CN113897352B - 玉米南方锈病抗性基因紧密连锁标记及其应用 - Google Patents

玉米南方锈病抗性基因紧密连锁标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米南方锈病抗性基因紧密连锁标记及其应用。本发明保护特异引物对，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单链DNA分子组成。本发明利用不同材料序列的插入/缺失所设计特异性标记组合，利用该标记通过毛细管电泳技术可快速准确的鉴定不同玉米材料的南方锈病抗性，能够解决在南方锈病高发地之外的地区鉴定困难、周期长等难题；同时，能够克服RFLP、RAPD、AFLP等检测方法存在的操作复杂、稳定性和重复性差以及费用昂贵等缺点。本发明提供的分子标记鉴定方法操作简单，检测结果准确可靠，可用于玉米南方锈病抗性的鉴定及辅助选择育种，能够克服常规育种年限长和效率低等困难。

Description

玉米南方锈病抗性基因紧密连锁标记及其应用
技术领域
本发明涉及一种玉米南方锈病抗性基因紧密连锁标记及其应用。
背景技术
玉米是我国种植面积最大，总产量最高的粮食和经济作物，在国民经济中占有重要地位。玉米病害是影响产量和品质的重要因素。随着全球气候变化，耕作方式改变和新品种的推广，我国玉米病害的发生也有所改变，以往的一些次要病害(如锈病、瘤黑粉病等)上升为主要病害，对玉米的安全生产构成很大威胁。玉米南方锈病是由多堆柄锈菌Pucciniapolysora Underw.引起的全球性真菌病害，主要分布在热带和亚热带地区，是一种危害极大的气传病害。近年来，该病害有向我国北方蔓延的趋势，一旦暴发、流行，一般引起减产20～30％，严重可高达80％以上，甚至绝收。由于传统的化学药剂的防治会导致病原菌的耐药性、环境污染及农药残留等诸多弊端，使其应用受到越来越多的限制。利用寄主自身的抗病性，既可以防治病害又可以减少农药的使用。因此，培育持久有效的抗病品种是解决病害问题的根本有效途径。
目前，我国玉米育种过程中，针对南方锈病，所利用的抗源材料大多来自于热带自交系，抗源过于单一。单一抗源难以抵御生理小种的变异，如美国利用抗性基因Rpp9成功控制南方锈病30年之久，近年来由于南方锈病生理小种发生致病性变异，致使Rpp9在非洲和夏威夷等地区基本失去抗性；美国原始的抗病自交系和来自抗源PI186208的杂交种也出现不同程度感病，Rpp9的抗性已基本丧失。因此，不断发掘新的抗源和抗性基因，拓宽玉米抗病资源的种质基础，为抗病基因的分子克隆及抗病机理的解析奠定基础。并且针对抗病基因开发分子标记，通过分子标记辅助选择的手段选育抗病优良自交系和杂交种，对加快新品种培育进程具有重要推动作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米南方锈病抗性基因紧密连锁标记及其应用。
第一方面，本发明保护特异引物对；所述特异引物对由引物F和引物R组成；
所述引物F为如下(a1)或(a2)：
(a1)SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；
(a2)将SEQ ID No.1经过一个或几个核苷酸的取代且与SEQ ID No.1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R为如下(a3)或(a4)：
(a3)SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；
(a4)将SEQ ID No.2经过一个或几个核苷酸的取代且与SEQ ID No.2具有相同功能的DNA分子。
所述特异引物对的用途为如下(b1)-(b6)中的至少一种：
(b1)鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性；
(b2)筛选或辅助筛选玉米南方锈病抗病植株；
(b3)筛选或辅助筛选玉米南方锈病感病植株；
(b4)制备用于鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性的试剂盒；
(b5)制备用于筛选或辅助筛选玉米南方锈病抗病植株的试剂盒；
(b6)制备用于筛选或辅助筛选玉米南方锈病感病植株的试剂盒。
第二方面，本发明保护前文所述特异引物对的应用，为如下(b1)-(b6)中的至少一种：
(b1)鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性；
(b2)筛选或辅助筛选玉米南方锈病抗病植株；
(b3)筛选或辅助筛选玉米南方锈病感病植株；
(b4)制备用于鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性的试剂盒；
(b5)制备用于筛选或辅助筛选玉米南方锈病抗病植株的试剂盒；
(b6)制备用于筛选或辅助筛选玉米南方锈病感病植株的试剂盒。
第三方面，本发明保护含有前文所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c3)中的至少一种：
(c1)鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性；
(c2)筛选或辅助筛选玉米南方锈病抗病植株；
(c3)筛选或辅助筛选玉米南方锈病感病植株。
第四方面，本发明保护所述前文试剂盒的制备方法，包括将前文所述的特异引物对中的各条引物进行独立包装的步骤。
第五方面，本发明保护鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性的方法，包括如下步骤：
(1)检测待测玉米基因型，方法如下：提取待测玉米的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用上述特异引物对对模板进行毛细管电泳检测，如果扩增产物含有156bp大小的扩增片段且不含有148bp大小的扩增片段，则待测玉米基因型为156/156；如果扩增产物含有148bp大小的扩增片段且含有156bp大小的扩增片段，则待测玉米基因型为148/156；如果扩增产物含有148bp大小的扩增片段且不含有156bp大小的扩增片段，则待测玉米基因型为148/148；
(2)根据步骤(1)的分型结果，判断玉米南方锈病抗性；
基因型为156/156的植株对南方锈病的抗性高于基因型为148/156和148/148的植株；基因型为148/156的植株对南方锈病的抗性高于基因型为148/148的植株；
基因型为156/156和148/156的玉米植株表现为抗南方锈病；
基因型为148/148的玉米植株表现为感南方锈病。
第六方面，本发明保护筛选或辅助筛选南方锈病抗病玉米植株的方法，包括如下步骤：
(d1)按照第五方面所述方法鉴定玉米南方锈病抗性；
(d2)基于步骤(d1)的结果筛选南方锈病抗病植株。
第七方面，本发明保护筛选或辅助筛选南方锈病感病玉米植株的方法，包括如下步骤：
(e1)按照第五方面所述方法鉴定玉米南方锈病抗性；
(e2)基于步骤(e1)的结果筛选南方锈病感病植株。
第八方面，本发明保护前文所述的特异引物对或前文任一所述的方法在玉米育种中的应用。
所述育种的目的是为了筛选南方锈病抗病玉米植株或南方锈病感病玉米植株。
第九方面，本发明保护玉米育种方法，为方法A或方法B。
所述方法A包括如下步骤：将前文第六方面所述方法筛选得到的南方锈病抗病玉米自交系作为育种材料。
所述方法B包括如下步骤：将前文第七方面所述方法筛选得到的南方锈病感病玉米自交系作为育种材料。
以上任一待测玉米具体可为玉米品种京92或玉米自交系京2416K或二者的后代。
所述后代具体可为将京2416K作为受体亲本，京92作为轮回亲本，通过3次回交，1次自交得到的后代。
本发明提供了一种用于鉴定玉米南方锈病抗性的分子标记。本发明利用不同材料序列的插入/缺失所设计特异性标记组合，利用该标记通过毛细管电泳技术可快速准确的鉴定不同玉米材料的南方锈病抗性，能够解决在南方锈病高发地之外的地区鉴定困难、周期长等难题；同时，能够克服RFLP、RAPD、AFLP等检测方法存在的操作复杂、稳定性和重复性差以及费用昂贵等缺点。本发明提供的分子标记鉴定方法操作简单，检测结果准确可靠，可用于玉米南方锈病抗性的鉴定及辅助选择育种，能够克服常规育种年限长和效率低等困难。
附图说明
图1为分子标记位置信息。
图2为京2416K和京92毛细管电泳检测结果。
图3为各基因型分型示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
玉米自交系京2416：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20080695.5，授权公告号：CNA004319G，玉米自交系京2416为高感南方锈病表型。
玉米自交系京2416K：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20170479.9，申请公告号：CNA017957E，玉米自交系京2416K为高抗南方锈病表型。
玉米品种京92：由北京市农林科学院玉米研究中心选育，新品种申请号：20110276.0，申请公告号：CNA005911G，玉米自交系京92为高感南方锈病表型。
实施例1、抗性基因精细定位及分子标记的发现
一、抗性基因精细定位
以玉米自交系京2416和京2416K为基础材料，将其配置F1杂交种，将F1代自交获得京2416×京2416K的F2分离群体，用于分子标记分析。所有实验材料种植于玉米南方锈病高发地海南三亚。10月中旬播种，F2群体鉴定材料随机排列，单行种植。每份材料播种行长5m，行距0.55m，每行留苗20～25株，每50行设玉米自交系京2416K和玉米自交系京2416为高抗和高感对照材料1组。按一般大田生产进行田间管理。
抗性鉴定在海南三亚依靠自然发病进行。在玉米乳熟期至蜡熟期(约授粉后15天)进行调查。调查重点部位为玉米果穗的上方和下方3叶。采用1、3、5、7、9级的分级标准，根据病害症状描述，逐份材料记载病情级别，再根据病情级别进行抗病性综合评价。病情分级标准：1级(HR)：叶片上无病斑；3级(R)：叶片上锈病孢子堆占叶片面积少于25％；5级(MR)：叶片上锈病孢子堆占叶片面积26％～50％；7级(S)：叶片上锈病孢子堆占叶片面积51％～75％；9级(HS)：叶片上锈病孢子堆占叶片面积76％～100％，叶片枯死。
统计京2416×京2416K的F2分离群体中抗、感单株的数量，计算分离比，进行遗传分析。利用混合群体分离分析法(Bulk Segregant Analysis,BSA)对抗性基因进行初定位。在F2群体中分别选取30个极端抗、感表型的单株按DNA等量混合构建抗、感池。DNA样品检测合格后，采用超声波将基因组DNA进行片段化处理，构建DNA小片段文库(350bp)，利用Illumina Hiseq2500测序仪对双亲及抗、感混池进行高通量测序，测序深度为30×。使用突变分析软件GATK中检测群体SNP和INDEL的方法，再根据质量值、深度、重复性等因素做进一步的过滤筛选，最终得到高可信度的变异位点，使用ANNOVAR软件及已公布的B73的基因组(B73 RefGen_v4)注释文件对检测到的候选SNP/INDEL进行相应的注释。结合SNP-index和InDel-index两种算法，完成目标基因进行初定位。最后，根据该基因的初定位结果和双亲重测序数据，在候选区间内利用InDel位点设计引物，用于精细定位。
利用改良的CTAB法提取亲本及F2群体中感病单株的基因组DNA。利用筛选的多态性标记对所有单株进行基因型鉴定。群体基因型分型利用毛细管电泳法进行。PCR体系(20μl)：2×Taq Mix，10μl；引物(20pmol)，0.25μl；DNA(50ng/μl)，2μl；ddH2O，7.75μl。PCR程序：94℃5min；95℃40s，60℃35s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
玉米自交系京2416表现为高感南方锈病，自交系京2416K表现为高抗南方锈病。京2416×京2416K的F1植株表现高抗南方锈病，而F2群体则出现了明显的表型分离，调查发现F2群体中抗病植株与感病植株的分离比接近3:1(2.94,χ2 0.05＝0.904<3.841)，表明该抗性基因是一个单显性核基因(表1)。
表1、J2416×京2416K F2群体分离统计
Figure BDA0002549851480000051
对亲本京2416、京2416K以及抗、感池进行BSA重测序分析，结合SNP-index与Indel-index分析的方法进行共定位，将该基因锚定在10号染色体短臂，二者共定位区间在3.6Mb。根据BSA初定位结果，利用F2群体中79个极端感病单株和区间内9对InDel标记，将该抗性基因定位于标记I13-2与I16-4之间；进一步扩大F2群体，利用631高感锈病单株，7个标记I13-2(物理位置：1247979-1248094)、I14-1(物理位置：1461839-1462039)、I14-2(物理位置：1468968-1469225)、I15-1(物理位置：1513514-1513756)、I15-2(物理位置：1562444-1562693)、I15-5(物理位置：1586583-1586728)、I16-4(物理位置：1697170-1697418)位置的交换单株分别是69、39、33、18、9、5、3个交换单株。根据交换单株的数量表明标记I15-5和I16-4是离京2416K中的抗南方锈病基因连锁最紧密的标记，位于10号染色体短臂第1586583和1697170碱基，分子标记序列如图1和表2所示。
表2、分子标记信息
Figure BDA0002549851480000052
Figure BDA0002549851480000061
实施例2、分子标记在鉴定玉米南方锈病抗性中的应用
玉米品种京92是由北京市农林科学院玉米研究中心选育的优良自交系，是我国第一大玉米主栽品种京科968的父本。京92配合力高，农艺性状优良，但是对南方锈病敏感。
本实施例以对玉米南方锈病高抗的自交系京2416K作为抗源，对京92进行抗病性改良。将京2416K作为受体亲本，京92作为轮回亲本，拟通过3次回交，1次自交筛选获得抗锈京92。选取按照上述方法获得的40份回交改良单株进行抗锈京92筛选。
1、对京2416K、京92和40份回交改良单株进行基因型分型检测。
基因型分型检测方法为：以待测植株的基因组DNA为模板，采用I15-5分子标记进行PCR扩增并经过毛细管电泳检测，如果扩增产物含有156bp大小的扩增片段且不含有148bp大小的扩增片段，则基因型分型为156/156；如果扩增产物含有148bp大小的扩增片段且含有156bp大小的扩增片段，则基因型分型为148/156；如果扩增产物含有148bp大小的扩增片段且不含有156bp大小的扩增片段，则基因型分型为148/148。
PCR扩增体系(20μl)：2×Taq Mix，10μl；引物(20pmol)，0.25μl；DNA(50ng/μl)，2μl；ddH2O，7.75μl。
PCR程序：94℃5min；95℃40s，58℃35s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
亲本京2416K和京92的检测结果见图2。其中图2A为京2416K检测结果，京2416K基因型为156/156；图2B为京92检测结果，京92基因型为148/148。
各基因型分型示意图见图3。其中图3A为156/156基因型；图3B为148/156基因型；图3C为148/148基因型。
40份回交改良单株的基因型分型检测结果见表3。
2、对京2416K、京92和40份回交改良单株进行抗性鉴定。
表型鉴定在海南三亚依靠自然发病进行。在玉米乳熟期至蜡熟期(约授粉后15天)进行调查。调查重点部位为玉米果穗的上方和下方3叶。采用1、3、5、7、9级的分级标准，根据病害症状描述，逐份材料记载病情级别，再根据病情级别进行抗病性综合评价。病情分级标准：1级(HR)：叶片上无病斑；3级(R)：叶片上锈病孢子堆占叶片面积少于25％；5级(MR)：叶片上锈病孢子堆占叶片面积26％～50％；7级(S)：叶片上锈病孢子堆占叶片面积51％～75％；9级(HS)：叶片上锈病孢子堆占叶片面积76％～100％，叶片枯死。
亲本京2416K表现高抗玉米南方锈病，病情分级为1级(HR)；
亲本京92表现高感玉米南方锈病，病情分级为9级(HS)。
40份回交改良单株的表型鉴定统计结果见表3。结果显示，基因型分型为156/156的植株中，病情分级均为1级(HR)，表现为抗病表型；基因型分型为148/156的植株病情分级均为3级(R)，表现为抗病表型；基因型分型为148/148的植株病情分级均为9级(HS)，表现为感病表型。
表3、40份玉米回交群体材料和抗病位点基因型
材料名称 表型 基因型分型 材料名称 表型 基因型分型
京92K-1 HR 156/156 京92K-21 R 148/156
京92K-2 R 148/156 京92K-22 R 148/156
京92K-3 HR 156/156 京92K-23 HR 156/156
京92K-4 HR 156/156 京92K-24 HR 156/156
京92K-5 R 148/156 京92K-25 HS 148/148
京92K-6 R 148/156 京92K-26 R 148/156
京92K-7 HR 156/156 京92K-27 HS 148/148
京92K-8 HS 148/148 京92K-28 HS 148/148
京92K-9 R 148/156 京92K-29 HS 148/148
京92K-10 HR 156/156 京92K-30 HS 148/148
京92K-11 HS 148/148 京92K-31 HS 148/148
京92K-12 R 148/156 京92K-32 HS 148/148
京92K-13 R 148/156 京92K-33 R 148/156
京92K-14 R 148/156 京92K-34 HS 148/148
京92K-15 R 148/156 京92K-35 R 148/156
京92K-16 HS 148/148 京92K-36 HR 156/156
京92K-17 HS 148/148 京92K-37 R 148/156
京92K-18 HR 156/156 京92K-38 HR 156/156
京92K-19 HR 156/156 京92K-39 HS 148/148
京92K-20 HR 156/156 京92K-40 HS 148/148
上述结果表明，应用I15-5分子标记对回交群体基因型分型得出的抗病结果与田间抗性表型一致，证实此分子标记可用于玉米材料的南方锈病抗性鉴定。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 玉米南方锈病抗性基因紧密连锁标记及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaagggtcgg actcattt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccttgtataa cggcttgg 18

Claims (10)

1.特异引物对；所述特异引物对由引物F和引物R组成；
所述引物F为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；
所述引物R为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述特异引物对的应用，为如下（b1）-（b6）中的至少一种：
（b1）鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性；
（b2）筛选或辅助筛选玉米南方锈病抗病植株；
（b3）筛选或辅助筛选玉米南方锈病感病植株；
（b4）制备用于鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性的试剂盒；
（b5）制备用于筛选或辅助筛选玉米南方锈病抗病植株的试剂盒；
（b6）制备用于筛选或辅助筛选玉米南方锈病感病植株的试剂盒。
3.含有权利要求1所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下（c1）-（c3）中的至少一种：
（c1）鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性；
（c2）筛选或辅助筛选玉米南方锈病抗病植株；
（c3）筛选或辅助筛选玉米南方锈病感病植株。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1所述的特异引物对中的各条引物进行独立包装的步骤。
5.鉴定或辅助鉴定玉米南方锈病抗性的方法，包括如下步骤：
（1）检测待测玉米基因型，方法如下：提取待测玉米植株的基因组DNA；以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的特异引物对对模板进行PCR扩增并通过毛细管电泳检测，如果扩增产物含有156bp大小的扩增片段且不含有148bp大小的扩增片段，则待测玉米基因型为156/156；如果扩增产物含有148bp大小的扩增片段且含有156bp大小的扩增片段，则待测玉米基因型为148/156；如果扩增产物含有148bp大小的扩增片段且不含有156bp大小的扩增片段，则待测玉米基因型为148/148；
（2）根据步骤（1）的分型结果，判断玉米南方锈病抗性；
基因型为156/156的植株对南方锈病的抗性高于基因型为148/156和148/148的植株；基因型为148/156的植株对南方锈病的抗性高于基因型为148/148的植株；
基因型为156/156和148/156的玉米植株表现为抗南方锈病；
基因型为148/148的玉米植株表现为感南方锈病。
6.筛选或辅助筛选玉米南方锈病抗病植株的方法，包括如下步骤：
（d1）按照权利要求5所述方法鉴定玉米南方锈病抗性；
（d2）基于步骤（d1）的结果筛选玉米南方锈病抗病植株。
7.筛选或辅助筛选玉米南方锈病感病植株的方法，包括如下步骤：
（e1）按照权利要求5所述方法鉴定玉米南方锈病抗性；
（e2）基于步骤（e1）的结果筛选玉米南方锈病感病植株。
8.权利要求1所述的特异引物对，或，权利要求5-7任一所述的方法在玉米育种中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述育种的目的是为了筛选南方锈病抗病玉米自交系或南方锈病感病玉米自交系。
10.玉米育种方法，为方法A或方法B；
所述方法A包括如下步骤：将权利要求6筛选得到的南方锈病抗病玉米自交系作为育种材料；
所述方法B包括如下步骤：将权利要求7筛选得到的南方锈病感病玉米自交系作为育种材料。
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