CN103108541A

CN103108541A - 与玉米热带锈病（玉米壳锈菌）抗性相关联的基因座

Info

Publication number: CN103108541A
Application number: CN2010800604637A
Authority: CN
Inventors: S·C·K·米拉赫; V·拉卡; M·G·布特勒伊勒; E·林伯格; E·D·O·阿尔贝斯
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2009-11-04
Filing date: 2010-11-03
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2030-11-03
Also published as: CN103108541B; CN105063195A; WO2011056836A3; US8809623B2; CA2778828A1; WO2011056836A2; AR078912A1; BR112012010479A2; MX341421B; EP2496072A2; MX2012005252A; US20110107453A1; IN2012DN03427A

Abstract

本发明涉及用于鉴定具有提高的或降低的热带锈病抗性的玉米植株的方法和组合物。所述方法使用分子标记以鉴定并选择具有提高的热带锈病抗性的植株或鉴定并反选具有降低的热带锈病抗性的植株。通过本发明方法产生的玉米植株也是本发明的一个特征。用于关联等位基因变异与受关注性状的方法也是受关注的。

Description

与玉米热带锈病(玉米壳锈菌)抗性相关联的基因座

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2009年11月4日的美国临时申请61/257,977的优先权，该临时申请全文以引用方式并入本文。

发明领域

本公开涉及用于提高植株对热带锈病抗性的组合物和方法和用于鉴定与受关注的性状相关联的等位基因变异的方法。

发明背景

热带锈病是由病原体玉米壳锈菌(Physopella zeae(Mains)Cummins&Ramachar)(与Angiopsora zeae Mains同义)引起的真菌病害，其以前归类为Angiopsora zeae Mains(Donald G.White，编辑，1999.Compendium of corn diseases.第三版.APS Press，ISBN 0-89054-234-1)。热带锈病能够快速发展，在短时间内杀死植株。

病害管理策略包括作物轮作、通过耕作破坏以前的玉米残留、以及施用杀真菌剂，全部这些方法旨在减少真菌种菌。然而，控制热带锈病的最有效并且最优选的方法是种植抗病杂交种。

通过减少真菌种菌控制热带锈病的方法需要农民方面附加的时间和资源，并且此外可能对环境产生破坏效应。这使得种植抗病杂交种对农民和一般公众来说甚至更有吸引力。因此，希望提供鉴定并选择具有对热带锈病提高抗性的玉米植株的组合物和方法。

发明概述

提供了鉴定并选择具有对热带锈病提高抗性的玉米植株的组合物和方法。还提供了标记辅助选择具有对热带锈病提高抗性的植株的方法。

在一个实施方案中，提供了选择对热带锈病具有提高抗性的玉米植株或种质的方法，所述方法检测与PHMTR(SEQ ID NO：155)位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167位点337-339处的“GAG”单倍型连锁并关联的第一标记基因座的至少一种等位基因的存在，并且选择包含连锁并关联PHMTR(SEQ ID NO：155)的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型的第一标记基因座的至少一种等位基因的玉米植株或种质。在单一减数分裂图谱上，所述第一标记基因座的至少一个等位基因可与PHMTR(SEQ ID NO：155)位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167位点337-339处的“GAG”单倍型连锁并关联至多20cM。

在另一个实施方案中，提供了选择对热带锈病具有提高抗性的玉米植株或种质的方法，所述方法检测PHMTR(SEQ ID NO：155)的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型；并且选择包含PHMTR(SEQ ID NO：155)的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型的玉米植株或种质。

在另一个实施方案中，提供了鉴定对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法，所述方法使用标记基因座序列、一部分标记基因座序列、或标记基因座序列的互补序列、或它们的一部分作为标记探针检测玉米植株基因组中的标记基因座。所述标记探针在严格条件下杂交到介于下述序列之间并包括它们的连续DNA上：SEQ ID NO：89或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：89具有95％的同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO：96或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：96具有95％的同一性的核苷酸序列，并且所述标记基因座包含与对热带锈病的提高抗性相关联的至少一个等位基因。

在另一个实施方案中，提供了鉴定对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法，所述方法检测与所述玉米植株的种质中提高的抗性相关联的至少一个标记等位基因。标记基因座可选自任一个以下标记基因座：PHM1192-26-U、PHM1192-4-U、C00435-802-U、C00436-801-U、PHM187-7-U、C00423-801-U、PHM5028-24-U、PHM13818-15-U、PHM15721-39-U、PHM15721-180-U、C00441-801-U、C00441-802-U、PHM4370-19-U、 PHM731-107-U、C00071-01-U、PHM8249-21-U、C00428-801-U、PHM18427-13-U、PHM9535-10-U、PHM9535-6-U、PHM9535-7-U和PHM4003-13-U；PHM标记PHM15590、PHM13818、PHM1192、PHM187、PHM5028、PHM4370、PHM731和PHM15721；Sub2e、Sub9d、Sub19c、Sub23m、C06621-1-K2和C06621-1-K4；以及与这些标记连锁的任何其它标记。标记基因座也存在于染色体10上的任何以下区间内，其包含并侧接：

i.PHM15590和PHM9535；

ii.PHM15590和PHM15721；

iii.C00441和C00428；

iv.PHM731和PHM15721；和

v.C00071和PHM731。

标记基因座包含与增强的热带锈病抗性相关联的至少一个等位基因。

在另一个实施方案中，提供了鉴定对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法，所述方法检测与对热带锈病的提高抗性相关联的玉米植株种质中的单倍型。所述单倍型在一个或多个标记基因座上包含等位基因，其中所述一个或多个标记基因座存在于染色体10上的任何以下区间内，其包含并侧接：

i.PHM15590和PHM9535；

ii.PHM15590和PHM15721；

iii.C00441和C00428；

iv.PHM731和PHM15721；和

v.C00071和PHM731。

所述单倍型可包含PHMTR的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”。

在另一个实施方案中，提供了选择对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法。在该方法中，获取第一玉米植株，其中所述玉米植株具有标记基因座的至少一个等位基因，所述标记基因座位于染色体10上的任何以下区间内，其包含并侧接：

i.PHM15590和PHM9535；

ii.PHM15590和PHM15721；

iii.C00441和C00428；

iv.PHM731和PHM15721；和

v.C00071和PHM731；

并且所述等位基因与对热带锈病的提高抗性相关联。所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交，并且对所得子代植株进行第一玉米植株的等位基因的评价。然后选择具有所述第一玉米植株的等位基因的子代植株作为对热带锈病具有提高抗性的植株。

在另一个实施方案中，提供了选择对热带锈病具有提高抗性的玉米植株的方法。在该方法中，获取第一玉米植株，其中所述玉米植株在其基因组中包含PHMTR的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型。所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交，并且对所得子代植株进行PHMTR的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型的评价。然后选择具有PHMTR的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型的子代植株作为对热带锈病具有提高抗性的植株。

此外，通过上述方法鉴定或选择的玉米植株是受关注的，其中所述植株不是CML339。此外，由上述方法鉴定或选择的玉米植株的子代是受关注的。

在另一个实施方案中，提供了鉴定与期望的性状形式相关联的等位基因变异的方法。在这些方法中，比对开放：延伸代价比大于10的原始序列并通过修剪尾部除去背景噪音。然后修剪随机的等位基因变异，并使用非加权配对组算数平均法(UPGMA)。重复进行随机等位基因变异的修剪和应用UPGMA于比对直至鉴定出表型关系图。然后可从表型关系图中鉴定与受关注的表型相关联的等位基因变异。

附图和序列表说明

根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表构成本专利申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Research 13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(No.2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，2)：345-373(1984)，所述文献全文以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。

图1示出定位BAC的物理图谱排列(获取自Maize Genome Browser，它在因特网上公开可用)，它装配到染色体10区域上，该区域由c0497L12和b0191E02定位并包括它们。示出了本文所述的PHM标记位点(由PHM15590和PHM15721定位并包括它们的区域)，它们是位于所述区间内的公开标记位点。

图2A和2B分别示出了热带和南方锈病评分的PH468x PHS6Y F2种群的频率分布。

图3示出了使用PH468x PHS6Y F2种群获得的混合区间作图结果。在染色体10的短臂上鉴定显著性峰。在x轴上的标记位点对应于PHB基因图谱。y轴代表LOD评分。

图4(a)易感自交系和使用PHS6Y作为供体亲本的对应抗性转化。(b)用易感型自交系制得的杂交体。(c)用相同自交系的抗性(“转化的”)型制得的杂交体。这显示热带锈病基因在杂交水平上具有显性效应。

图5示出对热带锈病(左侧)高度易感的杂交体和已经从PHS6Y转化成具有提高抗性的相同杂交体(右侧)。

图6示出用作引物设计参考的公开BAC克隆，其用于对热带锈病抗性的和易感的基因型玉米品系。关于BAC重叠的内部信息用于进一步将2-2.5Mb区域的序列顺序缩小至24个子区域。

图7示出通过对热带锈病抗性的和易感的玉米品系的基因分型获得的部分参考序列(顶部)，所述基因分型使用设计用于克隆ID Ct9050c064G11c的PCR引物(SEQ ID NO：133和134)(表9)。SEQ ID NO：137-142示出获取自抗性品系的扩增子，而SEQ ID NO：143-154示出获取自易感品系的扩增子。用灰色突出显示的区域示出参考序列(称为PHMTR；SEQ ID NO：155)的21bp区域。在bp16具有T-缺失的玉米品系(用箭头示出)都显示对热带锈病的提高抗性并具有序列SEQ ID NO：156。

图8示出使用引物SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136获得的扩增子序列的部分比对。发现“GAG”单倍型(框内)是全部具有提高热带锈病抗性的品系独有的。

本文所附的序列描述和序列表遵循在37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的用于专利申请公开中的核苷酸和/或氨基酸序列的规定。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB标准的核苷酸序列的单字母编码和氨基酸序列的三字母编码，IUPAC-IUBMB标准描述于Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)和Biochemical J.219(2)：345-373(1984)，所述文献以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。

表1列出了本文所述与InvaderPlus产品标记相关联的序列以及在所附序列表中的对应标识符(SEQ ID NO：)。

表1：InvaderPlus产品标记

表2列出了本文所述与PHM标记相关联的序列以及在所附序列表中的对应标识符(SEQ ID NO：)。

表2：PHM标记序列：扩增子和引物信息

SEQ ID NO：129是被设计用于克隆ID Ct9050c497L12e的L引物。

SEQ ID NO：130是被设计用于克隆ID Ct9050c497L12e的R引物。

SEQ ID NO：131是被设计用于克隆ID Ct9050c064G11d的L引物。

SEQ ID NO：132是被设计用于克隆ID Ct9050c064G11d的R引物。

SEQ ID NO：133是被设计用于克隆ID Ct9050c064G11c的L引物。

SEQ ID NO：134是被设计用于克隆ID Ct9050c064G11c的R引物。

SEQ ID NO：135是被设计用于克隆ID Ct9050b191E02m的L引物。

SEQ ID NO：136是被设计用于克隆ID Ct9050b191E02m的R引物。

SEQ ID NO：137是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：134作为引物以及PHS6Y DNA获得的扩增子序列。

SEQ ID NO：138是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：134作为引物以及PH1JG22DNA获得的扩增子序列。PH1JG22是抗热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：139是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH1FT71 DNA获得的扩增子序列。PH1FT71是抗热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：140是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH1G3H1 DNA获得的扩增子序列。PH1G3H1是抗热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：141是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH1JG01 DNA获得的扩增子序列。PH1JG01是抗热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：142是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PHS7W DNA获得的扩增子序列。PHS7W是抗热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：143是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH7W3DNA获得的扩增子序列。PH7W3是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：144是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH9VF DNA获得的扩增子序列。PH9VF是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：145是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PHBNA DNA获得的扩增子序列。PHBNA是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：146是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH2JR DNA获得的扩增子序列。PH2JR是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：147是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH0TJ DNA获得的扩增子序列。PH0TJ是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：148是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH467DNA获得的扩增子序列。PH467是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：149是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH48F DNA获得的扩增子序列。PH48F是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：150是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH7WC DNA获得的扩增子序列。PH7WC是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：151是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及625DNA获得的扩增子序列。625是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：152是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PHP3P1DNA获得的扩增子序列。PHP3P1是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：153是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PHY7M2DNA获得的扩增子序列。PHY7M2是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：154是使用SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：135作为引物以及PH147G5DNA获得的扩增子序列。PH147G5是易感热带锈病的玉米自交系。

SEQ ID NO：155是PHMTR区域的序列。

SEQ ID NO：156是PHMTR区域的序列，其在SEQ ID NO：155的位点16处无“T”。

SEQ ID NO：157-164是引物C06621-1-K2和C06621-1-K4(表3)的序列。

表3：C06621-1-K2和C06621-1-K4KASP标记信息

SEQ ID NO：165是FAM通用序列。

SEQ ID NO：166是VIC通用序列。

SEQ ID NO：167是Sub23M的参考序列。

发明详述

本发明提供玉米等位基因组合物和鉴定并选择具有提高的热带锈病抗性的玉米植株的方法。等位基因组合物和用于鉴定并反选具有降低的热带锈病抗性的玉米植株的方法也在本发明的范围内。提供以下定义以利于理解本发明。

术语“增强的抗性”、“提高的抗性”或“新赋予的抗性”是可互换的并且指对特定病原体、广谱病原体、或由所述病原体引起的感染的提高水平的抗性。对特定真菌病原体如热带锈病的提高水平的抗性例如形成“增强的”或改善的真菌抗性。本发明的实施方案将增强或改善植株病原真菌的抗性，使得植株对真菌病原体或病原体的抗性将提高，这继而将提高对由所述真菌病原体引起的病害的抗性。术语“增强”指改善、提高、扩增、倍增、提升、增加等。本文中将本发明的植株描述为具有对热带锈病感染的“增强抗性”，这是因为在本发明基因座上的特定等位基因。

显示增强的热带锈病抗性的玉米植株是产量和/或活力或其它相关的农学量度当引入该病害的诱导剂时较少受影响的植株。抗性是一种相对性术语，它指示受感染的植株比另一种进行相似处理的较易感植株的玉米产量更高。即，病症在抗性玉米植株中引起的玉米活力和/或产量的降低小于在易感玉米植株中引起的玉米活力和/或产量的降低。技术人员将会知道玉米植株的热带锈病抗性变化很大，能够表现出较高抗性或较低抗性的表型，并且能够取决于感染严重度而变化。然而通过简单地观察，技术人员能够测定不同植株、植株品系或植株家族对热带锈病的相对抗性或易感性，并且此外也将认识到“抗性”的表型等级。如本领域所用，“抗性”有时称为“一般抗性”、“降低发病率抗性”、或“部分抗性”。

“病害抗性”是植株的一个特性，其中植株避免植株病原体相互作用如玉米-热带锈病相互作用引起的病害症状。即，预防病原体引起植株病害以及相关联的病害症状，或者把由该病原体引起的病害症状最小化或减轻。本领域的技术人员将会知道本文所公开的组合物和方法可与本领域可用的其它组合物和方法一起使用以保护植株免遭病原体侵袭。

如本文所用，“真菌抗性”指在与野生型植株进行比较时对真菌病原体增强的抗性或耐受性。效应可从对真菌病原体效应的耐受性轻微提高(例如部分抑制)到总体抗性使得植株不受存在的真菌病原体影响不等。

本文称为“二倍体”的植株具有两组染色体。

本文称为“双单倍体”的植株通过倍增单倍体染色体组进行生长。认为双单倍体植株是纯合植株。

“优良品系”是源自育种并选择优异农学性能的任何品系。

术语“等位基因”指在特定基因座处存在的两个或更多个不同核苷酸序列的其中一个。

“等位基因频率”指种群内或一组品系内的等位基因的频率(比例或百分比)。技术人员能够通过平均该种群的个体样本的等位基因频率来预测种群内的等位基因频率。

“扩增子”是被扩增的核酸，例如通过使用任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)扩增模板核酸制备的核酸。

在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。典型的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)、以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。

术语“装配”应用于BAC以及它们聚集以形成连续的DNA片段的倾向。BAC基于序列比对“装配”成重叠群，如果BAC进行测序，或者经由它的BAC指纹与其它BAC指纹的比对“装配”成重叠群。可使用因特网上公开可用的Maize Genome Browser找到公开的装配。

当等位基因是DNA序列的一部分或与DNA序列连锁时，或者当等位基因影响性状表达以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“关联”。

“BAC”或细菌人工染色体是来源于大肠杆菌(Escherichia coli)天然存在的F因子的克隆载体。BAC能够接受DNA序列的较大插入序列。在玉米中，已经将许多BAC或细菌人工染色体装配成重叠群(重叠的连续基因片段，或“连续DNA”)，它们每个均包含玉米基因组DNA的较大插入序列。

“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。“供体”亲本指具有将被渗入的期望单个基因/多个基因、单个基因座/多个基因座、或特定表型的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。例如，参见Ragot，M.等人(1995)Marker-assisted backcrossing：a practical example，in Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques，Vol.72，第45-56页，以及Openshaw等人，(1994)Marker-assisted Selection in Backcross Breeding，Analysis of Molecular Marker Data，第41-43页。初始杂交产生F1代；然后术语“BC1”指轮回亲本的第二次使用，“BC2”指轮回亲本的第三次使用等等。

厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。一cM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。

如本文所用，术语“染色体区间”指位于植株单个染色体上的基因组DNA的连续线性区域。位于单个染色体区间内的遗传因子在物理上连锁。不特别限定染色体区间的大小。在一些方面，位于单个染色体区间内的遗传因子在遗传上连锁，遗传重组距离通常为例如小于或等于20cM，或者小于或等于10cM。即，位于单个染色体区间内的两个遗传因子以小于或等于20％或10％的频率进行重组。

“染色体”是包含多个基因的螺旋DNA单片段，所述基因在细胞分裂期间作为一个单位发挥作用并移动，因此可称为连锁的。也可称为“连锁群”。

在本专利申请中短语“紧密连锁的”指两个连锁基因座之间的重组发生频率等于或小于约10％(即，在基因图谱上分开不超过10cM)。换句话说，紧密连锁的基因座在至少90％的情况下共分离。当标记基因座展示与期望性状(例如病原体抗性)显著的共分离(连锁)概率时，它们在本发明中是尤其有用的。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在一些情况下，两个不同的标记可具有相同的基因图谱坐标。在该情况下，两个标记彼此是如此接近以至于它们间的重组频率低至无法检测。

在生物信息学中，“聚类”指将以某种方式连锁的序列分类并常用于制备一组非冗余的代表性序列。所述序列可为基因组、“转录组”(EST)或本质上为蛋白。

术语“互补序列”指与给定核苷酸序列互补的核苷酸序列，即所述序列通过碱基配对原则连锁。

术语“连续DNA”指重叠的连续基因片段。“连续DNA”指未中断的基因组DNA片段，它们由部分重叠的片段或重叠群表示。

当涉及两个遗传因子间的关系时，如一个遗传因子产生抗性和接近的标记，“相引”相连锁指示其中在抗性基因座上的“有利”等位基因物理上与相同染色体链上的对应连锁标记基因座的“有利”等位基因关联的状态。在相引相中，两个有利等位基因均由遗传了该染色体链的子代一起继承。

术语“杂交的”或“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。

本文称为“二倍体”的植株具有两组染色体(基因组)。

本文称为“双单倍体”的植株通过倍增单倍体染色体组进行开发(即，正常染色体数目的一半)。双单倍体植株具有两组相同的染色体，并且认为全部基因座是纯合的。

“优良品系”是源自育种并选择优异农学性能的任何品系。

“外来的玉米株”或“外来的玉米种质”是来源于不属于可利用优良玉米品系或种质株的玉米株的植株或种质。在两个玉米植株或种质株杂交的情况下，外来种质不通过遗传到与它杂交的优良种质中紧密连锁。最常见的是，外来种质不来源于任何已知的优良玉米品系，而是经选择以将新遗传因子(通常新等位基因)导入育种程序。

“有利等位基因”是在特定位点的等位基因，它赋予或导致农学上所期望的表型如对热带锈病的增强抗性并允许鉴定具有农学上所期望表型的植株。标记的“有利等位基因”是与有利表型共分离的标记等位基因。

“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公开的方法，片段可用作杂交探针或PCR引物。

“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体(或连锁群)上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。就每个基因图谱而言，基因座之间的距离通过它们的等位基因在种群中一起出现的频率进行测量(即它们的重组频率)。可使用DNA或蛋白标记或能够观察到的表型检测等位基因。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。不同基因图谱的基因座间的基因距离可不同。然而，使用常见标记能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的位点来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的其它基因座。图谱间的基因座顺序将不发生变化，但是很多情况下标记顺序发生小的改变，这是由于例如标记在不同种群中检测到替代的重复基因座、用于定位标记的统计学方法上的差异、新突变或实验室误差。

“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。

“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。

术语“遗传标记”将指任何类型的核酸基标记，包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、简单重复序列(SSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、酶切扩增多态性序列(CAPS)(Rafalski和Tingey，1993，Trends in Genetics 9：275-280)、扩增片段长度多态性(AFLP)(Vos等人，1995，Nucleic Acids Res.23：4407-4414)、单核苷酸多态性(SNP)(Brookes，1999，Gene 234：177-186)、序列特异性扩增区域(SCAR)(Paran和Michelmore，1993，Theor.Appl.Genet.85：985-993)、序列标签位点(STS)(Onozaki等人，2004，Euphytica 138：255-262)、单链构象多态性(SSCP)(Orita等人，1989，Proc Natl Acad Sci USA 86：2766-2770)、简单重复序列区间(ISSR)(Blair等人，1999，Theor.Appl.Genet.98：780-792)、反转录转座子位点间扩增多态性(IRAP)、反转录转座子微卫星扩增多态性(REMAP)(Kalendar等人，1999，Theor.Appl.Genet.98：704-711)、RNA裂解产物(如Lynx标记)等。

“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。

“基因组”指总DNA或整组基因，由染色体或染色体组携带。

术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的一种或多种等位基因限定，个体已经从其亲本中继承了所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的全部基因的基因组成。

“种质”指个体(例如一个植株)、一组个体(例如一个植株品系、品种或家族)、或来源于一个品系、品种、物种、或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。

“单倍型”是个体在多个基因座上的基因型，即等位基因组合。单倍型描述的基因座通常是物理上和遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。术语“单倍型”可指特定序列如标记基因座的一系列多态性，或者沿多个序列如多个标记基因座的一系列多态性。

“杂种优势群”包含一组基因型，它们在与来自不同杂种优势群的基因型杂交时表现良好(Hallauer等人(1998)，Corn breeding，第463-564页。在G.F.Sprague和J.W.Dudley(ed.)Corn and corn improvement中)。将自交系归类为杂种优势群，并且将其进一步细分为杂种优势群内的家族，所述分类基于若干个标准如家谱、基于分子标记的关联、以及杂交体组合的性能(Smith等人(1990)Theor.Appl.Gen.80：833-840)。美国两个最广泛使用的杂种优势群称为“Iowa Stiff Stalk Synthetic”(BSSS)和“Lancaster”或“Lancaster Sure Crop”(有时称为NSS或非Stiff Stalk)。

术语“杂合子”指其中不同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。

术语“纯合子”指其中相同等位基因位于同源染色体上的对应基因座的基因条件。

术语“杂交体”指至少两个基因相异的亲本间杂交获得的子代。

“杂交”或“核酸杂交”指互补RNA和DNA链配对以及互补DNA单链配对。

术语“杂交”指核酸链的互补区域之间形成碱基对。

“IBM基因图谱”指任何以下图谱：IBM、IBM2、IBM2 neighbors、IBM2 FPC0507、IBM2 2004 neighbors、IBM2 2005 neighbors、或IBM2 2005连续框。IBM基因图谱基于B73x Mo17种群，其中来自初始杂交的子代在构建重组自交系用于作图前随机交配产生多代。较新的版本反映了基因和BAC作图基因座的加入以及由于包含来自其它基因图谱的信息带来的图谱精细度的提高。

术语“自交”指已经进行育种以获得遗传同质性的品系。

术语“插入缺失(indel)”指插入或缺失，其中相对于第二品系可将一个品系称为插入，或者相对于第一品系可将第二品系称为具有缺失。

术语“渗入”指基因座的期望等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的现象。例如在特定基因座的期望等位基因通过渗入、经由相同物种的两个亲本间的有性杂交可被传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。作为另外一种选择，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有期望的等位基因。期望的等位基因可为例如标记的选择等位基因、QTL、转基因等。在任何情况下，能够将包含期望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并选择期望的等位基因以产生固定在选择遗传背景中的等位基因。

当重复“渗入”过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。在渗入或回交中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望单个基因或基因座的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。例如，参见Ragot，M.等人(1995)Marker-assisted backcrossing：a practical example，in Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques，Vol.72，第45-56页，以及Openshaw等人，(1994)Marker-assisted Selection in Backcross Breeding，Analysis of Molecular Marker Data，第41-43页。初始杂交产生F1代；于是术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，以此类推。

如本文所用，术语“连锁”用于描述一个标记基因座与另一个标记基因座或一些其它基因座(例如热带锈病基因座)相关联的程度。分子标记和表型(例如增强的热带锈病抗性)之间的连锁关系用“概率”或“调整概率”表示。连锁可以用期望的限度或范围表达。例如在一些实施方案中，当标记分离距离为小于50、40、30、25、20、或15图谱单位(或cM)时，任何标记与任何其它标记连锁(基因上和物理上)。在一些方面，限定加括号的连锁范围是有利的，例如介于10cM和20cM之间，介于10cM和30cM之间，或者介于10cM和40cM之间。标记与第二基因座的连锁越紧密，标记对第二基因座的指示效果越好。因此，“紧密连锁的基因座”如标记基因座和第二基因座显示10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。因为一cM是显示出1％的重组频率的两个标记之间的距离，任何标记与接近的任何其它标记紧密连锁(基因上和物理上)，例如等于或小于10cM的距离。相同染色体上的两个紧密连锁的标记可被彼此定位于9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更小。

术语“连锁不平衡”指基因座或性状(或者两者都有)非随机地分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以大于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离性状的情况下，产生该性状的基因座彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50％的情况下共分离，例如约51％至约100％的情况。换句话说，共分离的两个标记具有小于50％(并且根据定义，在相同连锁群上分离距离小于50cM)的重组频率。如本文所用，连锁可存在于两个标记或者标记和表型之间。标记基因座可与性状“相关联”(连锁)，例如对热带锈病的抗性。测量分子标记与表型性状的连锁程度，例如分子标记与表型共分离的统计学概率。

连锁不平衡最常见地用量度r²测量，它通过Hill，W.G.和Robertson，A，Theor.Appl.Genet.38：226-231(1968)。当r²＝1时，两个标记基因座间存在完全的LD，意味着标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r²值大1/3指示足够强的LD将被用于作图(Ardlie等人，Nature Reviews Genetics 3：299-309(2002))。因此，当成对标记基因座间的r²值大于或等于0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。

如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机分离。认为显示连锁平衡的标记不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。

“基因座”是基因或标记位于染色体上的位点。

“优势对数(LOD)值”或“LOD评分”(Risch，Science 255：803-804(1992))用于区间作图以描述两个标记基因座之间的连锁程度。两个标记间LOD评分为三指示连锁概率比无连锁的概率高1000倍，而LOD评分为二指示连锁概率比无连锁的概率高100倍。大于或等于二的LOD评分可用于检测连锁。

“玉米”指玉米属(Zea mays L.ssp.mays)植株，也称为玉蜀黍。

术语“玉米植株”包括：整个玉米植株、玉米植株细胞、玉米植株原生质体、可从其中再生玉米植株的玉米植株细胞或玉米组织培养物、玉米植株愈伤组织和玉米植株中的完整玉米植株细胞或玉米植株部分，如玉米种子、玉米芯、玉米花、玉米子叶、玉米叶、玉米茎、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。

“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的 RNA或cDNA)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。

对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记基因座而言是多态的。

“标记辅助选择”(MAS)是基于标记基因型选择个体植株的方法。

“标记辅助反选”是一种通过它将标记基因型用于鉴定植株的方法，所述植株将不被选择，使得它们被从育种程序或种植中除去。

“标记基因座”是物种基因组中的特定染色体位点，其中可存在特定标记。“标记基因座”可用于追踪存在的第二连接基因座，例如编码或有助于表达表型性状的连接的基因座。例如标记基因座能够用于监控等位基因在某一基因座的分离，如基因或QTL，它们与标记基因座在遗传上或在物理上连锁。

“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多连续的核苷酸(“全部或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另外一种选择，在某些方面标记探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性“杂交”或配对时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。

如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。作为另外一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性“杂交”时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。本文所述的一些标记当位于插入缺失区域例如本文所述的非共线区域时也称为杂交标记。这是因为插入区域根据定义是相对无插入序列的植株的多态性。因此，所述标记仅需要指示插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术可用于鉴定此类杂交标记，例如在本文提供的实例中使用SNP技术。

“热带锈病”是由病原体玉米壳锈菌(Physopella zeae(Mains)Cummins&Ramachar)(与Angiopsora zeae Mains同义)引起的病害。该病害特征在于在玉米叶片上形成小的黄色圆形脓疱。这些夏孢子阶段脓疱常常以小群存在并且叶片表皮层覆盖发展中的夏孢子。倒卵球形至椭圆形的夏孢子通过在表皮层中形成的小缝或小孔释放。虽然夏孢子是几乎无色的，它们的释放使得脓疱具有白色或奶油色的外观。一些玉米基因型显示具有较暗颜色(红色至略带紫色的颜色)的脓疱，其与较传统的白色/奶油色夏孢子不同。在夏孢子阶段形成后也可发展成具有水泡状外观的冬孢子阶段。冬孢子(褐色至黑色)可在冬孢子堆内发育，所述冬孢子堆围绕着现有的夏孢子脓疱形成。(Donald G.White，ed.1999.Compendium of corn diseases。第三版，APS Press，ISBN 0-89054-234-1)。

“南方锈病”是由病原体多堆柄锈菌(Puccinia polysora Underw)引起的病害。该病害特征在于主要在叶片上表面上、但是偶尔会在叶片下表面上形成小的黄色圆形脓疱，夏孢子最常见地在靠近叶中脉处形成。这些夏孢子脓疱包含倒卵球形至椭圆形的夏孢子，其颜色通常为橙色至橙红色。脓疱通常为圆形至椭圆形并且在叶片上非常多。这种病原体也可在穗壳、穗柄和叶鞘上形成夏孢子脓疱。已知存在冬孢子阶段，在冬孢子堆中形成暗褐色至黑色的冬孢子，所述冬孢子堆存在于围绕现有夏孢子堆的半圆至圆形内。

“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖和磷酸基组成。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过它们下述的单字母命名法指：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。

表型关系图是基于许多特性的总体相似度、不考虑进化史或特定特性的假定显著性来描绘生物体间的分类学关系的图，通常由计算机产生。

术语“表型”或“表型性状”或“性状”指生物的一个或多个性状。表型能够用肉眼或者本领域已知的任何其它评价手段观察到，例如显微镜法、生物化学分析、或电装置检测分析法。在某些情况下，表型由单个基因或基因座直接控制，即“单基因性状”。在其它情况下，表型是若干个基因的结果。

“系统发育树”是显示不同生物物种或实体间的推断进化关系的图，所述推断基于它们的物理和/或基因特性的相似度和差异。可使用多种方法构建它们，包括但不限于距离-矩阵法如连续法或UPGMA，它们从多重序列比对中计算遗传距离。

基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可辨认的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而与基因图谱相比，界标间的距离是绝对的(例如以碱基对测量的或分离的或重叠的连续基因片段)并且不基于基因重组。

“植株”可为整个植株、其任何部分、或来源于植株的细胞或组织培养物。因此，术语“植株”可指代以下任何一种材料：整个植株、植株部分或器官(例如叶片、茎、根等)、植株组织、种子、植株细胞、和/或子代的相同材料。植株细胞是从植株中获取的细胞或来源于从植株中所获取细胞经培养出的细胞。

“多态性”是DNA中的变型，它过于常见而不仅仅由突变产生。多态性在种群中必须具有至少1％的频率。多态性可以是单核苷酸多态性或SNP、或插入/缺失多态性，所述插入/缺失多态性本文也称为“插入缺失”。

“概率值”或“p值”是表型的特定组合和特定标记等位基因的存在或不存在是否随机的统计学概率。因此，概率评分越低，表型和特性标记将共分离的可能性越大。在某些方面，认为概率评分是“显著的”或“不显著的”。在一些实施方案中，认为随机分离的概率评分为0.05(p＝0.05，或5％的概率)是共分离的显著性指示。然而，可接受的概率可为小于50％(p＝0.5)的任何概率。例如，显著概率可小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01、或小于0.001。

每个“PHM”标记代表当用于扩增特定DNA片段的巢式PCR时的两组引物(外部引物和内部引物)。一组外部引物用于第一轮PCR，之后内部序列用于对第一轮PCR的产物进行第二轮PCR。这提高了反应的特异性。本文所述的全部PHM标记在表2中列出，并且这些引物的退火温度为55℃。

“产品标记”或“生产SNP标记”是已经为高通量目的而开发的标记。开发生产SNP标记以使用PHM标记和巢式PCR分析鉴定特定多态性(参见例如表1中的PHM1192-26-U)。设计生产SNP标记以与Invader Plus

(Third Wave Technologies)平台一起使用。

“参考序列”是用作序列比对基准的限定序列。参考序列通过基因分型在该基因座的多个品系、在序列比对程序中比对核苷酸序列(例如Sequencher)、然后获取比对的共有序列而获得。因此，参考序列鉴定在基因座等位基因中的多态性。参考序列可以不是实际DNA序列的拷贝；然而，设计引物和探针用于基因座中的实际多态性是有用的。

术语“子代”指杂交产生的后代。

“子代植株”从两个植株间的杂交生成。

术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群中)，具有与表型性状的差异表达关联的DNA区域。QTL与基因或引起所讨论的性状的基因紧密连锁。

“顶交测试”是用来源于每个亲本与相同测试者(通常是纯合品系)杂交的子代进行的测试。测试亲本可为自由授粉的品种、杂交品系或自交系。

短语“在严格条件下”指在该条件下探针或多核苷酸将与特定核酸序列杂交，杂交通常在核酸混合物中进行，但是基本上无其它序列。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。

标记的“不利等位基因”是与不利植株表型共分离的标记等位基因，因此提供鉴定能从育种程序或栽培中移除的植株的有益效果。

较长序列具体地在较高温度下杂交。特定序列在限定离子强度、pH的情况下，严格条件通常选择比热解链温度(Tm)低约3-5℃。Tm是(在限定离子强度、pH和核酸浓度的情况下)50％与靶互补的探针平衡杂交到靶序列上(因为存在的靶序列过多，在Tm 50％的探针被平衡占用)的温度。严格条件将是如下那些条件：在pH为7.0-8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如10-50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。就选择性杂交或特异性杂交而言，阳性信号是至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性的严格杂交条件通常是：50％的甲酰胺，5x SSC，和1％的SDS，在42℃下孵育，或者5x SSC，1％的SDS，在65℃下孵育，并用0.2x SSC以及0.1％的SDS在65℃下洗涤。就PCR而言，约36℃的温度是典型的低严格扩增，而退火温度取决于引物长度，其可介于约50℃和65℃之间。决定杂交参数的附加准则在多个参考文献中被提供。

序列比对和百分比同一性可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR

Inc.，Madison，WI)的MEGALIGN

程序。除非另行指出，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989))采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。成对比对和使用Clustal V方法的蛋白序列百分比同一性计算的默认参数是KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗＝5，DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗＝4，DIAGONALSSAVED＝4。在使用Clustal V程序的序列比对后，观看相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性”和“趋异度”值；除非另行指出，本文提供的和申明的百分比同一性和趋异度是以该方式计算。

“Clustal V序列比对方法”对应于Clustal V标记的比对方法(描述于Higgins and Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人(1992)Comput.Appl.Biosci.8：189-191)并存在于LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlign^TM程序中。对于多重比对，默认参数对应于空位罚分＝10和空位长度罚分＝10。成对比对和使用Clustal V方法的蛋白序列百分比同一性计算的默认参数是KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗＝5，DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数是KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗＝4，DIAGONALS SAVED＝4。在使用Clustal V程序的序列比对后，观看相同程序中的“序列距离”表可能获得“百分比同一性”值。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施方案的限制。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施方案，而不旨在进行限制。当在本文和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语包括复数指代。因此，例如术语“一个植株”也包括多个植株；取决于上下文，使用的术语“植株”也可包括该植株遗传相似或相同的子代；使用的术语“核酸”任选地包括该核酸分子的多个拷贝。

热带锈病抗性

热带锈病是由病原体玉米壳锈菌(Physopella zeae)引起的玉米真菌病害。与热带锈病抗性相关联的分子标记和等位基因的鉴定仅基于子代的基因组成进行选择。本文提供了通过评价基因组成(使用分子标记和它们的等位基因进行评价)鉴定并选择具有增强热带锈病抗性的玉米植株的方法。

基因作图

在相当一段时间内已经认识到生物基因组中与特定表型如热带锈病抗性相关联的特定基因座可进行基因作图。有利的是，植株育种人员可使用分子标记通过鉴定标记等位基因鉴定期望的个体，所述标记等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与受关注性状共分离的分子标记或分子标记簇，育种人员能够通过选择合适的分子标记等位基因迅速选择期望的表型(一种称为标记辅助选择或MAS的方法)。育种人员也可使用此类标记通过计算机设计基因型并实施全基因组选择。

本领域熟知的多种方法可用于检测与定量性状如热带锈病抗性共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本原理是检测具有显著不同平均表型的供选择基因型(或等位基因)的标记。因此，比较标记基因座之间的供选择基因型(或等位基因)之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，所述标记与基因型差异具有最大的关联性。

用于检测受关注基因座的两种此类方法是：1)基于种群的关联分析和2)基于家谱的关联分析(或传统的连锁作图)。在基于种群的关联分析中，从具有多个创始者(例如优良育种品系)的已有种群中获取品系。基于种群的关联分析依靠连锁不平衡(LD)的弱化和以下观点：在非结构化的种群中，在如此多代随机交配之后，仅有控制受关注性状的基因和与那些基因紧密连锁的标记之间的关联将保存下来。实际上，大多数已有种群具有种群亚结构。因此，通过把个体分配到种群中，使用得自随机分布于基因组的标记的数据，采用结构关联方法有助于控制种群结构，从而最小化由于单个种群(也称为亚种群)内的种群结构带来的不平衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记基因座上基因型(等位基因)进行比较。显著的标记-性状关联指示标记基因座和涉及该性状表达的一个或多个基因座极为接近。

基于家谱的关联分析(也称为传统的连锁分析)使用相同的原则；然而，LD通过从少量创始者产生种群生成。选择创始者以最大化结构化种群内的多态性水平，并且评价多态性位点与给定表型的共分离水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记-性状关联。一种此类方法是区间作图方法(Lander和Botstein，Genetics 121：185-199(1989)，其中测试沿基因图谱 (1cM的区间)的许多位点中的每一个位点控制受关注性状的基因位于该位点的概率。基因型/表型数据用于计算每个测试位点的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于阈值时，存在控制受关注性状的基因在基因图谱上的该位点的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。

本发明提供证明与热带锈病抗性共分离的分子标记基因座，这通过传统的关联分析(图3)测定。这些标记基因座或附加连锁标记基因座的检测可用于标记辅助的玉米育种程序以产生具有有利增强热带锈病抗性的植株或用于从育种程序或栽培过程中除去具有不利的热带锈病表型的植株。

与热带锈病抗性相关联的标记

本文鉴定了与热带锈病抗性相关联的标记，它们是或者与提高的(增强的)热带锈病抗性或者与降低的热带锈病抗性相关联的标记等位基因。所述方法涉及检测与玉米植株或种质的增强抗性相关联的一种或多种标记等位基因的存在。玉米植株可为杂交体或自交体。

所述标记基因座可选择本文提供的任何标记基因座，包括但不限于SNP产品标记PHM1192-26-U、PHM1192-4-U、C00435-802-U、C00436-801-U、PHM187-7-U、C00423-801-U、PHM5028-24-U、PHM13818-15-U、PHM15721-39-U、PHM15721-180-U、C00441-801-U、C00441-802-U、PHM4370-19-U、PHM731-107-U、C00071-01-U、PHM8249-21-U、C00428-801-U、PHM18427-13-U、PHM9535-10-U、PHM9535-6-U、PHM9535-7-U和PHM4003-13-U；PHM标记PHM15590、PHM13818、PHM1192、PHM187、PHM5028、PHM4370、PHM731和PHM15721；Sub2e、Sub9d、Sub19c、Sub23m、C06621-1-K2和C06621-1-K4、以及与这些标记连锁的任何其它标记。

包含热带锈病抗性基因的区间的物理图谱位置

遗传因子或位于单个染色体上的基因组DNA的连续线性片段上的基因是物理上连锁的。

本发明提供在染色体10区域上的分子标记基因座，所述染色体10区域由PHM15590和PHM15721定位并包括它们，从而表述了包含赋予热带锈病抗性的基因的区域。PHM15590位于BAC c0497L12上，而PHM15721位于b0191E02上。能与介于以下序列之间并包括它们的连续DNA杂交并装配到其上的与热带锈病抗性相关联的任何多核苷酸可用作热带锈病的标记：SEQ ID NO：89(PHM15590的参考序列)、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：89具有95％同一性的核苷酸序列，和SEQ ID NO：96(PHM15721的参考序列或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：96具有95％同一性的核苷酸序列。这个物理区域包括本文显示与热带锈病抗性性状相关联的标记基因座。

图1示出定位B73BAC的物理图谱排列，所述BAC构成介于BACc0497L12和BAC c0352E09之间并包括它们的DNA连续片段。空位(用空白表示)本身不是DNA连续片段中的空位，而是其中基因组定位信息不完全的区域。

连锁关系

连锁的常见量度是性状共分离的频率。其能够以共分离百分比(重组频率)表示，或者以厘摩(cM)表示。cM是基因重组频率的量度单位。一cM等于由于在一代中的交换导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为1％(意味着性状99％的情况下共分离)。因为染色体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，有与重组频率关联的近似物理距离。

标记基因座本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记基因座、根据标准连锁分析进行评价。因此，一cM等于经过单代杂交的标记基因座将与在另一个基因座分离的1％的概率。

一个标记与控制受关注性状的基因连锁越紧密，该标记越会更有效地和更有利地成为期望性状的指示物。紧密连锁的基因座显示约10％或更低，优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内交换频率。在高度优选的实施方案中，相关基因座(例如标记基因座和靶基因座)显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，或更优选的约0.25％或更低的重组频率。因此，所述基因座分开距离为约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座称为彼此“接近”。

尽管特定标记等位基因可显示与热带锈病抗性表型共分离，但重要的是注意到标记基因座不一定是负责表达热带锈病抗性表型的基因或QTL基因座部分。例如不需要标记多核苷酸序列是赋予热带锈病抗性的基因部分(例如基因开放阅读框部分)。在祖先玉米品系中，特定标记等位基因与有利或不利热带锈病抗性表型的关联是由于标记等位基因和创始等位基因之间的最初“相引”相连锁。最后通过反复重组，标记和基因座间的交换事件能够改变这种取向。正是因为这个原因，有利标记等位基因可根据存在于耐受性亲本中的相连锁发生改变，所述耐受性亲本用于制备分离种群。这不改变可使用标记监控表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离种群中认为哪个标记等位基因是有利的。

本文提供的标记可用于预测玉米植株中的热带锈病抗性性状的状态。这包括在任何SNP产品标记PHM1192-26-U、PHM1192-4-U、C00435-802-U、C00436-801-U、PHM187-7-U、C00423-801-U、PHM5028-24-U、PHM13818-15-U、PHM15721-39-U、PHM15721-180-U、C00441-801-U、C00441-802-U、PHM4370-19-U、PHM731-107-U、C00071-01-U、PHM8249-21-U、C00428-801-U、PHM18427-13-U、PHM9535-10-U、PHM9535-6-U、PHM9535-7-U和PHM4003-13-U；PHM标记PHM15590、PHM13818、PHM1192、PHM187、PHM5028、PHM4370、PHM731和PHM15721；以及本文鉴定的其它标记Sub2e、Sub9d、Sub19c、Sub23m、C06621-1-K2和C06621-1-K4的20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、或0.1cM内的任何标记。

染色体区间

本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。扩展此类染色体区间的边界以包含将与控制受关注性状的基因连锁的标记。换句话说，扩展染色体区间使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可用作热带锈病抗性标记。

提供了包含与热带锈病抗性共分离的标记的染色体区间。这些区间位于染色体10上并且可由以下标记限定并包括它们：

(i)PHM15590和PHM9535；

(ii)PHM15590和PHM15721；

(iii)C00441和c00428；

(iv)PHM731和PHM15721；或

(v)c00071和PHM731。

发现位于任何这些区间内的任何标记可用作热带锈病抗性的标记。

染色体区间也可通过与QTL标记连锁(显示与其的连锁不平衡)的标记限定，并且r²是关联性研究中连锁不平衡(LD)的常见量度。例如如果在位于PHM15590和PHM9535区间内的染色体10与非常接近的另一个染色体10标记基因座之间的LD的r²值大于1/3(Ardlie等人，Nature Reviews Genetics 3：299-309(2002))，所述基因座是彼此连锁不平衡的。

标记等位基因和单倍型组合

本发明的标记也可为一个或多个标记基因座上的特定等位基因的组合(即，单倍型)。下述等位基因也可用于单独地或组合地鉴定并选择具有增强热带锈病抗性的玉米植株。

本文已经鉴定了与增强热带锈病抗性相关联的有利等位基因。一个此类等位基因是PHMTR(SEQ ID NO：155)的位点16处的“T”缺失。图7示出通过对热带锈病抗性的和易感的玉米品系的基因分型获得的部分参考序列(顶部)，所述基因分型使用设计用于克隆ID Ct9050c064G11c的PCR引物(SEQ ID NO：133和134)(表9)。SEQ ID NO：137-142示出获取自抗性品系的扩增子，而SEQ ID NO：143-154示出获取自易感品系的扩增子。用灰色突出显示的区域示出参考序列(称为PHMTR；SEQ ID NO：155)的21bp区域。在PHMTR的bp16具有T-缺失的玉米品系(用箭头示出)都显示对热带锈病的提高抗性。具有完整PHMTR区域玉米品系都显示对热带锈病的敏感性。

表7和8也示出使用PHS6Y作为来源，已经成功地组合使用染色体10标记以将易感自交体转化成抗性自交体。PHS6Y在各个标记上具有的等位基因可组合使用(作为单倍型)以鉴定并选择具有增强的热带锈病抗性的植株。

虽然与对热带锈病的增强抗性相关联的单倍型可包含本文所述的任何有利等位基因(包括PHMTR的位点16处的“T”缺失和表7和8中的抗性品系PHS6Y具有的任何标记等位基因)，参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型显示与增强的热带锈病抗性相关联并可用于标记辅助选择程序以选择具有增强的热带锈病抗性的玉米植株。

技术人员将期望可能存在附加的多态性位点，所述位点位于本文鉴定的染色体10标记内部的及其周围的标记基因座上，其中一个或多个多态性位点与单倍型的一个或多个多态性位点上的等位基因连锁不平衡(LD)。在不同多态性位点上的两个特定等位基因据称是LD，如果在其中一个位点上存在等位基因，则易于推测相同染色体上的其它位点上存在等位基因(Stevens，Mol.Diag.4：309-17(1999))。

技术人员将理解一个种质库的等位基因频率(以及由此的单倍型频率)可能与另一个种质库的等位基因频率不同。种质库的不同是由于成熟度差异、杂种优势群、地理分布等。因此，SNP和其它多态性在一些种质库中可能不会提供信息。

标记辅助选择

分子标记可用于多种植株育种应用(如参见Staub等人(1996)Hortscience 31：729-741；Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter.1：3-8)。受关注的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。显示与影响期望表型性状的基因座连锁的分子标记提供了选择植株种群中的性状的有用工具。在其中表型难以测定的情况下(例如多种抗病害性状)或者在植株发育晚期阶段发生的情况下(例如核的特性)尤其如此。因为DNA标记测定更省力并且占用的物理空间比田间表型更少，可测定大得多的种群，提高了找到靶片段从供体品系转移到受体品系的重组的概率。连锁越紧密，标记越有用，因为重组在标记和引起性状的基因间发生的可能性较小，这可导致假阳性。具有侧接标记降低了假阳性选择将发生的概率，因为这将需要双重组事件。理想的情况是基因自身具有一个标记以便在标记和基因间不能发生重组。此类标记称为‘完美标记’。

当基因通过MAS渗入时，不仅引入基因而且引入侧接区域(Gepts.(2002).Crop Sci；42：1780-1790)。这将称为“连锁累赘”。在该情况下其中供体植株与受体植株高度不连锁，这些侧接区域携带可能编码农学上不可取性状的附加基因。这种“连锁累赘”甚至在多轮回交到优良玉米品系后也可能导致产量降低或其它不良农学特性。有时这也称为“产量抑制”。侧接区域的大小可通过附加的回交减小，但是这不总是成功的，因为育种人员无法控制重组断点的区域大小(Young等人(1998)Genetics 120：579-585)。在经典的育种中这通常仅仅是偶然现象：选择的重组有助于减小供体片段的大小(Tanksley等人(1989).Biotechnology 7：257-264)。甚至在20轮这种类型的回交后，技术人员可期望找到仍旧与选择基因连锁的供体染色体的相当大的片段。然而关于标记，选择那些经历过接近受关注基因的重组的罕见个体是可能的。在150个回交植株中，基于单一减数分裂图谱距离，至少一个植株将已经发生过基因1cM内的杂交的概率为95％。标记将允许这些个体的明确鉴定。在一次附加回交的300个植株中，在所述基因另一侧的1cM单一减数分裂图谱距离内发生杂交的概率将为95％，生成围绕基于单一减数分裂图谱距离小于2cM的目标基因的片段。使用标记这可在两代中完成，而不使用标记它将需要平均100代来完成(参见Tanksley等人，同上)。当已知基因的确切位置时，可利用围绕该基因的一系列侧接标记选择不同种群规模的重组。例如，在较小的种群规模中，可期望重组远离该基因，这样将需要较多的远端侧接标记来检测重组。

包含增强密度的公开玉米标记的玉米基因组整合连锁图谱的可用性促进了玉米基因作图和MAS。参见如IBM2 Neighbors图谱，该图谱可在MaizeGDB网站上在线获取。

MAS具体实施的关键部分为：(i)限定种群，在该种群中将确定标记-性状关联，该种群可以是分离种群、或随机或结构化种群；(ii)监控相对于性状的多态性标记的分离或关联，并且使用统计方法确定连锁或关联；(iii)基于统计分析的结果限定一组所期望的标记，以及(iv)将该信息用于和/或外推出当前组育种种质，使基于标记的选择决定得以作出。在这个公开中描述的标记以及其它标记类型如SSR和FLP可用于标记辅助选择规程。

可将SSR定义为串联重复DNA的相对短的片段，其长度为6bp或更少(Tautz(1989)Nucleic Acid Research 17：6463-6471；Wang等人(1994)Theoretical and Applied Genetics，88：1-6)多态性由多个重复单位的变异引起，可能由DNA复制期间的滑动引起(Levinson和Gutman(1987)Mol Biol Evol4：203-221)。重复长度中的变异可通过设计保守非重复侧接区域的PCR引物进行检测(Weber和May(1989)Am J Hum Genet.44：388-396)。SSR非常适于作图和MAS，因为它们是多等位基因的、共显性的、可再现的并适于高通量自动化(Rafalski等人(1996)Generating and using DNA markers in plants.In：Non-mammalian genomic analysis：a practical guide.Academic press，第75-135页)。

可生成多种类型的SSR标记，并且来自抗性品系的SSR特征可通过扩增产物的凝胶电泳获得。基于扩增片段的尺寸给标记基因型评分。玉米的SSR服务可根据合同由DNA Landmarks in Saint-Jean-sur-Richelieu，Quebec，Canada提供。

也可生产多种类型的FLP标记。最常见的是扩增引物用于生成片段长度多态性。此类FLP标记在多个方面类似于SSR标记，不同的是通过引物扩增的区域通常不是高度重复的区域。此外扩增区域或扩增子在种质中将具有足够的可变性，这通常是由于插入或缺失，使得可在多态性个体中识别出通过扩增引物生成的片段，并且已知此类插入缺失在玉米中频繁发生(Bhattramakki等人(2002).Plant Mol Biol 48，539-547；Rafalski(2002b)，同上文)。

SNP标记检测单碱基对核苷酸取代。在全部分子标记类型中，SNP是最丰富的，因此具有提供最高的基因图谱分辨率的潜力(Bhattramakki等人，2002 Plant Molecular Biology 48：539-547)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上以所谓的‘超高-通量’模式进行测定，因为它们不需要大量DNA并且测定的自动化可为直接的。SNP也具有成为相对低成本系统的潜力。这三个因素一起使得SNP在MAS的应用具有高度的吸引力。多个方法可用于SNP基因分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶裂解、微测序和球形编码。此类方法已在以下文献中描述：Gut(2001)Hum Mutat 17，第475-492页；Shi(2001)Clin Chem 47，第164- 172页；Kwok(2000)Pharmacogenomics 1，第95-100页；Bhattramakki和Rafalski(2001)Discovery and application of single nucleotide polymorphism markers in plants.In：R.J.Henry，Ed，Plant Genotyping：The DNA Fingerprinting of Plants，CABI Publishing，Wallingford。多种可商购获得的技术利用这些方法和其它方法检查SNP，包括Masscode.TM.(Qiagen)，Invader.RTM.(Third Wave Technologies)，SnapShot.RTM.(Applied Biosystems)，Taqman.RTM.(Applied Biosystems)，Kbioscience的KASPar测定法和Beadarrays.TM.(Illumina)。

在序列内或跨越连锁序列的许多SNP可一起用于描述任何特定基因型的单倍型(Ching等人(2002)，BMC Genet.3：19pp Gupta等人，2001，Rafalski(2002b)，Plant Science 162：329-333)。单倍型可提供比单个SNP更多的信息并且可更多地描述任何特定的基因型。例如单个SNP可为特定品系的等位基因‘T’或具有增强的热带锈病抗性的品种，但是等位基因‘T’也可发生在轮回亲本利用的玉米育种种群中。在这种情况下，一个单倍型例如一系列位于连锁SNP标记上的等位基因可提供较多的信息。一旦一个独特的单倍型已经被转让给供体的染色体区域，该单倍型可在那个种群或其任何亚群中使用以测定个体是否具有特定基因。参见例如WO2003054229。使用本领域普通技术人员已知的自动化高通量标记检测平台使得这种方法高度有效率并有效。

表2列出的多个引物可容易地用作FLP标记以选择在控制热带锈病抗性的染色体10上的基因座或QTL，这归因于插入/缺失多态性的存在。这些引物也可用于将这些标记转化成SNP或其它结构上类似的或功能上等同的标记(SSR、CAP、插入缺失等)，它们处于相同区域内。Rafalski(2002a)Current opinion in plant biology 5(2)：94-100和Rafalski(2002b)Plant Science 162：329-333描述了一个非常有效的SNP转化方法。使用PCR，所述引物用于扩增来自个体(优选自交体)的DNA片段，所述个体提供了受关注种群中的多样性。PCR产物直接在一个或两个方向上进行测序。所得序列进行比对并且鉴定多态性。所述多态性不限于单核苷酸多态性(SNP)，而是也包括插入缺失、CAP、SSR和VNTR(可变数量的串联重复序列)。具体地，针对本文所述的精细图谱信息，技术人员能够通过这一公开中列出的引物轻易地使用本文提供的信息获得在扩增区域内的附加多态性SNP(以及其它标记)。在所述图谱区域内的标记可杂交到BAC或其它基因组文库上或者与基因组序列进行电子比对以找到在与所述标记相同的近似位置上的新序列。

除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其它类型的分子标记也广泛使用，包括但不限于表达序列标签(EST)、来源于EST序列的SSR标记、随机扩增多态性DNA(RAPD)和其它基于核酸的标记。

在一些情况下，同功酶特征和连锁的形态学特性也可间接用作标记。即使它们不直接检测DNA差异，它们常受特定基因差异的影响。然而，检测DNA变异的标记比同功酶或形态学标记的数量和形态要多的多(Tanksley(1983)Plant Molecular Biology Reporter 1：3-8)。

序列比对或重叠群也可用于寻找本文列出的特定标记的序列上游或下游。这些新序列接近本文所述的标记，它们然后用于发现并开发功能上等同的标记。例如，不同的物理和/或基因图谱与本公开内未描述但位于相似区域内的位置等同标记进行比对。这些图谱可位于玉米物种内，或者甚至位于已经与玉米基因上或物理上比对的其它物种内，例如稻、小麦、大麦或高粱。

MAS通常使用多态性标记，所述标记已经被鉴定为具有与热带锈病抗性共分离的显著可能性的标记。推测此类标记在图谱上接近产生植株热带锈病抗性表型的一个或多个基因，并且认为此类标记是期望性状的指示或标记。测试植株是否在标记中存在期望的等位基因，并且期望在一个或多个基因座上包含期望基因型的植株将期望基因型与期望表型一起转移到它们的子代。

本文提供的标记和区间在MAS中用于选择展示增强的热带锈病抗性的植株。

选择方法可涉及检测在玉米植株或种质中是否存在鉴定的标记等位基因或者与鉴定的标记等位基因连锁并相关联的未知标记等位基因、然后基于检测的等位基因选择玉米植株或种质。本文鉴定的能在MAS中检测到的有利等位基因包括：PHMTR的位点16处的“T”缺失和表7和8中任何通过PHS6Y具有的标记等位基因。此外，有利的单倍型如在参考序列SEQ ID NO：167的337-339位点处的“GAG”单倍型也可用于MAS以将增强的热带锈病抗性导入易感玉米品系或品种。

MAS在玉米的增强热带锈病抗性中的用途

玉米植株育种人员期望所需基因座的组合，例如那些与增强的热带锈病抗性相关联的标记等位基因与高产量以及其它期望性状的基因的组合以开发改善的玉米品种。通过非分子方法(例如玉米植株性状评价)筛选大量样品可能是昂贵的、耗时的、并且不可靠的。当与热带锈病抗性基因座基因连锁时，使用本文所述的多态性标记提供在育种程序中选择具有增强的热带锈病抗性的有效方法。例如标记辅助选择对田间评价具有增强的热带锈病抗性的选择植株的一个优点是MAS能够在一年中的任何时间进行，不受生长季节的限制。此外环境效应很大程度上与标记辅助选择无关。

MAS在植株育种中的另一个用途是辅助通过回交育种恢复轮回亲本基因型。回交育种是将子代与其它的其中一个亲本或亲本品系回交的方法。回交通常用于将来自供体亲本(例如包含增强的热带锈病抗性标记基因座的亲本)的一个或一些基因座渗入来自轮回亲本(例如另外的高产量玉米品系)的其它期望的遗传背景中。回交进行的次数越多，轮回亲本对所得渗入品种的遗传贡献越大。这常常是必需的，因为植株否则可为非期望的，例如因为低产量、低结实率等。与之相反，品种是多次育种程序的结果，它可具有优异的产量、结实率等，仅仅缺乏一个期望性状如热带锈病抗性。

MAS能够提高渗入或回交的效率，上述尝试目的在于将增强的热带锈病抗性导入期望的(通常高产量)背景。在特定标记的标记辅助回交中，例如从供体来源回交到优良的或外来的遗传背景，技术人员在回交子代中选择供体性状，然后重复回交到优良的或外来的品系以重构尽可能多的优良/外来背景的基因组。

多阶段集群方法

可使用多阶段集群方法以指导非随机变异的引物设计。这种方法使用系统发育树和连续比对方法以鉴定包含具有期望性状的品系独有的等位基因变异的独特区域。如果BAC集合中的任何给定序列包含将连锁性状的DNA中的变异，这个变异可被相同BAC内的其它独立的和随机的变异遮蔽/混淆，因此单一比对在目标变异的检测中可能无效。这个方法的第一阶段涉及比对开放：延伸代价比大于10的原始序列。第二阶段包括修剪尾部(噪音)并再比对原始序列，其集群将已经指示BAC包含受关注区域的可能性。随后的阶段由随机等位基因变异的上游或下游修剪组成，即，序列内的等位基因显示跨任何表型的多样性。然后可将UPGMA(非加权配对组算数平均法，Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)应用于所得比对直至表型关系图鉴定具有期望性状或表型的品系独有的集群。然后最终的集群可用于鉴定将用于引物设计以生成性状特异性标记的特定变异。

实施例

以下实施例用于示出但不限于所附权利要求。应当理解本文所述的实施例和实施方案仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明精神或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。

实施例1

对热带锈病和南方锈病增强抗性的表型评价

玉米植株在田间用玉米壳锈菌(Physopella zeae)接种以诱发热带锈病症状。在V10期开始时进行三次接种(每次接种用～500,000孢子每毫升至每公顷总体积为200升)。

基于Itumbiara，Brazil的田间天然感染病症评价玉米植株对南方锈病的增强抗性(病原体多堆柄锈菌(Puccinia polysora))。

热带锈病从植株顶部向植株底部发展，而南方锈病从植株顶部向顶部发展。因此，在相同植株中，可能既观察到热带锈病的症状，又观察到南方锈病的症状。

使用两个系统给田间的R2期(大约在授粉时期后20天)植株评分。第一个系统为标度1至9，其中1＝最易感的，并且9＝最有抗性的，而第二个系统对应于锈菌的修改国际标准标度(Modified International Standard Scale for Rust)(表4)。

表4：热带锈病和南方锈病的评分标度

实施例2

PHS6Y自交种群的开发

使用家谱选择方案在巴西的Itumbiara Research Center开发PHS6Y。从来自PH7W3和CML339间的杂交的F2代中选择单个穗。CML339(Makumbi等人，Combining Ability and Heterosis in Tropical Maize Inbreds under Stress and Optimal Conditions.The ASA-CSSA-SSSA International Annual Meetings(2005年11月6-10日)，Salt Lake City，UT.2005)是具有增强的热带锈病抗性的品系，其获取自International Maize and Wheat Improvement center(CIMMYT)。每个选择的F2穗在下一代种植成F3排。然后种植来自下一代的每个选择F3排的三个穗，并且选择最好的F4排并将种子称为PHS6Y自交体种子。全部选择基于热带锈病抗性表型进行。

实施例3

热带锈病抗性的分离指示单个显性基因负责赋予热带锈病抗性

从易感热带锈病的自交体PH468和在实施例2中鉴定的自交体PHS6Y间的杂交中开发一个F2种群。图2A和2B分别示出了显示PH468x PHS6YF2种群中个体的热带锈病和南方锈病评分的频率分布。每个分布指示3个抗性的分离比率(在1-9的标度上评分≥为5)：1易感的(评分＜5，评分标度1-9)，热带锈病(图2A)和南方锈病(图2B)。

表5示出卡方测试，该测试提供赋予热带锈病抗性的单个显性基因存在的证据，其中在PHS6Y自交体中存在有利基因型。结果也显示单个显性基因赋予南方锈病抗性。然而，基于两个F2种群(其中PHS6Y是亲本)中热带锈病和南方锈病抗性间的基因重组频率，热带锈病和南方锈病赋予抗性的基因似乎是不同的(表6)。

表5：

PH468xPHS6Y F2种群的卡方测试结果

表6示出具有PHS6Y的两个F2种群中的热带锈病和南方锈病抗性间的基因重组频率。对照物是另一个F2种群，其中热带锈病和南方锈病性状也是分离的，但是以一种独立的方式分离。

表6：

具有作为亲本的PHS6Y的两个F2种群中的热带锈病和南方锈病抗性间的基因重组

468＝PH468；S6Y＝PHS6Y；467＝PH467

实施例4

混合区间作图

使用将区间作图与线性回归相结合的混合区间作图方法鉴定玉米染色体区间和与热带锈病抗性相关联的标记。在区间作图方法中(Lander和Botstein，Genetics 121：185-199(1989))，测试沿基因图谱(1cM的区间)的许多位点中的每一个位点上基因或控制受关注性状的QTL位于该位点的概率。基因型/表型数据用于计算每个测试位点的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于阈值(本文阈值为2.5)时，存在基因或QTL位点位于基因图谱上的该位点上的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。

使用Windows QTL Cartographer(该软件的最新版本被用于QTL作图)进行混合区间作图。根据标准QTL作图程序预测基因组的LOD评分(优势对数比率)。

图3示出使用PH468x PHS6Y F2种群的热带锈病抗性的混合区间作图结果。混合区间作图分析检测位于C00441-801和C00428-801标记之间的染色体10(图3)上的强效应QTL。用于混合区间作图的连锁图谱是内源的专有基因图谱(本文称为“PHB”)，其基因距离对应于单个减数分裂的重组部分。在x轴上的标记位点对应于PHB基因图谱。y轴代表LOD评分。

实施例5

来自PHS6Y的热带锈病抗性基因座回交到易感自交系中

选择热带锈病抗性自交系PHS6Y作为回交程序的供体亲本。这个自交系在包含热带锈病基因的染色体10片段内携带有利的等位基因。在初始回交程序中，选择四个自交系(PH9VF、PHDGA、PH467和PH0TJ)用来自PHS6Y的热带锈病抗性基因座转化。

每个自交系(PH9VF、PHDGA、PH467和PH0TJ)均与PHS6Y杂交。在获得每个杂交的F1种子后，随后进行五次回交，其中易感的亲本用作轮回亲本。评价一年两代以加速该过程，一个位于巴西北方的Balsas Winter Nursery，另一个位于Itumbiara Research Center。在第一次回交中，仅仅在Itumbiara中心进行表型选择。在随后的回交中，进行标记辅助选择。回交过程后进行两代自交以固定每个自交体中的抗性等位基因。

在转化每个自交体的过程中使用三个至六个标记(表7)。所述标记在回交2(BC2)代至BC4代中使用，以及用于鉴定BC4F2上携带抗性等位基因的纯合植株。

表7示出用于将来自PHS6Y的抗性基因座渗入自交体PH9VF、PHDGA、PH467和PH0TJ的染色体10上的标记，以及各个易感自交体和PHS6Y之间的多态性。

转化其它自交体以具有来自PHS6Y的热带锈病抗性基因座。如上所述进行相似的转化，不同的是转化使用较多的标记。表8示出用于将来自PHS6Y的抗性基因座渗入18个自交体的染色体10上的标记以及各个易感自交体和PHS6Y之间的多态性。

表7：

用于四个自交体转化的染色体10标记

1＝“A”，2＝“C”，3＝“G”，4＝“T”，5＝“I”或插入，6＝“D”或缺失

表8：

用于八个自交体转化的染色体10标记

实施例6

制备具有增强的热带锈病抗性的杂交体

转化过的自交体用于制备杂交体，并且田间试验结果已经显示在转化过的自交体中具有优异水平的抗性(例如图4)，该水平在用转化自交体制备的杂交体中保持(图5；例如杂交GEID6170295)。

实施例7

基因分型具有热带锈病抗性的玉米品系并鉴定与增强热带锈病抗性相关联的多态性

基因分型具有热带锈病抗性的玉米品系

通过目标基因组的Sanger再测序基因分型抗性品系和易感品系。所述目标是来自热带锈病QTL区域的单拷贝基因组片段的PCR扩增产物，所述QTL区域在图谱上位于染色体10的短臂上。

公开可用的基因组序列用作引物设计的参考。公开序列对应于自交系B73并通过BAC最少覆盖途径方法(在Maize Genome Browser上可用，它在因特网上是公开可用的)。以下定位BAC的克隆已经对受关注的区域作图：c0497l12、c0284b01、c0446l10、c0340m14、c0178k23、c0332e10、c0009k11、c0281e11、c0230k24、b0286c12、c0044b04、c0149n21、c0064g11、c0118o03、b0191e02、c0462j05。而在覆盖途径中的BAC的顺序和取向已经通过指纹法进行测定(Nelson等人，2005.Whole-Genome Validation of High-Information-Content Fingerprinting.Plant Physiology.139：27-38)，在每个克隆内的序列重叠群的顺序和取向尚未被完全测定。对于这个工作，使用BAC重叠的内部信息进一步将2-2.5Mb区域的序列顺序缩小至24个子区域(图6)。

所述序列包括大部分高度重复的DNA，大多数是反转录转座子样序列。使用Cross-match(http://www.phrap.org)，通过遮蔽重复序列从该序列中鉴定并移除多拷贝序列路径。通过BLAST分析进一步鉴定并移除低拷贝序列。

PCR引物初始设计用于扩增在单拷贝路径的270-720-bp的扩增子，所述路径跨越染色体10目标区域内的24个子区域(表9)。使用专有工具基于Primer3(Rozen，S.和Skaletsky，2000，Primer3 on the WWW for general users and forbiologist programmers，Methods Mol Biol.132：365-386.)设计引物组。分别将测序引物M13R(5-GGAAACAGCTATGACCATG)和M13F(5-TGTAAAACGACGGCCAGT)加到L和R引物上作为尾部以利于测序。PCR测定的质量和唯一性通过进行并分析预备PCR以及对来自品系B73和Mo17的对照DNA样品的测序进行验证。玉米-燕麦添加品系扩增用于进一步验证测定。弃去在多个添加品系中产生扩增产物或仅在染色体10玉米-燕麦添加品系中不产生扩增产物的PCR引物。

表9：

设计用于扩增染色体10目标区域中的产物的PCR引物

使用HotStar Taq Polymerase Master Mix(Qiagen)，根据制造商的推荐，采用一些修改对10-30ng DNA进行PCR。总反应体积为10μl并且包含5U HotStar Taq DNA聚合酶，1.5mM MgCl2，200μM dNTP和5pM各种加尾引物。如下进行PCR扩增：1)在95℃下进行15-分钟的初始步骤；2)40个如下循环：95℃30秒，60℃30秒，72℃下1分钟；以及3)在72℃下进行10分钟的最终延伸步骤。通过凝胶电泳确认PCR产物。PCR反应产物的五分之一(2μl)在17μl无菌蒸馏水中稀释并用0.5-0.75μl ExoSAP-IT(USB Corporation)清洁，在37℃下孵育25分钟，然后在80℃下孵育25分钟。

PCR扩增子的双向循环测序使用Big Dye Terminator循环测序规程进行，并且毛细管测序在Applied Biosystems 3730XL DNA分析仪中进行。3-5μl清洁DNA使用M13F和M13R寡核苷酸和BigDye Prism测序试剂盒(ABI；version 3.1)，根据制造商的条件进行测序。在测序循环后，反应产物通过乙醇沉淀进行清洁并在ABI3730xl自动测序仪(ABI)上根据标准规程进行处理。

使用基于Phrap，Phred软件的内部工具装配序列(Ewing等人，1998，Basecalling of automated sequencer traces using phred.I.Accuracy assessment.Genome Research.8：175-185；Ewing and Green，1998，Basecalling of automated sequencer traces using phred.II.Error probabilities.Genome Research.8：186-194)。使用Consed sequence viewer鉴定并标记多态性(单核苷酸和插入-缺失)(Gordon，2003，Viewing and Editing Assembled Sequences Using Consed，in Current Protocols in Bioinformatics，A.D.Baxevanis和D.B.Davison(eds)，New York：John Wiley&Co.，2004，11.2.1-11.2.43)。生成的SNP表、装配组和共有序列用于选择合适的多态性以开发标记。

鉴定与增强的热带锈病抗性相关联的多态性

具有高水平的内部多样性的DNA片段比较可能包含受关注的基因。然而，在这些区域中设计引物可能是困难的，因为引物设计应用具有选择随机变异用于引物设计的趋势。测试多阶段集群方法以指导非随机变异的引物设计。这种方法使用系统发育树和连续比对方法以鉴定包含具有增强的热带锈病抗性的品系独有的等位基因变异的独特区域。这个方法的第一阶段涉及比对开放：延伸代价比大于10的原始序列。第二阶段包括修剪尾部(噪音)。随后的阶段由随机等位基因变异的修剪组成，即，序列内的等位基因显示跨任何表型的多样性。然后可将UPGMA(非加权配对组算数平均法，Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)应用于所得比对直至表型关系图鉴定抗性品系独有的集群。

一个引物对(SEQ ID NO：133和SEQ ID NO：134)产生一个扩增子，其具有参考序列(SEQ ID NO：155)，该序列本文称为PHMTR。显示热带锈病抗性的全部品系包含PHMTR的16bp T-缺失(PHMTR-T区域的序列是 SEQ ID NO：156)，而全部易感热带锈病的玉米品系包含完整的PHMTR区域(SEQ ID NO：155)。

图7示出通过对热带锈病抗性的和易感的玉米品系的基因分型获得的部分参考序列(顶部)，所述基因分型使用设计用于克隆IDCt9050c064G11c的PCR引物(SEQ ID NO：133和134)(表9)。SEQ ID NO：137-142示出获取自抗性品系的扩增子，而SEQ ID NO：143-154示出获取自易感品系的扩增子。用灰色突出显示的区域示出参考序列(SEQ ID NO：155)的21bp区域。

扩增子序列也使用引物SEQ ID NO：135和SEQ ID NO：136(SEQ ID NO：167是这个区域的参考系列)以及八个独立的集获得。表10示出评价集分析的21个品系。发现GAG单倍型(参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339上；参见图8)是全部具有增强热带锈病抗性的品系独有的(表10和图8)。开发两个新的存在/缺失标记，使用kbioscience网站上所述的KASPar测定技术测定这个单倍型，所述存在/缺失标记是C06621-1-K2和C06621-1-K4(表3；SEQ ID NO：157-164)。C06621-1-K2和C06621-1-K4是X/P型标记，其中X指示缺失而P指示存在。P标记检测GAG多态性而X标记检测ADH(一个内部对照基因，它用于显示反应进行)。用C06621-1-K2和C06621-1-K4标记评价十八个品系。进行集分析的全部品系符合两个标记的期望(除了一个具有缺失数据的样品外)。

表10：

具有增强热带锈病抗性的品系中的专用单倍型

多阶段集群方法证明是用于鉴定包含具有增强的热带锈病抗性的品系独有的等位基因变异的独特区域的有效方法，并且这个方法可应用于受关注的任何性状。

实施例8

在标记辅助选择具有增强热带锈病抗性的玉米植株中使用的标记和/或单部型

一组常见标记可用于辅助可用于选择具有增强热带锈病抗性的玉米植株的其它标记的鉴定。表11显示本文鉴定的标记，所述标记限定包含赋予热带锈病抗性的基因的区间。标记在物理图谱顺序上(如图1所示)。也显示了在PHB内部来源的图谱(基于单一减数分裂)和IBM2 neighbors基因图谱(高分辨率B73/Mo17基因图谱)上的标记位点。

表11：

PHB图谱和IBM2Neighbors图谱上的分子标记位点

na＝不适用

侧接受关注基因座的紧密连锁标记可有效地用于选择具有增强的热带锈病抗性的子代植株，所述基因座具有与在该基因座处的抗性等位基因连锁不平衡的等位基因。因此，本文所述的标记如表11中列出的那些、以及与相同染色体片段基因上或物理上连锁的其它标记可用于选择具有增强热带锈病抗性的玉米植株。通常将使用在基因上的侧接区域中的一组这些标记(例如2个或更多个，3个或更多个，4个或更多个，5个或更多个)并在基因下的侧接区域中使用相似的一组标记。任选地也可使用在实际基因和/或基因座内的标记。筛选亲本和它们的子代的这些标记组，并且两个亲本间的多态性标记被用于选择。最接近基因或基因座的多态性标记用于选择基因或基因座，并且较远端的多态性标记用于反选基因或基因座。在一个渗入程序中，这允许选择在较接近多态性标记上的基因或基因座基因型以及选择在较远端多态性标记上的轮回亲本基因型。

单倍型或等位基因的组合也可用于选择育种程序中的植株。单倍型可提供比单个多态性更多的信息并且可更多地描述任何特定基因型。一旦一个独特的单倍型已经被转让给供体的染色体区域，例如在染色体10的短臂上的PHS6Y的单倍型，该单倍型可在那个种群或其任何亚群中使用以测定个体是否具有特定基因。使用本领域普通技术人员已知的自动化高通量标记检测平台使得这种方法高度有效率并有效。本文公开的标记等位基因可单独地或组合地使用以通过使用标记辅助选择来选择具有增强热带锈病抗性的植株。

Claims

1.选择具有增强的热带锈病抗性的玉米植株的方法，包括：

a.在所述玉米植株中检测第一标记等位基因，所述第一标记等位基因与以下序列连锁并关联：

i.PHMTR的位点16处的“T”缺失；或

ii.参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型；以及

b.选择具有所述第一标记等位基因的所述玉米植株。

2.权利要求1的方法，其中在单一减数分裂图谱上，所述第一标记等位基因与PHMTR的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型连锁20cM。

3.权利要求1的方法，其中在单一减数分裂图谱上，所述第一标记等位基因与PHMTR的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型连锁2cM。

4.选择具有增强的热带锈病抗性的玉米植株的方法，包括：

a.在所述玉米植株中检测

i.PHMTR的位点16处的“T”缺失；或

ii.参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型；以及

b.选择具有PHMTR的位点16处的“T”缺失或参考序列SEQ IDNO：167的位点337-339处的“GAG”单倍型的所述玉米植株。

5.鉴定显示增强的热带锈病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在玉米植株中检测标记基因座，其中：

a.将包含全部或部分所述标记基因座或其互补序列的标记探针在严格条件下与所述连续DNA杂交，所述连续DNA介于以下序列之间并包括以下序列：SEQ ID NO：89或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：89具有95％同一性的核苷酸序列、以及SEQ IDNO：96、或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO：96具有95％同一性的核苷酸序列；并且

b.所述标记基因座包含与所述增强的热带锈病抗性相关联的至少一个等位基因。

6.鉴定显示增强的热带锈病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在所述玉米植株的种质中检测标记基因座的等位基因，其中：

a.所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM15590和PHM9535；并且

b.所述等位基因与增强的热带锈病抗性相关联。

7.权利要求6的方法，其中所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM15590和PHM15721。

8.权利要求6的方法，其中所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接C0041和C00428。

9.鉴定显示增强的热带锈病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括在所述玉米植株的种质中检测在一个或多个标记基因座处包含等位基因的单倍型，其中：

a.所述一个或多个标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM15590和PHM9535；并且

b.所述单倍型与增强的热带锈病抗性相关联。

10.权利要求9的方法，其中所述一个或多个标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM15590和PHM15721。

11.权利要求9的方法，其中所述一个或多个标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接C0041和C00428。

12.权利要求9、10、或11的方法，其中所述单倍型包括PHMTR的位点1处的“T”缺失或参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”。

13.选择显示增强的玉米热带锈病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括：

a.获取具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植株，其中所述标记基因座位于包含并侧接PHM15590和PHM9535的染色体区间内，并且所述等位基因与增强的热带锈病抗性相关联；

b.将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交；

c.对子代植株进行所述第一玉米植株的等位基因的评价；以及

d.选择具有所述第一玉米植株的等位基因的子代植株。

14.权利要求13的方法，其中所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM15590和PHM15721。

15.权利要求13的方法，其中所述标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接C0041和C00428。

16.选择显示增强的热带锈病抗性的玉米植株的方法，所述方法包括：

a.获取第一玉米植株，所述第一玉米植株的基因组内包含：

i.PHMTR的位点16处的“T”缺失；或

ii.包含参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”的单倍型；

b.将所述第一玉米植株与第二玉米植株杂交；

c.对子代植株进行PHMTR的位点16处的“T”缺失或包含参考序列SEQ ID NO：167的位点337-339处的“GAG”的单倍型的评价；以及

d.选择具有PHMTR的位点16处的“T”缺失或包含参考序列SEQID NO：167的位点337-339处的“GAG”的单倍型的子代植株。

17.由权利要求5和6-12中任一项的方法鉴定的玉米植株，其中所述植株不是CML339。

18.由权利要求1-4和13-16中任一项的方法选择的玉米植株，其中所述植株不是CML339。

19.鉴定与期望形式的性状相关联的一种或多种等位基因变异的方法，包括：

a.比对原始序列，其中开放：延伸代价比大于10；

b.修剪序列尾部(噪音)；

c.修剪随机等位基因变异；

d.将UPGMA(非加权配对组算数平均法)应用于所得比对；

e.重复步骤c-d，直至表型图鉴定出具有所述期望形式的性状的独特品系簇；以及

f.鉴定与所述期望形式的性状相关联的一种或多种等位基因变异。