CN111334597B

CN111334597B - 用于检测西瓜白粉病抗性的snp位点、kasp标记及其应用

Info

Publication number: CN111334597B
Application number: CN202010076471.6A
Authority: CN
Inventors: 许勇; 李茂营; 宫国义; 张海英; 郭绍贵; 张洁; 任毅
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2040-01-23
Also published as: CN111334597A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，提供了一种用于检测西瓜白粉病抗性的SNP位点、KASP标记及其应用。本发明提供的用于检测西瓜白粉病抗性的SNP位点为西瓜基因组2号染色体上第29421971位核苷酸T→G；所述KASP标记具有序列表中序列1或序列2所示的核苷酸序列组成；用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合包括序列表中的序列3、4和5；本发明还提供了含有上述引物序列组合的试剂盒，及上述引物组合和试剂盒的应用。本发明提供的SNP位点和KASP标记具有快速、直接、特异性高和高通量等特点，可在较短时间内完成大批量材料中抗白粉病基因的筛选和表型预测工作，可有效服务于西瓜白粉病抗病育种工作。

Description

用于检测西瓜白粉病抗性的SNP位点、KASP标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种用于检测西瓜白粉病抗性的 SNP位点、KASP标记及其应用。

背景技术

白粉病是危害葫芦科瓜类作物的重要病害之一，严重影响瓜类的产量和品质。近年来，随着保护地栽培面积的不断扩大，西瓜白粉病发病有日益严重的趋势，已经成为西瓜绿色无公害生产的重要障碍。因此，防控西瓜白粉病对改善西瓜品质、提高西瓜产量具有重要意义。

利用西瓜白粉病抗病基因进行抗病品种的选育无疑是最为安全、经济的白粉病防治措施。而进行西瓜白粉病表型鉴定时，易受温度、湿度等环境的影响，给抗病性鉴定带来了很大的阻碍。近年来广泛应用的分子标记则不受基因表达及环境的影响。因此，开发与西瓜白粉病抗性基因紧密连锁的分子标记，以辅助西瓜白粉病抗性改良，可避免繁杂耗时的抗性筛选过程、缩短育种年限，提高西瓜抗白粉病分子聚合育种的效率。

北京地区葫芦科作物白粉病菌Podosphaera xanthii(P.xanthii)的优势生理小种是2France(2F)，开展P.xanthii 2F对应的抗病基因研究将是解决西瓜白粉病问题的首要突破口。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种用于检测西瓜白粉病抗性的SNP位点、KASP标记及其应用，所述西瓜白粉病抗性基因为LOX基因。

抗白粉病西瓜品种Lvwangtuo经过发明人多年多点的抗病性鉴定，发现其具有对P.xanthii 2F具有持久抗性。抗病性鉴定及遗传分析表明，Lvwangtuo 携带一个单显性抗病基因，对该基因进行精细定位和图位克隆获得了候选抗病基因Lipoxygenase(LOX基因)。在此基础上开发与P.xanthii 2F的抗病基因连锁的分子标记，满足分子标记辅助西瓜抗白粉病育种的要求，可大大缩短育种的年限，提高育种效率。因此，在西瓜抗病育种领域的科研和实践中，在上述发现LOX基因是Lvwangtuo的白粉病抗性的单显性抗病基因的基础上，经过发明人大量的创造性劳动，开发出了一种基于LOX基因的、与西瓜白粉病抗性基因连锁的SNP位点、KASP标记及其应用。

本发明的第一个方面提供了一种用于检测西瓜白粉病抗性的SNP位点，所述SNP位点为西瓜基因组(http://cucurbitgenomics.org/,V1)2号染色体上第29421971位核苷酸T→G。

本发明的第二个方面提供了一种用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记，所述KASP标记具有序列表中序列1或序列2所示的核苷酸序列组成。

本发明的第三个方面提供了一种检测根据本发明的第二个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合，包括序列表中的序列 3、4和5：

序列3(上游引物：抗病位点结合引物)：

5’-ATCTGCAGGGAGTGCTTGTTCATT-3’；

序列4(上游引物：感病位点结合引物)：

5’-CTGCAGGGAGTGCTTGTTCATG-3’；

序列5(下游引物)：

5’-GCCATGGAGATGTCAGCTGTCTTATAT-3’。

优选地，上述序列3的引物序列的5’端还包括荧光探针序列A，所述荧光探针序列A的序列组成为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’；即，所述序列3的引物序列的5’端包括荧光探针序列A时为如下的序列(序列表中的序列6，其中下划线部分是荧光探针序列A)组成：

序列6(上游引物：抗病位点结合引物LOX-kasp4-R-F)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCAGGGAGTGCTTGTTCAT T-3’；

上述序列4的引物序列的5’端还包括荧光探针序列B，所述荧光探针序列B的序列组成为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；即，所述序列4 的引物序列的5’端包括荧光探针序列B时为如下的序列(序列表中的序列7，其中下划线部分是荧光探针序列B)组成：

序列7(上游引物：感病位点结合引物LOX-kasp4-S-F)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGCAGGGAGTGCTTGTTCATG- 3’。

本发明的第四个方面提供了一种用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒，所述试剂盒包括根据本发明的第三个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的 KASP标记的引物序列组合。

优选地，所述用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒还包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、高保真Taq酶和dNTP；

所述荧光探针A的序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接1个荧光基团HEX；

所述荧光探针B的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，5’末端连接1个荧光基团FAM；

所述淬灭探针A的序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ；

所述淬灭探针B的序列为5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，3’末端连接淬灭基团BHQ。

本发明的第五个方面提供了一种根据本发明的第三个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合，或根据本发明的第四个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒在如下任一方面上的应用：

1)检测或者辅助检测西瓜白粉病抗性基因LOX基因的基因型；

2)培育具有西瓜白粉病抗性的新品种。

本发明的第六个方面提供了一种检测或者辅助检测西瓜白粉病抗性基因 LOX基因的基因型的方法，所述方法包括如下步骤：

以待测西瓜的基因组DNA为模板，采用根据本发明的第三个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合，或者根据本发明的第四个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描；

若荧光信号为深红色，则待测西瓜的LOX基因为纯合TT基因型；

若荧光信号为蓝色，则待测西瓜的LOX基因为纯合GG基因型；

若荧光信号为绿色，则待测西瓜的LOX基因为TG基因型。

本发明的第六个方面提供了一种培育具有西瓜白粉病抗性的新品种的方法，所述方法包括：

以感白粉病、品质优良材料为受体亲本P1，与具有抗白粉病基因、品质一般的供体亲本P2配制F₁代杂交组合；再以受体亲本P1作为轮回亲本进行回交，获得BC₁F₁代回交分离群体；

对所述BC₁F₁代回交分离群体，采用根据本发明的第三个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合，或者根据本发明的第四个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取 SNP分型为TG基因型的单株继续回交(与受体亲本P1回交)，获得BC₂F₁代回交分离群体；

对所述BC₂F₁代回交分离群体，采用根据本发明的第三个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合，或者根据本发明的第四个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取 SNP分型为TG基因型的单株，继续回交n代，获得BC_nF₁代回交分离群体；

对BC_nF₁代回交分离群体，继续采用根据本发明的第三个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合，或者根据本发明的第四个方面提供的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取 SNP分型为TT基因型的单株自交，获得纯合抗白粉病株系。

优选地，所述n为3-8的整数，优选为4。

优选地，所述受体亲本P1为感白粉病的小富母本，所述供体亲本P2为抗白粉病的Lvwangtuo。

本发明在对西瓜抗白粉病基因精细定位和图位克隆的基础上，利用其候选基因LOX特异的序列，获得了SNP位点，并基于该SNP位点开发了一对 KASP标记LOX-kasp4，然后利用西瓜自然种质及遗传后代材料进行验证，验证结果证明，本发明提供的用于检测西瓜白粉病抗性的SNP位点和KASP 标记具有快速、直接、特异性高和高通量等特点，可在较短时间内完成大批量材料中抗白粉病基因的筛选和表型预测工作，可有效服务于西瓜白粉病抗病育种工作。

附图说明

图1为实施例2中利用KASP标记引物组合检测西瓜LOX基因的基因型分型结果示意图。

图中，红色为TT，绿色为TG，蓝色为TG，黑色表示空白对照，粉色可能是由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。

具体实施方式

为使本发明的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用来说明西瓜白粉病抗病基因LOX的SNP位点及KASP标记的发现。

1、供试材料

供试材料如下：

抗白粉病西瓜品种Lvwangtuo(抗病亲本)，感白粉病西瓜品种Baiwanjin (感病亲本)，抗白粉病西瓜品种Lvwangtuo与感白粉病西瓜品种Baiwanjin 杂交获得的F1代群体，F1代自交获得的3256株F2代群体。

2、供试材料白粉病抗性鉴定

将西瓜浸种催芽后播种于营养钵，随机组合排列，保持温度28/20℃ (D/N，即白天28℃、夜晚20℃)培育壮苗。至2-3叶期，采用喷雾法进行接种，接种后12-14d(“d”代表“天”，下同)感病亲本充分发病(病级至少为3级)时，对抗病亲本、感病亲本、F1代群体、F2代群体的每个单株进行苗期调查。观测时，以鉴别寄主甜瓜病情分级指数和标准(西瓜白粉病的鉴别寄主就是甜瓜，葫芦科的病原菌都能侵染西瓜，因此本发明采用甜瓜的病情分级指数和标准)，结合西瓜植株对白粉病的抗性表现，制定如下抗病鉴定标准：0级：整株无病斑；1级：仅子叶有少量病斑或茎上有少量病斑，病斑占整株的比例3％-5％；2级：茎和子叶都有少量病斑，病斑占整株的比例5％-10％；3级：茎和子叶有病斑，病斑占整株的比例10％-20％；4级：茎和子叶有较多病斑，病斑占整株的比例20％-50％；5级：茎和子叶布满病斑，真叶有病斑，病斑占整株的比例50％-80％；6级：植株因感病而死。将病情分为抗病和感病两种；其中，0、1和2级为抗病植株，3、4、5和6级为感病植株。

一共观测了1960个F2代群体的单株，其中有1357个抗病单株和603 个感病单株，卡平方检验分离比符合3：1的理论比例。综合抗病亲本、感病亲本、F1代群体和F2代群体抗病鉴定结果，表明西瓜品种Lvwangtuo对P. xanthii 2F的抗性受显性单基因控制。

3、抗白粉病基因的精细定位

依据苗期田间抗病性鉴定结果，分别选取30株经过上述鉴定的F2代抗病单株和感病单株，构建F2代抗病和感病混池，经BSR-Seq测序分析，初步确定二号染色体上存在与目标性状紧密相关的区域。通过对初定位区域进行加密(另选取12个与目标性状紧密相关的12个SNP位点)，并根据选取的与目标性状紧密相关的12个SNP位点设计引物，利用这些引物对F2代群体进行标记验证，构建连锁图，从而将白粉病抗病基因定位于标记PM-SNP4和PM-SNP5之间，利用西瓜基因组数据库提供的基因预测、注释结果，在 PM-SNP4和PM-SNP5定位区域内共有10个基因，其中有一个基因注释为 Lipoxygenase(LOX)基因，结合114个核心种质材料(参见表1)的重测序信息(Guo et al.,2019.Nature Genetics. https://doi.org/10.1038/s41588-019-0518-4)和已有的白粉病抗病基因的研究结果(Hwang etal.,2010.Plant Physiology. www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.109.147827；Wasternack et al.,2018. Annual Review of Plant Biology.https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-042817- 040440)，推测LOX基因是与西瓜抗白粉病关系密切的候选基因。表1.114个核心种质材料的白粉病抗性

分别采集接种后0h、6h、12h、24h、48h、4d和6d这七个时间点的抗病亲本和感病亲本的真叶，对上述10个候选基因的相对表达量进行实时荧光定量PCR分析。分析结果显示，在接种后的所有时间点，LOX基因在抗病亲本Lvwangtuo的叶片中相对表达量极显著上调，其他候选基因在抗病亲本的叶片中均没有明显变化，由此推断LOX是控制西瓜抗白粉病的功能基因。

4、候选SNP的获得

利用西瓜全基因测序结果，对表1中的114个核心种质材料在标记 PM-SNP4和PM-SNP5之间进行基因组序列比对，获取与西瓜材料表型性状高度符合的候选SNP位点；寻找核心种质材料中与其抗白粉病抗性密切连锁的SNP位点，发现LOX基因的编码区间内有一处SNP位点(29421971；T→G) 的变化与西瓜白粉病抗性连锁。

因此确定与西瓜白粉病抗性相关的SNP位点位于西瓜基因组2号染色体上第29421971位，即为序列表中序列1或2的第101位核苷酸。将该处SNP 位点所在的序列1所示的核苷酸序列作为KASP标记。在抗白粉病的西瓜品种中该SNP位点为TT纯合或TG杂合，在感白粉病的西瓜品种中该SNP位点为GG纯合。

因此，可以根据该处SNP位点确定待测西瓜属于抗白粉病还是感白粉病的西瓜品种，方法如下：检测待测西瓜基因组中SNP位点的基因型，若待测西瓜的SNP位点的基因型为TT纯合或TG杂合，则该待测西瓜为或候选为抗白粉的西瓜品种，若待测西瓜的SNP位点的基因型为TT纯合，则该待测西瓜为或候选为感白粉病的西瓜品种。

实施例2

本实施例用来说明LOX的SNP位点在检测西瓜白粉病抗性中的应用。

一、KASP标记引物的设计

根据实施例1中获得的SNP位点设计KASP标记引物，上述29421971 的SNP位点的KASP标记引物由两条上游引物(包括抗病位点结合引物 LOX-kasp4-R-F和感病位点结合引物LOX-kasp4-S-F)和下游引物 (LOX-kasp4-R)组成。

上游引物：

抗病位点结合引物LOX-kasp4-R-F的序列组成为：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCAGGGAGTGCTTGTTCAT T-3’；

感病位点结合引物LOX-kasp4-S-F的序列组成为：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTGCAGGGAGTGCTTGTTCATG -3’；

下游引物的序列组成为：

5’-GCCATGGAGATGTCAGCTGTCTTATAT-3’。

二、利用该SNP位点检测西瓜幼苗白粉病抗性

1、基因组DNA提取：

分别提取实施例1中1960株F2代单株的基因组DNA。

DNA提取方法在参照Murry等(1980)的方法(Murray M,Thompson W F.Rapidisolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980, 8:668-673.)的基础上改进而成；具体步骤如下：

1)取前述1960株F2代单株的叶片1.5克，在液氮中研磨成粉末，再加入9mL的2％CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巯基乙醇)，混匀，于65℃水浴1 小时，得到混合物A；

2)停止水浴，加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液，混匀后冰浴20分钟；再加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)抽提两次，得到上清液B；

3)向上清液B中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA；再用洗涤缓冲液 (75％乙醇，10mM乙酸铵)洗涤一次，吹干后加TE缓冲液(10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH7.4)溶解，得到溶液C；

4)向溶液C中加入RNase A，使其终浓度达100μg/mL，混匀后37℃水浴1小时；再用等体积氯仿/异戊醇(体积比24:1)抽提一次，得到上清液D；

5)向上清液D中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到 DNA沉淀；

6)用70％乙醇(体积分数为70％)洗涤DNA沉淀，吹干后加适量ddH₂O 溶解DNA，得到基因组DNA；再用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以OD260值测定的基因组DNA的浓度，再用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的提取质量。

2、PCR扩增和基因型检测

1)以上述步骤1提取的F2各单株的基因组DNA为模板，用 LOX-kasp4-R-F、LOX-kasp4-S-F和LOX-kasp4-R混合引物进行PCR扩增，采用英国LGC(Laboratory of theGovernment Chemist)实验平台检测基因型。

如果引物LOX-R-F和LOX-R组合完全匹配基因组DNA，检测结果荧光信号则为深红色(参考图1中上图的左上角处所示的一团圆点)，表示检测的植株为纯合TT基因型；检测结果荧光信号若为蓝色(参考图1中上图的右下角处所示的一团圆点)，表示检测的植株为纯合GG基因型；检测结果荧光信号若为绿色(参考图1中上图的中间部位处所示的一团圆点)，表示检测的植株为杂合TG基因型。

2)PCR扩增反应的反应程序为：

94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸 1min，继续扩增26个循环。

3)完成步骤2)后，待PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断1960个F2代单株的基因型。

具体的判断原则如下：如果某供试西瓜材料基于该SNP位点显示蓝色荧光信号，则其基因型为纯合GG；如果显示深红色荧光信号，则其基因型为 TT；如果显示绿色荧光信号，则其基因型为TG。

4)检测结果与效率评价

检测的1960份F2代群体的植株(每个材料均有3次重复)的结果如图 1所示。

图1示出了1960份F2代群体的植株的分型情况，每个圆点代表一个植株的检测结果；其中左上角处、即聚合在接近Y轴的一团圆点表示检测的植株为纯合TT基因型，检测到的荧光信号为深红色；右下角处、即聚合在接近X轴的一团圆点表示检测的植株为纯合GG基因型，检测到的荧光信号为蓝色；中间部位处所示的一团圆点表示检测的植株为杂合TG基因型，检测到的荧光信号为绿色。图中靠近坐标轴原点处的黑色为空白对照；如果存在显示粉色的样本，可能是由于DNA质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型。

根据检测结果和实际的田间抗病性鉴定结果(田间抗病性鉴定的检测方式和结果参见实施例1)一致，在这1960份F2代群体的植株中，本发明的方法检测到的白粉病抗性的准确率为100％。

实施例3

本实施例用来说明LOX的SNP位点和KASP标记的引物序列组合在培育具有西瓜白粉病抗性的新品种中的应用。

以感白粉病P.xanthii 2F的材料小富母本(感白粉病，但西瓜品质优良) 为受体亲本(P1)，与抗白粉病P.xanthii 2F的Lvwangtuo(具有白粉病抗病基因，但西瓜品质一般)为抗病基因供体亲本(P2)，配制F₁代杂交组合。再以小富母本(P1)作为轮回亲本进行回交，获得BC₁F₁代群体。

对BC₁F₁代群体，利用实施例1获得的用于检测西瓜白粉病抗性的SNP 位点、KASP标记引物组合，采用实施例2中的方法进行基因型检测，选取基因型为杂合(SNP分型为TG基因型)的单株继续回交(与受体亲本小富母本回交，下同)，获得回交分离群体BC₂F₁。

对BC₂F₁代群体，继续利用实施例1获得的用于检测西瓜白粉病抗性的 SNP位点、KASP标记引物组合，采用实施例2中的方法进行基因型检测，选取基因型为杂合(SNP分型为TG基因型)的单株继续回交，获得回交分离群体BC₃F₁。

对BC₃F₁代群体，继续利用实施例1获得的用于检测西瓜白粉病抗性的 SNP位点、KASP标记引物组合，采用实施例2中的方法进行基因型检测，选取基因型为杂合(SNP分型为TG基因型)的单株继续回交，获得回交分离群体BC₄F₁。

对BC₄F₁代群体，继续利用实施例1获得用于检测西瓜白粉病抗性的SNP 位点、KASP标记引物组合，采用实施例2中的方法进行基因型检测，选取基因型为纯合(SNP分型为TT基因型)的单株自交，获得纯合抗病株系。

在转育过程中，随着回交代数的增加，转育至BC₄代的果实品质和外观性状非常接近转育的轮回亲本小富母本，进一步将BC₄进行了自交，通过用于检测西瓜白粉病抗性的SNP位点、KASP标记引物组合对LOX基因的筛选，培育出符合目标性状、又抗白粉病的稳定自交系，显著提高了育种效率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 用于检测西瓜白粉病抗性的SNP位点、KASP标记及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus)

<400> 1

tatgaaaaca aattaatctt taaacagact agtgcccgat accaactact actatgaatt 60

ttttacctcc tgatgagatc tgcagggagt gcttgttcat taaaaatcca gtccttatat 120

aagacagctg acatctccat ggcatatttg gatggaaaca ctgttgcttc caaaatgcca 180

cctgcattaa tgagtatctg t 201

<210> 2

<211> 201

<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus)

<400> 2

tatgaaaaca aattaatctt taaacagact agtgcccgat accaactact actatgaatt 60

ttttacctcc tgatgagatc tgcagggagt gcttgttcat gaaaaatcca gtccttatat 120

aagacagctg acatctccat ggcatatttg gatggaaaca ctgttgcttc caaaatgcca 180

cctgcattaa tgagtatctg t 201

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctgcaggg agtgcttgtt catt 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgcagggag tgcttgttca tg 22

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccatggaga tgtcagctgt cttatat 27

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat tatctgcagg gagtgcttgt tcatt 45

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaggtgacc aagttcatgc tctgcaggga gtgcttgttc atg 43

Claims

1.一种用于检测西瓜白粉病抗性的KASP引物组合，其特征在于，所述引物组合由两条上游引物和一条下游引物组成，其核苷酸序列分别如序列表中序列3-5所示；所述序列3的5’末端连接荧光基团HEX；所述序列4的5’末端连接荧光基团FAM。

2.一种用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP引物组合。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒还包括高保真Taq酶和dNTP。

4.权利要求1所述的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP引物组合，或者权利要求2或3所述的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒在如下任一种中的应用：

1）检测或者辅助检测西瓜白粉病抗性基因LOX基因的基因型；

2）培育具有西瓜白粉病抗性的新品种西瓜。

5.一种检测或者辅助检测西瓜白粉病抗性基因LOX基因的基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以待测西瓜的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP引物组合，或者权利要求2或3所述的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描；

若荧光信号为蓝色，则待测西瓜的LOX基因为纯合GG基因型；

若荧光信号为绿色，则待测西瓜的LOX基因为TG基因型。

6.一种培育具有西瓜白粉病抗性的新品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

对所述BC₁F₁代回交分离群体，采用权利要求1所述的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合，或者权利要求2或3所述的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取SNP分型为TG基因型的单株继续回交，获得BC₂F₁代回交分离群体；

对所述BC₂F₁代回交分离群体，采用权利要求1所述的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合，或者权利要求2或3所述的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取SNP分型为TG基因型的单株，继续回交至BC₄代，获得BC₄F₁代回交分离群体；

对BC₄F₁代回交分离群体进一步进行了自交，继续采用权利要求1所述的用于检测西瓜白粉病抗性的KASP标记的引物序列组合，或者权利要求2或3所述的用于检测西瓜白粉病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取SNP分型为TT基因型的单株自交，获得纯合抗白粉病株系。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述受体亲本P1为感白粉病的小富母本，所述供体亲本P2为抗白粉病的Lvwangtuo。