径。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明第一方面提供了基因Vu05G004180在豇豆豆荚颜色选育中的应用，基因Vu05G004180具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明第二方面提供了与豇豆豆荚颜色相关的KASP标记VuMYB-KASP1在豇豆豆荚颜色选育中的应用，所述KASP标记VuMYB-KASP1为第一方面所述的Vu05G004180基因上的第1393:1394核苷酸位点间CT碱基的插入/缺失。

本发明第三方面提供了用于扩增KASP标记VuMYB-KASP1的引物在豇豆豆荚颜色选育中的应用。

本发明公开了与豇豆豆荚颜色相关的关键基因Vu05G004180，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，在该基因上的第1393:1394核苷酸位点间存在CT碱基的插入/缺失多态性，基于该SNP位点，本发明开发了于豇豆豆荚颜色相关的KASP标记，利用该标记只需要对待测植株DNA进行一次PCR扩增即可得到鉴定结果，操作简单，无需进行CAPS标记的酶切反应和InDel标记复杂耗时的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，而是在荧光定量PCR仪中通过荧光检测到的基因分型值和分布图就可以简便、准确地鉴选出具有目的基因的植株，实现了有利基因的转移和基因聚合，实现了由“经验育种”到定向“精确育种”的转变。

优选地，VuMYB-KASP1的引物包括如SEQ ID NO.3所示的VuMYB-KASP1-F1、如SEQID NO.4所示的VuMYB-KASP1-F2和如SEQ ID NO.5所示的VuMYB-KASP1-R。

优选地，所述豆荚颜色包括绿色和紫色。

本发明第四方面提供了一种豇豆豆荚颜色的选育方法，该方法包括以下步骤：

S1、提取待测豇豆的基因组DNA；

S2、以待测豇豆提取的DNA为模板，利用VuMYB-KASP1标记引物进行PCR扩增与荧光检测，所述VuMYB-KASP1标记引物包括两条正向引物和一条反向引物，且在两条正向引物的5’端添加荧光报告基团HEX和FAM；

S3、反应结束后统计检测到的碱基类型，其中-/-为纯合紫色基因型，CT/CT为纯合绿荚基因型，CT/-为杂合紫荚基因型。

优选地，所述VuMYB-KASP1标记引物为第三方面所述的引物。

更优选地，所述VuMYB-KASP1标记引物包括如SEQ ID NO.3所示的VuMYB-KASP1-F1、如SEQ ID NO.4所示的VuMYB-KASP1-F2和如SEQ ID NO.5所示的VuMYB-KASP1-R。

优选地，PCR扩增的体系为10μL，包括1.0μL 10ng·μL^-1的DNA检测模板，10μM的VuMYB-KASP1标记的两条正向引物及一条反向引物各0.1、0.1、0.3μL，5μL的FLu-Arms 2×PCR Mix,3.5μL无菌水。

优选地，PCR扩增的反应程序为：95℃变性10min；95℃变性15s，61℃→55℃，每个循环下降0.6℃，退火60s，10个循环；95℃变性15s，55℃退火60s，28个循环；30℃读数30s。

优选地，荧光检测的参数设置为：将Allele 1碱基设定为CT碱基缺失，记为-/-，荧光Reporter设定为HEX；Allele 2碱基设定为CT/CT，荧光Reporter设定为FAM。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明发掘了控制豇豆豆荚颜色的关键基因Vu05G004180及不同基因型之间的SNP(Vu05G004180第1393:1394位点间存在的CT碱基插入/缺失)，同时开发出一个可用于豇豆豆荚颜色鉴定的KASP分子标记VuMYB-KASP1。VuMYB-KASP1包含2条分别长49bp的正向引物VuMYB-KASP1-F1和VuMYB-KASP1-F2、以及一条长21bp的反向引物VuMYB-KASP1-R。利用VuMYB-KASP1鉴定豇豆豆荚颜色，只需要对待测植株DNA只进行一次PCR扩增即可得到鉴定结果，操作简单，无需进行CAPS标记的酶切反应和InDel标记复杂耗时的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，而是在荧光定量PCR仪中通过荧光检测到的基因分型值和分布图直接鉴定得到豇豆纯合紫荚基因型(双碱基缺失，-/-)或杂合紫荚基因型(CT/-)及绿荚基因型CT/CT，检测效率可高达99％。

附图说明

图1为豇豆WSS1和PRS商品期豆荚颜色的对比；

图2为在Vu05染色体上检测到与紫色荚果相关的位点；

图3为BSA测序亲本绿色和紫色荚豇豆材料Vu05G004180基因编码区双碱基变异的Sanger测序局部图(互补链)；

图4为VuMYB-KASP1在淡绿荚亲本WSS1和紫荚亲本PRS中的荧光检测结果示意图；

图5为VuMYB-KASP1在豇豆绿荚品系WSS1和紫荚品系以及其杂交种、F₂群体中的荧光检测结果示意图；

图3-5中，样本根据其基因型分为I类、II类和III类。I类的各样本分布靠近X轴，表示该SNP为纯合紫荚基因型-/-；II类的各样本分布靠近Y轴，表示该SNP为纯合绿荚基因型CT/CT；III类的各样本大致分布于X轴和Y轴的对称轴位置，表示该SNP为杂合紫荚基因型CT/-；×表示未检测到相应SNP。

图6为VuMYB-KASP1在96份豇豆材料上进行豆荚颜色鉴定的荧光检测结果图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1豇豆豆荚颜色KASP标记的获取

(1)对广东省农业科学院蔬菜研究所叶菜豆类研究室种质资源库中的紫色荚果品系PRS和浅绿色荚果品系WSS1进行杂交(图1)，得到304个F₂个体，其中紫色荚果220个，白色荚果84个。根据F₁的表型(紫色荚果)和F₂个体间的分离比为3:1(χ²＝1.12,P>0.05)，确定荚果紫色是由一个基因控制，紫色是显性性状。为进一步探索该基因的位置，利用混合集团分离分析(BSA)和高通量测序技术对两个亲本和两个包含30个F₂极端表现型个体的扩增池进行测序分析(由百迈克生物科技有限公司完成)。在质量控制之后，对两个父节点和两个bulk执行小变量(SNP和InDels)调用，然后计算两个池之间的Δ(SNP-index)值。在Vu05染色体上确定了一个位点与紫色荚果相关(图2)，这与表型分离的遗传分析一致。为了进一步缩小候选区域，在250kb步长的50kb窗口中研究了Δ(SNP-index)>0.9的变体数。最后，鉴定出一个0.55Mb的基因组区域(3.10-3.65Mb)，由54个基因组成。为了进一步探索与紫色荚果相关的候选基因，对PRS和WSS1荚果的转录组进行了研究，共检测到981个差异表达基因(DEGs)，其中两个差异基因Vu05G004180和Vu05G004220位于BSA揭示的候选区域。在拟南芥中，Vu05G004220与AT5G15310(AtMYB16)同源，编码一个MIXTA-like转录因子，控制毛状体成熟和角质层形成(Camoirano,A.,Arce,A.L.,Ariel,F.D.,et al..(2020).Class I TCPtranscription factors regulate trichome Vuanching and cuticle development inArabidopsis.JExp Bot 71,5438-5453.)。同时，基于全基因组的ONT和Illumina数据，没有在PRS中检测到覆盖Vu05G004220的变异。Vu05G004180与拟南芥中的AT1G66380(AtMYB114)同源，后者编码转录因子MYB家族的一个成员(R2R3-MYB)，并参与花青素生物合成的调控(Heppel,S.C.,Jaffe,F.W.,Takos,A.M.,et al..(2013).Identification of key aminoacids for the evolution of promoter target specificity of anthocyanin andproanthocyanidin regulating MYB factors.Plant Mol Biol 82，457-471.Yan，H.，Pei，X.，Zhang，H.，et al..(2021).MYB-Mediated Regulation of AnthocyaninBiosynthesis.Int J Mol Sci 22.)。与紫色荚果品系(PRS)相比，浅绿色荚果品系(WSS1)的Vu05G004180外显子中检测到双碱基插入(CT)，该双碱基插入紫荚材料Vu05G004180基因上1393和1394碱基之间，于该基因654bp的编码序列末端密码子区域内部(SEQ ID NO.2所示序列的第652和653碱基之间)，Sanger测序进一步验证了该结果(图3)。推测该双碱基可能参与调控其自身的转录。因此，初步认定Vu05G004180(VuMYB114)可能是控制豇豆紫荚的候选基因。

Vu05G004180(VuMYB114)的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：

AAGTTTTACGACTATTGATATAATCTCAAATAATCAACAAATACATAAAAAAGAAAAATCCCAAACAAGATAATATCTTATTTGTATATAAGTTTACAAAACTGATCTTCTGCAACCAAGATTTCGAAGGCCATAAAAAAATTCTTGTATAAGAGTTATATATGTTACCTAGTATAAAACTCTTAACAGTGACTTAAGTTCTTAAGCATGCATTATATTCACTACATCCAATAGTCCATGAAAACTTATTCGAAATTTTTGAAGATTGGTCCATTGGCATCAAAATGATCATTCCTAAAGGACACTGCTCAATTCCATGTGTATATATTTTACAGGGTTATGCATTCTGAGCATAACTTTATCTTTTTAAGACACATATATTATATATAGTTTGAGAAAAACGTTTTCTCTCCAAGTATATCACCTTAGGTATCACCATTGTGCAAGCAGCTTGTGTGATTATGGAAGGAAGATTATCAGGTGTGAGGAAAGGAGCATGGAGTCAAACTGAAGATGAACTTCTCAGAGAATGCGTGCAACTCTATGGGGAAGGAAAATGGCACCTTGTTCCTCAAAGAGCAGGTTTCTTTCATCTCTTTCTTTATGTTATCATTTTCCTCTTCTTCATTTCTTTTACACAACATTCTCATAAACATTTTTATGAGTCATATGATGTTATGTTTTGTACACGTAGGGTTGAACAGATGCAGGAAGAGTTGTAGGCTGAGATGGTTGAACTATTTGAAACCAAATATCAAGCGAGGTGATTTTAGTGAAGATGAGGTCGATTTGATCATCAGATTGCATAAGCTTCTGGGGAACAGGTTTCTATATATTTGCTGTATAAGATTTATTCAAAGACATAAAACAAACGAATACTTTTATATTATGAGTATTATTTATAGAATATGTTTAATTTTTGTACACATATTCGACATTATACAAAGGTCAACAGAATAGCAATCATGAAACGACAACTTTGTTGGATGCAGGTGGTCTCTGATCGCAGGAAGACTTCCGGGAAGAACTTCGAACGATGTGAAGAATTACTGGAACACGAACATGCGCCGCAAAGTACAATCTCACAGCAAAGATGAGGAGAACAACAACAAGAACAACGTGAAAGAATCCGAAAGAAGTTGGAAACCCCACCACCAAGTGATAAAGCCTGTGCCTCGAGCTTTGCCAAAAGCATCACCCTTGGTGCAAAGCCAATTCATGAGTTGTTCGAAAGTTGGAGTTAGTGAAGCTGTTTCAGCAGCCTCTGAGAATTGGTGGGAAACTCTGTTAGATGAGAAGGAAGATAACATTGCAGTTAACGACAGCACGTGCTTCCCACGTGCAAAAGATGGATCCTTTGAACTTTGGAATGAAGAACTTGGTTCCATTGCTT

GAGTTTCTTGAAGAAGGTGAAACATGGATCGATTTTCTTCTTAATTAACCTACCACATTCGCCATCTCTCTCATGCCTTTATTTCCATAAGAAGGCACTTCAATTAGTTCAAACTTAGGTTTCATTTACTTTAGAAAAtAAGTTCTTGCTAGAGGCACTGGTTAAGAAACAAAAAACAAGAAATAATTTATTGGAAAGTATGTAGGAATGATACTTAATGTTGTGTTTGAATGAAACAAATTTAAAAGAGTTCATTGATTTAAACAATTTTATTTTAGTTTACTCA(下划线加粗字体为CT碱基插入/缺失突变位点)。

Vu05G004180(VuMYB114)的编码序列(SEQ ID NO.2)：

ATGGAAGGAAGATTATCAGGTGTGAGGAAAGGAGCATGGAGTCAAACTGAAGATGAACTTCTCAGAGAATGCGTGCAACTCTATGGGGAAGGAAAATGGCACCTTGTTCCTCAAAGAGCAGGGTTGAACAGATGCAGGAAGAGTTGTAGGCTGAGATGGTTGAACTATTTGAAACCAAATATCAAGCGAGGTGATTTTAGTGAAGATGAGGTCGATTTGATCATCAGATTGCATAAGCTTCTGGGGAACAGGTGGTCTCTGATCGCAGGAAGACTTCCGGGAAGAACTTCGAACGATGTGAAGAATTACTGGAACACGAACATGCGCCGCAAAGTACAATCTCACAGCAAAGATGAGGAGAACAACAACAAGAACAACGTGAAAGAATCCGAAAGAAGTTGGAAACCCCACCACCAAGTGATAAAGCCTGTGCCTCGAGCTTTGCCAAAAGCATCACCCTTGGTGCAAAGCCAATTCATGAGTTGTTCGAAAGTTGGAGTTAGTGAAGCTGTTTCAGCAGCCTCTGAGAATTGGTGGGAAACTCTGTTAGATGAGAAGGAAGATAACATTGCAGTTAACGACAGCACGTGCTTCCCACGTGCAAAAGATGGATCCTTTGAACTTTGGAATGAAGAACTTGGTTCCATTGCTT(CT碱基插入位点)GA。

(2)根据Vu05G004180(VuMYB114)的双碱基缺失位点(CT)设计5对KASP标记。利用5对KASP标记设计引物在亲本间进行扩增检测，共检测到2对引物在亲本间存在差异SNP。以KASP标记VuMYB-KASP1(其引物如SEQ ID NO.3、4、5所示)在亲本间的扩增为例，如图4所示，淡绿荚亲本WSS1的四次重复检测结果靠近Y轴，并聚集为I类，基因型为CT；紫荚亲本PRS的四次重复检测结果靠近X轴，并聚集为II类，基因型为-/-(双碱基缺失)。

(3)利用在亲本间有多态性的2对KASP标记在F₂群体中进行多态性验证，发现VuMYB-KASP1能将F₂群体各单株聚为三类，如图5所示，靠近Y轴的样本聚集为I类，为纯合绿荚基因型CT；靠近X轴的样本聚集为II类，为纯合紫荚基因型-/-(双碱基缺失)；靠近X、Y对称轴位置的样本聚集为III类，为杂合紫荚基因型CT/-。而且VuMYB-KASP1在F2群体中的基因型检测结果与荚色表型鉴定结果一致性较高，达100％。因此，KASP标记VuMYB-KASP1可作为鉴定豇豆荚色的候选分子标记。

豇豆豆荚颜色KASP标记引物VuMYB-KASP1-F1，包括两条长46bp的正向引物VuMYB-KASP1-F1和VuMYB-KASP1-F2，以及一条长29bp的反向引物VuMYB-KASP1-R(在两条正向引物的5’端分别添加有荧光报告基团HEX和FAM)，具体如下：

VuMYB-KASP1-F1(SEQ ID NO.3)：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAAGAACTTGGTTCCATTGCTAC；

VuMYB-KASP1-F2(SEQ ID NO.4)：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAAGAACTTGGTTCCATTGCTTG；

VuMYB-KASP1-R(SEQ ID NO.5)：

AAGAAAATCGATCCATGTTTCACCTTCTT。

实施例2豇豆荚色KASP标记的应用

(1)选取96个本研究室收集的农艺性状优良的豇豆种质资源(自2018年-2022年间在广东省内收集的地方种、农家种及市面上购买的商品种)，在苗期取叶片，利用基因组DNA提取试剂盒或CTAB法提取每个单株的基因组DNA备用。

(2)利用VuMYB-KASP1标记引物(SEQ ID NO.3、4、5)对步骤(1)中提取的96份DNA样品进行扩增与荧光检测。PCR扩增的体系为10μL，包括10ng·μL^-1的DNA模板1.0μL，10μM的VuMYB-KASP1标记F1、F2及下游通用引物R各0.1、0.1、0.3μL，FLu-Arms 2×PCR Mix 5μL，无菌水3.5μL。PCR反应程序为：95℃变性10min；95℃变性15s，61℃→55℃(每个循环下降0.6℃)退火60s，10个循环；95℃变性15s，55℃退火60s，28个循环；30℃读数30s。

(3)荧光参数设置时(Bio-RAD，CFX96 Touch)：将Allele 1碱基设定为-/-(CT碱基缺失)，荧光Reporter设定为HEX；Allele 2碱基设定为CT/CT，荧光Reporter设定为FAM。

(4)运行程序，反应结束后统计每个单株检测到的碱基类型(CT/CT或-/-或CT/-)，-/-为纯合紫色型，CT/CT为纯合绿荚型，CT/-为杂合紫荚型。

(5)种植步骤(1)中的豇豆材料，结荚期调查并统计每个种的荚色情况，绿色或紫色。

(6)对步骤(4)中统计到的基因型(图6)与步骤(5)中统计的表型做比较分析，得出一致性高达99％，达到了分子标记筛选的目的。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.与豇豆豆荚颜色相关的KASP标记VuMYB-KASP1在豇豆豆荚颜色选育中的应用，其特征在于，所述KASP标记VuMYB-KASP1为Vu05G004180基因上的第1393:1394核苷酸位点间CT碱基的插入/缺失，Vu05G004180具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.用于扩增KASP标记VuMYB-KASP1的引物在豇豆豆荚颜色选育中的应用，其特征在于，VuMYB-KASP1的引物包括如SEQ ID NO.3所示的VuMYB-KASP1-F1、如SEQ ID NO.4所示的VuMYB-KASP1-F2和如SEQ ID NO.5所示的VuMYB-KASP1-R。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述豆荚颜色包括绿色和紫色。

4.一种豇豆豆荚颜色的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、在苗期提取待测豇豆的基因组DNA；

S2、以待测豇豆提取的DNA为模板，利用VuMYB-KASP1标记引物进行PCR扩增与荧光检测，所述VuMYB-KASP1标记引物包括两条正向引物和一条反向引物，且在两条正向引物的5’端添加荧光报告基团HEX和FAM，所述VuMYB-KASP1标记引物具体为权利要求2用于扩增VuMYB-KASP1的引物；

S3、反应结束后统计检测到的碱基类型，其中-/-为纯合紫色基因型，CT/CT为纯合绿荚基因型，CT/-为杂合紫荚基因型。

5.根据权利要求4所述的一种豇豆豆荚颜色的选育方法，其特征在于，PCR扩增的体系为10μL，包括1.0μL10ng·μL^-1的DNA检测模板，10μM的VuMYB-KASP1标记的两条正向引物及一条反向引物各0.1、0.1、0.3μL，FLu-Arms2×PCRMix5μL,无菌水3.5μL。

6.根据权利要求4所述的一种豇豆豆荚颜色的选育方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为：95℃变性10min；95℃变性15s，61℃→55℃，每个循环下降0.6℃，退火60s，10个循环；95℃变性15s，55℃退火60s，28个循环；30℃读数30s。

7.根据权利要求4所述的一种豇豆豆荚颜色的选育方法，其特征在于，荧光检测的参数设置为：将Allele1碱基设定为CT双碱基缺失，记为--/-，荧光Reporter设定为HEX；Allele2碱基设定为CT/CT，荧光Reporter设定为FAM。

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