CN115125325B - 全雌性型节瓜的kasp分子标记、引物及筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种节瓜全雌性型的KASP分子标记、引物及筛选方法，所述KASP分子标记位于节瓜第8号染色体第14520499处碱基，该处碱基发生T到C的突变。在本发明中，精确定位了与节瓜全雌性型紧密连锁的KASP分子标记，并通过该KASP分子标记设计了用于筛选全雌性型节瓜的引物对，利用该引物对，可以在分子层面实现全雌性型和普通性型节瓜材料的精准筛选，提高节瓜雌性育种的效率，具有重要的应用价值。

Description

全雌性型节瓜的KASP分子标记、引物及筛选方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，更具体地，本发明涉及一种全雌性型节瓜的KASP分子标记、引物及筛选方法。
背景技术
节瓜营养丰富，风味独特，具有清热、解暑、消肿等功效，是重要的功能保健型蔬菜，已成为我国内销和出口的名优特产蔬菜。节瓜富含维生素、氨基酸、微量元素和抗氧化物质，具有清热消暑和止血消炎的功效，是一种药食兼用的多功能蔬菜，已成为华南地区重要的日常消费蔬菜。
节瓜以幼嫩果实为主要食用器官，有连续坐果习性，提高雌花比例有利于实现早熟、高产。全雌性材料具有第一雌花节率低、连续开雌花且数目多、无雄花等特点。在节瓜、丝瓜与苦瓜育种过程中，利用全雌系作为母本配制的杂种一代可以显著提升早熟性，增加单株坐果数和产量。同时，在繁制杂种一代种子时，利用优良全雌系作为母本，雌雄同株的自交系作父本，通过虫媒授粉可以显著提高繁种效率，且可避免人工去雄不彻底，确保杂种一代制种的纯度。因此，全雌性状是影响节瓜产量和杂种一代繁制种的重要性状。
但是，目前我国节瓜优异的全雌性型种质资源较为匮乏，且可以应用到全雌育种中的分子标记较少，极大影响了节瓜全雌育种的效率。广东省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究一室在全国率先开展了节瓜雌性系材料创制、强雌性品种的选育以及相关分子遗传研究。2020年研究团队申请的“与节瓜紧密连锁的Indel分子标记gyIndel3及其应用”专利获得了国家知识产权局的授权。但是Indel分子标记仍然需要电泳技术平台，且对于遗传多样性较为匮乏的作物来说，无法获得较多的Indel分子标记，无法精细定位全雌性状。
目前，兴起的KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)利用通用荧光探针，可针对广泛基因组DNA样品，包括复杂基因组DNA样品，对目标SNPs或InDels进行精准的双等位基因分型，较Indel标记具有操作简单，便捷，准确的优点，可以显著提高大规模筛选育种材料的效率。
若是可以筛选到节瓜全雌基因的KSAP分子标记，将对节瓜全雌材料的筛选，具有重要的意义。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种节瓜全雌性型的KASP分子标记，利用该KASP分子标记，可以检测节瓜材料是全雌性型，还是普通性型。
实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：
一种节瓜全雌性型的KASP分子标记，所述KASP分子标记位于节瓜第8号染色体第14520499处碱基，该处碱基发生T到C的突变。
本发明还提供了上述KASP分子标记在制备筛选全雌性型节瓜的试剂盒中的应用。
本发明还提供了上述KSAP分子标记在节瓜辅助选择育种中的应用。
本发明还提供了一种筛选全雌性型节瓜的引物，所述引物包括：序列如SEQ IDNO.1所示的正向引物、以及序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的反向引物。
在其中一些实施例中，所述反向引物的5'端连接有荧光基团FAM或HEX。
在其中一些实施例中，所述序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物的5'端连接有荧光基团HEX，所述序列如SEQ ID NO.3所示的反向引物的5'端连接有荧光基团FAM。
本发明还提供了上述筛选全雌性型节瓜的引物在制备筛选全雌性型节瓜的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种筛选全雌性型节瓜的试剂盒，所述试剂盒包括上述筛选全雌性型节瓜的引物。
本发明还提供了上述筛选全雌性型节瓜的引物在节瓜辅助选择育种中的应用。
一种筛选全雌性型节瓜的方法，所述方法包括以下步骤：以待测节瓜样品的DNA为模板，上述引物作为引物，进行PCR扩增，检测位于节瓜第8号染色体第14520499碱基是否发生T到C的突变。
在其中一些实施例中，若待测节瓜样品的基因型为T:T，则待测节瓜样品为全雌性型节瓜；若待测节瓜样品的基因型为C:C，则待测节瓜样品为普通性型节瓜；若待测节瓜样品的基因型为T:C，则待测节瓜样品为杂合普通性型节瓜。
在其中一些实施例中，所述PCR扩增程序为：95℃预变性10min；94℃变性15s，61～55℃退火1min，退火温度每循环递减0.6℃，上述过程10个循环；然后94℃变性15s，57℃延伸1min，30个循环，最后30℃运行1min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
在本发明中，针对现有与节瓜全雌性连锁的分子标记的缺乏以及生产上的实际需求，本发明的发明人精确定位了与节瓜全雌性型紧密连锁的KASP分子标记，并通过该KASP分子标记设计了用于筛选全雌性型节瓜的引物对，利用该引物对，可以在分子层面实现全雌性型和普通性型节瓜材料的精准筛选，提高节瓜雌性育种的效率，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中节瓜全雌系A36和普通自交系SX图，其中，A：A36和SX性型和嫩瓜果实形态；B：A36雌花；C：SX雌花；D：A36雌花和SX雌花与雄花。
图2为本发明实施例1中节瓜全雌基因的精细定位。
图3为本发明实施例3中KASP分子标记的A、B、H三种基因型结果。
图4为本发明实施例3中70个F2单株KASP的分型结果。
图5为本发明实施例3中50个节瓜核心种质KASP的分型结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本发明的第一方面，提供了一种全雌性型节瓜的KASP分子标记，所述KASP分子标记为节瓜基因组第8号染色体上的14520499处发生T到C的突变。
在本发明的第二方面，根据上述KASP分子标记设计了筛选全雌性型节瓜的引物。
在本发明的第三方面，提供了一种利用上述筛选全雌性型节瓜的引物，筛选全雌性型节瓜的方法，包括以下步骤：以待测节瓜样品的DNA为模板，进行PCR扩增，检测位于节瓜第8号染色体第14520499碱基是否发生T到C的突变。若待测节瓜样品的基因型为T:T，则待测节瓜样品为全雌性型节瓜；若待测节瓜样品的基因型为C:C，则待测节瓜样品为普通性型节瓜；若待测节瓜样品的基因型为T:C，则待测节瓜样品为杂合普通性型节瓜。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1节瓜全雌性状基因定位
本实施例对节瓜全雌性状基因进行了定位。包括以下步骤：
一、试验材料
母本：全雌材料A36(广东省农业科学院蔬菜研究所江心节瓜经过多年自交选育而来)，瓜皮色深绿，短圆筒形，星点少，瓜肉白色，纯合全雌型(图1中的A)。
父本：普通材料SX(广东省农业科学院蔬菜研究所在翠宝节瓜的基础上，经过多年自交选育而来)，瓜皮绿色，中长筒形，星点多，瓜肉绿色，普通花型(图1中的A)。
二、试验步骤
1、正反交F1植株性型均表现为普通花型。
2、2018年秋季，F2群体中，235株表现为普通雌雄同株性型，73株表现为全雌型，普通雌雄同株与全雌株性型的分离比，经卡方检验符合3:1，由此推断节瓜全雌性是由单隐性单基因控制，全雌性对普通雌雄同株性型为隐性。
3、利用F2群体，构建全雌和雌雄同株基因池，结合两亲本进行BSA分析，发现在Chr.8上存在较高的△SNP index值，物理位置是在13087099-16069015之间2.98Mb范围内(图2中的A)。
4、在该区间内设计多对SSR引物(表1)，利用SSR引物对F2群体进行DNA分析，将全雌基因初步定位在SSR8C056和SSR8C018之间，物理距离为1.5Mb(图2中的B)。
表1 SSR引物表
Figure BDA0003712641880000061
5、利用表2所示引物对，通过KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)，分别对F2群体308个单株进行基因分型。
其中，KASP反应程序为：PCR反应体系(10μL)：5μLMix(2×)，1.0μL引物A1，0.5μL引物A2，0.5μL引物C1，1.0μLcDNA，2.0μLddH2O。
PCR反应程序：包括预变性和降落程序，具体为：95℃预变性10min；94℃变性15s，61～55℃退火1min，退火温度每循环递减0.6℃，上述过程10个循环；然后94℃变性15s，57℃延伸1min，30个循环，最后30℃运行1min。
表2 KASP引物对
Figure BDA0003712641880000071
Figure BDA0003712641880000081
结合表型数据将节瓜全雌基因定位到物理距离为14155431-14685791之间的530Kb范围内(图2中的C)。
6、根据节瓜全雌基因的精细定位区域，结合节瓜基因组测序提供的基因预测、注释结果，对其进行序列分析，结果发现候选区间内有8个候选基因，如表3所示。
表3精细定位区间内的候选基因及其功能注释
Figure BDA0003712641880000082
7、根据亲本重测序的结果，查找该候选区间内的SNP变异位点。在14520499位置处检测到一个SNP位点的变异T/C，该变异位点可以作为筛选全雌性型节瓜的KASP分子标记。
实施例2筛选全雌性状节瓜的引物设计
根据实施例1的KASP分子标记，根据目标SNP位点上下游200bp的序列，利用BatchPrimer3 v1.0软件(http://batchprimer3.bioinformatics.ucdavis.edu/)设计KASP引物。设计的两条反向引物末端等位变异碱基均为G/A。具体引物序列分别如下：
正向引物F(SEQ ID NO.1)：
5'-GCCTTAATTCATCTCCGTGGATTATAGAT-3'。
反向引物R1(SEQ ID NO.2，5'端连接HEX基团的荧光标签序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)，具体序列为：
5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGATTCGAATAAACAAGAGAAACTAGTCG-3'
反向引物R2(SEQ ID NO.3，5'端连接FAM基团的荧光标签序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)，具体序列为：
5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATGATTCGAATAAACAAGAGAAACTAGTCA-3'
实施例3实施例1和2中KASP分子标记、引物的验证
利用实施例1中构建的F2群体中的70个全雌单株以及挑选的50份节瓜种质材料(均来源于广东省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究一室)对实施例1的KASP分子标记、实施例2的引物进行验证。
1、采用CTAB方法对上述材料进行DNA提取。
2、利用实施例2的引物进行PCR扩增。
PCR反应体系(10μL)：5μLMix(2×)，1.0μL正向引物，0.5μL反向引物R1，0.5μL反向引物R2，1.0μLcDNA，2.0μLddH2O。
PCR反应程序：包括预变性和降落程序，具体为：95℃预变性10min；94℃变性15s，61～55℃退火1min，退火温度每循环递减0.6℃，上述过程10个循环；然后94℃变性15s，57℃延伸1min，30个循环，最后30℃运行1min。
3、结果统计
扩增结束后，对扩增产物进行荧光检测。具体是：将PCR产物在包含3种通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息，进行基因分型，获得基因型结果。分析如下：
聚合在X轴且荧光信号呈橙色的样本为全雌基因型，A(T:T)基因型；聚合在Y轴且荧光信号呈蓝色的样本为普通性型，B(C:C)基因型；聚合在中间且荧光信号呈绿色的样本为杂合普通性型，H(T:C)基因型(如图3)。
70个F2单株上的KASP分型结果如图4所示，F2单株的KASP分型均为A基因型，与A36母本(3株)的基因型一致；B基因型为父本SX(3株)，H基因型为F1(3株)。由于F2群体挑选的均为全雌型单株，因此，基因型与表型相符，检测准确率为100％。
50份核心节瓜种质材料中，性型表型为全雌性：普通性型＝5株：45株。而利用KASP标记设计的引物进行扩增(父本、母本和F1各3株)，发现A:B:H＝6株：9株：44株(图5，B、H基因型的单株表现为普通性型)。除了A型有2株表型与基因型不符合外，B型和H型表型与基因型均相符，KASP分子标记的检测准确率为96.7％。
本实施例结果证明，利用本发明的KASP分子标记和引物，能够在分子层面筛选节瓜的全雌性型和普通性型，可以提高节瓜雌性育种的效率，具有重要的应用价值。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
                         序列表
<110>  广东省农业科学院蔬菜研究所
<120>  全雌性型节瓜的KASP分子标记、引物及筛选方法
<130>  1
<160>  3
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  29
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
gccttaattc atctccgtgg attatagat                                    29
<210>  2
<211>  49
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
gaaggtgacc aagttcatgc tgattcgaat aaacaagaga aactagtcg              49
<210>  3
<211>  51
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
gaaggtcgga gtcaacggat tatgattcga ataaacaaga gaaactagtc a           51

Claims (8)

1.一种筛选全雌性型节瓜的引物，其特征在于，所述引物为序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、以及序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的反向引物。
2.根据权利要求1所述的筛选全雌性型节瓜的引物，其特征在于，所述反向引物的5'端连接有荧光基团FAM或HEX。
3.根据权利要求2所述的筛选全雌性型节瓜的引物，其特征在于，所述序列如SEQ IDNO.2所示的反向引物的5'端连接有荧光分子HEX，所述序列如SEQ ID NO.3所示的反向引物的5'端连接有荧光分子FAM。
4.权利要求1~3任一项所述的引物在制备筛选全雌性型节瓜的试剂盒中的应用。
5.权利要求1~3任一项所述的引物在节瓜辅助选择育种中的应用。
6.一种筛选全雌性型节瓜的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~3任一项所述的筛选全雌性型节瓜的引物。
7.一种筛选全雌性型节瓜的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以待测节瓜样品的DNA为模板，权利要求1~3任一项所述的引物为引物，进行PCR扩增，检测位于节瓜第8号染色体第14520499碱基是否发生T到C的突变；若待测节瓜样品的基因型为T:T，则待测节瓜样品为全雌性型节瓜；若待测节瓜样品的基因型为C:C，则待测节瓜样品为普通性型节瓜；若待测节瓜样品的基因型为T:C，则待测节瓜样品为杂合普通性型节瓜。
8.根据权利要求7所述的筛选全雌性型节瓜的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：95℃预变性10min；94℃变性15s，61～55℃退火1min，退火温度每循环递减0.6℃，上述过程10个循环；然后94℃变性15s，57℃延伸1min，30个循环，最后30℃运行1min。
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