CN109504798B - 一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果核大小的snp标记及其应用 - Google Patents

一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果核大小的snp标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种梨果核大小紧密相关的SNP分子标记引物及其应用。一种与梨果核大小紧密相关的SNP标记Pfs258‑07，引物：SEQ ID NO.1；SEQ ID NO.2。利用该特异引物基于高分辨率溶解曲线可对梨果核大小进行良好分型。本发明提供的梨果核大小分子标记引物可用于梨果核大小的分子标记辅助选择育种，对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。

Description

一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果核大小的SNP标记及其 应用
技术领域
本发明属于分子遗传育种领域，涉及一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果核大小的SNP标记及其应用。
背景技术
梨果不仅具有风味多汁、酸甜爽口等特性，而且富含膳食纤维和多种营养成分，具有生津、润燥、清热、化痰，抗氧化的功能，因而深受消费者喜爱。梨是世界范围的主要栽培果树树种，在五大洲的87个国家均有栽培。梨也是我国的第三大果树树种。我国梨的栽培面积和产量均居世界第一。梨果实的食用及外观品质一直是人们所关注的问题，它是决定梨果实经济价值的重要因素，因此提高梨的食用及外观品质具有重要的意义。梨果实食用及外观品质受众多因素的影响，其中果核大小是影响梨果实品质的重要因素之一。梨的果核大小直接决定了果实可食用部分的比例，它不仅影响梨果实的食用品质，而且影响其加工品质。降低梨果实的果核大小，对改善梨的品质至关重要。近年来，培育无核无籽水果的研究已经在果树作物中广泛开展，并且此类水果深受消费者的青睐。因此，优质小核甚至无核的梨品种选育是国际梨育种的重要目标之一，具有重要的产业意义和价值。
梨新品种的选育主要以杂交选育为主，而杂交选育通常是通过表型进行的，并且梨的童期较长，利用传统的育种技术选育新的品种需要很长的时间，因此培育出品质优良、适应性强、丰产耐贮的综合性状优良的新品种具有很大困难。利用分子标记辅助选择(MAS)育种技术可以提高选择效率，加快育种步伐。随着测序技术的不断发展，SNP(singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态性)位点已经成为主流的分子标记。SNP指在基因组上单个核苷酸的变异所形成的核苷酸序列多态性，是目前认为最具有研发潜力的检测技术，与其他已知分子标记相比具有以下优势：一是在基因组中分布密度更高更均匀；二是易实现数据整合比较；三是通量高，检测位点数可达到几百万个；四是部分标记与功能基因甚至植物表型相关[1,2]。SNP分子标记检测技术近年来被广泛应用于大豆[3]、花生[4]、水稻[5]和小麦[6]等植物的分子辅助育种。
目前有关梨果核大小的研究甚少，对梨果核大小的SNP分子标记开发及应用尚未有报道。因此，开展梨果核大小的SNP分子标记开发，并建立自然群体辅助选择技术体系，对于提高育种效率、节约生产成本显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是利用梨的重测序数据信息，开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果核大小的SNP特异标记Pfs258-07。通过该分子标记可以预测大果核的梨品种，为实现梨果核大小的早期鉴定和筛选提供分子标记辅助育种的技术支持。
与梨果核大小紧密相关的SNP标记Pfs258-07，位于登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr7的第10857930个碱基处；该标记在小果核品种中为T，大果核品种中为G。
本发明所述的SNP标记Pfs258-07在鉴定梨果核大小中的应用。
本发明所述的SNP标记Pfs258-07在梨果核大小早期鉴定和筛选的分子育种中的应用。
与梨果核大小紧密相关的SNP标记引物对，由Pfs258-07-F：SEQ ID NO.1和Pfs258-07-R：SEQ ID NO.2组成。
本发明所述的SNP标记引物对在鉴定梨果核大小中的应用。
本发明所述的SNP标记引物对在改善梨果核大小的分子育种中的应用。
本发明发现登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr7的第10857930个碱基处存在一个与梨果核大小相关的位点(Pfs258-07)。Pfs258-07位点在小果核品种中为T，大果核品种中为G。通过检测该位点的基因型，可以预测梨果核大小，以实现梨品种的早期鉴定和筛选。
一种基于高分辨率溶解曲线筛选梨果核大小的方法，采用本发明所述的SNP标记引物对对梨大、小果核的对照梨品种以及待鉴定的梨品种进行高分辨率溶解曲线分析，通过对待鉴定梨品种的高分辨率溶解曲线与上述对照梨品种的高分辨率溶解曲线的比较，鉴定该梨品种是否为大果核的品种。所述的小果核的对照梨品种选自：砀山酥梨；所述的大果核的对照梨品种选自：早蜜。
所述的高分辨率溶解曲线反应体系按照LightCycler 480High ResolutionMelting Master试剂盒中的说明书进行，HRM分析在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行。
高分辨率溶解曲线反应体系为20μL：含有30ng梨基因组DNA模板，1×Master Mix，2.5mmol/L MgCl2，200nM权利要求1所述的SNP标记引物对；扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR)：95℃预变性10min，然后95℃变性10s、65-53℃退火10s、每循环下降0.5℃，72℃延伸10s的程序进行45个循环；PCR循环结束后进行熔解，其程序为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，再从70℃连续升温至95℃，每升高0.04℃，收集荧光1次，最后降温至40℃；最后，在LightCycler480II的Gene Scanning软件中自动生成扩增产物的熔解曲线。
有益效果
本发明发现登录号为AJSU00000000的梨基因组序列Chr7的第10857930个碱基处存在一个与梨果核大小相关的位点(Pfs258-07)，通过检测该位点的基因型，可以预测梨果核大小，以实现对该性状的早期鉴定和筛选。基于上述发现，申请人开发了上述位点的SNP标记引物。利用开发的SNP标记引物，对72个梨自然群体进行差异基因型检测，能很好地用于鉴定大果核群体，与果实实际果核大小相符。群体试验表明，开发的SNP标记特异引物可以对自然群体大果核品种进行良好分型。因此，具有良好的应用价值，可实现对梨大果核品种的预先选择和辅助育种。
附图说明
图1SNP标记Pfs258-07开发的HRM特异标记引物，72个梨自然群体个体中检测的归一化平移溶解曲线，可良好分型。
Pfs258-07标记引物检测的归一化平移溶解曲线。
检测个体的排列，A1-C12为小果核群体，D1-F12为大果核群体。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1果核大小的测定
梨果核的大小通过测定其纵横径来判断。首先我们将梨果实进行纵切，然后利用游标卡尺对其果核进行测量。同一个品种取3-6个果实进行重复测定，并记录数据。最终数据以平均值±标准差的方式呈现。72个梨自然群体成熟果的果核纵横径见表1。
表1 72个梨自然群体成熟果实的果核大小
Figure BDA0001941092050000041
Figure BDA0001941092050000051
Figure BDA0001941092050000061
注：序号1-36为小果核品种，37-72为大果核品种。
实施例2利用SNP标记位点Pfs258-07开发HRM特异引物
从砀山酥梨全基因组数据库中搜索出第7条染色体上SNP标记Pfs258-07的DNA序列，选取的该位点前后300bp的序列，依据引物设计原则，开发设计SNP标记引物(表2)。利用设计的SNP标记引物在砀山酥梨的基因组DNA上进行PCR扩增，引物均扩增正常，PCR产物符合预测大小。
表2 SNP标记引物
Figure BDA0001941092050000062
实施例3利用HRM(high-resolution melting，高分辨率溶解曲线)技术对梨果核大小进行分型
HRM反应体系按照LightCycler 480High Resolution Melting Master试剂盒中的说明书进行，HRM分析是在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行。20μL反应体系：含有30ng梨基因组DNA模板，1×Master Mix，2.5mmol/L MgCl2，200nM权利要求1或2所述的引物；扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR)：95℃预变性10min，然后95℃变性10s、65-53℃(每循环下降0.5℃)退火10s、72℃延伸10s的程序进行45个循环。PCR循环结束后进行熔解，其程序为：95℃1min，40℃1min，65℃1s，再从70℃连续升温至95℃，每升高0.04℃，收集荧光1次，最后降温至40℃。最后，在LightCycler480II的Gene Scanning软件中自动生成扩增产物的熔解曲线。
利用实施例2得到的SNP标记引物对72个梨自然群体进行HRM分析(图1)。
Pfs258-07引物分型结果：
线型1—蓝色曲线，47个体线型相似，其中36个体为大果核品种；线型2—红色曲线，17个体线型相似，为杂合基因型，其中17个体都为小果核品种；线型3—绿色曲线，5个体线型相似，PCR产物中存在其他SNP位点，其中5个体为小果核品种。统计分析表明，72个个体分型为3种基因型，分离比例为47：17：5。根据Pfs258-07引物分型结果将72个自然群体果核大小生理数据进行Fisher’s exact test(p-value＝1.46e-07)。
因此，通过对成熟梨果核大小的生理性状测定结果与HRM分型结果的比较分析，证明Pfs258-07标记的基因型与果核大小有关，能很好地用于检测梨大果核个体。
主要参考文献
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4.Clevenger,J.,Chu,Y.,Chavarro,C.,Agarwal,G.,Bertioli,D.J.,Lealbertioli,S.C.,Pandey,M.K.,Vaughn,J.,Abernathy,B.,and Barkley,N.A.Genome-wide SNP Genotyping Resolves Signatures of Selection and TetrasomicRecombination in Peanut.Molecular Plant 2017,10,309-322.
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序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果核大小的SNP标记及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgcttgtag cacggcagat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcactccaa agccacctcc 20

Claims (6)

1.与梨果核大小紧密相关的SNP标记引物对，其特征在于由Pfs258-07-F：SEQ ID NO.1和Pfs258-07-R：SEQ ID NO.2组成。
2.权利要求1所述的SNP标记引物对在鉴定梨果核大小中的应用；所述的梨选自以下品种：砀山酥梨、11-11、铁农25号、武巴、早香水、红金秋、幸水、早生喜水、晚三吉、玉水、麻梨、S14、喜水、秋水、天堂、新兴、长寿、43-4-11、长十郎、S07、雪峰、桂花梨、八里香、金香水、白皮酥、桂冠、软儿梨、云南红香酥、黄金梨、玉水、金村秋、蔗梨、软把子、早蜜、丰水、中矮2号、巴梨、108-1-94、红山、西子绿、中1A2、金水2号、晚秀、八红、身不知、华山、临夏黄麻、雪青、杭青、中梨1号、鸭梨、金坠梨、62-5-6、龙泉、晋大、新梨7号、青松、华酥、115-3-36、崇华大梨、雪英、红香蜜、甘梨早8、金川雪梨、樊山、台湾蜜梨、六月爽、八月红、锦香梨。
3.权利要求1所述的SNP标记引物对在梨果核大小早期鉴定和筛选的分子育种中的应用；所述的梨选自以下品种：砀山酥梨、11-11、铁农25号、武巴、早香水、红金秋、幸水、早生喜水、晚三吉、玉水、麻梨、S14、喜水、秋水、天堂、新兴、长寿、43-4-11、长十郎、S07、雪峰、桂花梨、八里香、金香水、白皮酥、桂冠、软儿梨、云南红香酥、黄金梨、玉水、金村秋、蔗梨、软把子、早蜜、丰水、中矮2号、巴梨、108-1-94、红山、西子绿、中1A2、金水2号、晚秀、八红、身不知、华山、临夏黄麻、雪青、杭青、中梨1号、鸭梨、金坠梨、62-5-6、龙泉、晋大、新梨7号、青松、华酥、115-3-36、崇华大梨、雪英、红香蜜、甘梨早8、金川雪梨、樊山、台湾蜜梨、六月爽、八月红、锦香梨。
4.一种基于高分辨率溶解曲线筛选梨果核大小的方法，其特征在于采用权利要求1所述的SNP标记引物对对大果核和小果核的对照梨品种以及待鉴定的梨品种进行高分辨率溶解曲线分析，通过对待鉴定梨品种的高分辨率溶解曲线与上述对照梨品种的高分辨率溶解曲线的比较，鉴定该梨品种是否为大果核的品种；其中所述的小果核的对照梨品种选自：砀山酥梨；所述的大果核的对照梨品种选自：早蜜；所述的梨选自以下品种：砀山酥梨、11-11、铁农25号、武巴、早香水、红金秋、幸水、早生喜水、晚三吉、玉水、麻梨、S14、喜水、秋水、天堂、新兴、长寿、43-4-11、长十郎、S07、雪峰、桂花梨、八里香、金香水、白皮酥、桂冠、软儿梨、云南红香酥、黄金梨、玉水、金村秋、蔗梨、软把子、早蜜、丰水、中矮2号、巴梨、108-1-94、红山、西子绿、中1A2、金水2号、晚秀、八红、身不知、华山、临夏黄麻、雪青、杭青、中梨1号、鸭梨、金坠梨、62-5-6、龙泉、晋大、新梨7号、青松、华酥、115-3-36、崇华大梨、雪英、红香蜜、甘梨早8、金川雪梨、樊山、台湾蜜梨、六月爽、八月红、锦香梨。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的高分辨率溶解曲线反应体系按照LightCycler 480 High Resolution Melting Master试剂盒中的说明书进行，HRM分析在LightCycler480 II 荧光定量PCR仪上进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于高分辨率溶解曲线反应体系为20μL：含有30ng梨基因组DNA模板，1 × Master Mix，2.5mmol/L MgCl2，200nM权利要求1所述的SNP标记引物对；扩增程序采用降落式PCR：95℃预变性10 min，然后95℃变性10 s、65-53℃退火10s、每循环下降0.5℃，72℃延伸10s的程序进行45个循环；PCR循环结束后进行熔解，其程序为：95℃1 min，40℃1 min，65℃1 s，再从70℃连续升温至95℃， 每升高0.04℃，收集荧光1次，最后降温至40℃；最后，在LightCycler480 II 的Gene Scanning软件中自动生成扩增产物的熔解曲线。
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‘无核世纪梨’无籽机理及不同授粉品种对其果实品质影响的研究;朱玉玲;《中国优秀硕士学位论文全文数据库，农业科技辑，河北农业大学学位论文》;20140315(第03期);D048-92，摘要 *
Pyrus x bretschneideri cultivar Dangshansuli, whole genome shotgun sequencing project，GenBank: AJSU00000000.1，26566rc DNA linear;Wu,J.等;《NCBI genbank》;20131106;1-2 *
The genome of the pear (Pyrus bretschneideri Rehd.);Jun Wu等;《Genome Res》;20130228;第23卷(第2期);396-408 *

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